基于超高效合相色譜技術的保健食品中肉堿對映體拆分和測定方法研究

張文華，謝 文，侯建波，汪 鵬，徐敦明，姚濱濱，何建敏，嚴穎鵬

（1.杭州海關技術中心，浙江 杭州 310016；2.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 杭州 310016；3.廈門海關技術中心，福建 廈門 361026）

肉堿的化學名稱為β-羥基-γ-三甲胺基丁酸，其分子中含有1 個手性碳原子，有2 個立體異構體：右旋肉堿（D-肉堿）和左旋肉堿（L-肉堿）對映異構體。其中左旋肉堿又稱L-肉堿或卡尼丁，廣泛分布于肝臟器官中，是一種促使脂肪轉化為能量的類氨基酸［1］，同時也是脂肪酸在線粒體內代謝的必需物質，其缺乏可直接導致能量的合成不足，出現(xiàn)易疲勞、肌無力等癥狀。目前，市售保健食品中所用的L-肉堿主要來源于工業(yè)上的化學合成法，但該方法生產的L-肉堿純度通常達不到要求，導致L-肉堿保健品中含有D-肉堿［2］。而D-肉堿不但沒有功效，甚至具有毒性。人攝入D-肉堿，肌肉會受到損害，造成肌無力、肌疼痛、肌萎縮等癥狀［3］。因此，迫切需要建立一種保健食品中L-肉堿的純度分析與含量測定的方法。

目前，L-肉堿的檢測方法主要為分光光度法［4－5］、高效液相色譜法（HPLC）［6－7］、高效液相色譜－串聯(lián)質譜法［5，8－10］等。但上述方法基本是針對L-肉堿進行檢測，而對D-肉堿和L-肉堿2 種對映體的拆分以及L-肉堿純度分析的方法報道較少。翟旭峰［11］和祝偉霞［2］等采用反向高效液相色譜法實現(xiàn)了L-肉堿和D-肉堿的基線分離，但方法存在分析時間長（>20 min）、有機試劑用量大等問題。近年來新推出的超高效合相色譜技術（UPC2）受到了廣泛關注，該技術是將超高效液相色譜（UPLC）與傳統(tǒng)超臨界流體色譜（SFC）的特點相互補充，改進了傳統(tǒng)SFC 的各項硬件［12］，利用超臨界二氧化碳與少量有機溶劑（乙腈、甲醇、異丙醇等）為流動相，能精準調控待測物的保留時間和分離度，提高系統(tǒng)的精密度、穩(wěn)定性和可靠性［13］。研究表明，UPC2技術更適于分析傳統(tǒng)液相色譜難以處理的結構類似物和同分異構體，已被成功應用于三唑類農藥［14］、酚酸類化合物［15］、色素［16］、酚類精油［17］等。目前，UPC2技術應用于肉堿對映體的拆分和含量測定尚未見報道。

為解決上述常規(guī)液相色譜法拆分對映體存在的問題，本研究建立了一種超高效合相色譜拆分肉堿對映體及測定其在保健食品中含量的方法。實驗考察了2 種肉堿對映體標準品衍生產物的穩(wěn)定性，優(yōu)化了保健食品中肉堿對映體的提取方法、衍生條件以及色譜分離條件等，并利用所建立的方法對肉堿外消旋體標準品和市售保健食品進行檢測。該方法具有分析速度快、分離效果好、有機溶劑用量少、靈敏度高等特點，為保健食品中L-肉堿含量與純度的測定提供了參考方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

超高效合相色譜儀（美國沃特世公司）；臺式離心機（美國Thermo 公司）；AE260 電子天平（瑞士Mettler公司）；R215旋轉蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；超純水凈化系統(tǒng)（英國Elga公司）；MS2渦旋混勻器（上海醫(yī)大儀器廠）；氮吹儀（日本東京理化公司）；微孔過濾膜（0.22μm，有機相）。

甲醇、乙腈、無水乙醇（色譜純，西班牙Scharlau 公司）；碳酸氫鈉（廣東光華科技股份有限公司）；氨水（杭州高晶精細化工有限公司）；三氯甲烷、三乙胺（上海凌峰化學試劑有限公司）；氯甲酸丁酯（純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司）；L-丙氨酸-β-萘胺（純度≥98%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；實驗用水為超純水；除特殊說明外，其他試劑均為分析純。

肉堿外消旋體（純度≥98%，美國Sigma 公司）。2 種對映體：L-肉堿（純度為99.0%，德國Dr.E 公司）、D-肉堿（純度為99.8%，美國CATO公司）。

1.2 標準溶液及試劑配制

1.2.1 外消旋體標準溶液肉堿儲備液（1.0 g/L）：分別準確稱取0.01 g（精確至0.1 mg）肉堿外消旋體標準品，用無水乙醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的標準儲備液。

1.2.2 對映體標準溶液2種肉堿對映體儲備液（1.0 g/L）：分別準確稱取0.01 g（精確至0.1 mg）左旋肉堿和右旋肉堿標準品，用無水乙醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的標準儲備液。

2 種肉堿對映體的混合工作溶液：準確吸取一定量的標準溶液，用無水乙醇逐級稀釋成1.00、2.00、4.00、10.00、20.00、40.00 mg/L的混合工作溶液。

1.2.3 衍生試劑溶液及終止液的配制衍生試劑：稱取0.45 gL-丙氨酸-β-萘胺，用乙腈溶解，并定容至100 mL。催化劑Ⅰ：稱取0.50 g 三乙胺，加三氯甲烷混勻并定容至100 mL。催化劑Ⅱ：稱取0.50 g 氯甲酸丁酯，加三氯甲烷混勻并定容至100 mL。反應終止液（50 mmol/L 碳酸氫鈉溶液）：稱取0.42 g 碳酸氫鈉，加水溶解定容至100 mL。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取取20 粒保健品片劑、膠囊劑內容物或顆粒劑，研細，準確稱取1.00 g（精確至0.01 g）樣品置于燒杯中，加入適量無水乙醇，超聲提取20 min，冷卻至室溫后轉移至25 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，取適量定容液至離心管中，高速離心5 min后，所得上清液待衍生。

1.3.2 衍 生取0.5 mL 上清液至離心管中，加入0.5 mL 衍生試劑（4.5 g/LL-丙氨酸-β-萘胺乙腈溶液），渦旋混勻，依次加入0.5 mL 催化劑Ⅰ（5 g/L 三乙胺三氯甲烷溶液）和0.5 mL 催化劑Ⅱ（5 g/L 氯甲酸丁酯三氯甲烷溶液），渦旋混勻3 min，20 ℃衍生化60 min后，加入2 mL反應終止液（50 mmol/L 碳酸氫鈉溶液），渦旋混勻1 min后，5 000 r/min離心5 min。移取上層水相于100 mL圓底燒瓶中，濃縮至近干，向濃縮瓶中加入1 mL無水乙醇，充分渦旋溶解，過0.22μm濾膜于進樣小瓶。

1.4 分析條件

色譜柱：Acquity Trefoil CEL1（3.0 mm × 150 mm，2.5 μm，美國Waters 公司），填料為纖維素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）；流動相：A為超臨界CO2，B為氨水甲醇溶液（1∶99，體積比）。梯度洗脫程序：0～7 min，10% B；7～9 min，10%～28% B；9～12 min，28% B；12～13 min，28%～10% B；13～14 min，10%B。系統(tǒng)背壓：13.8 MPa；流速：1.0 mL/min；進樣量：5μL；柱溫：40 ℃；檢測波長：244 nm。

1.5 標準工作溶液的制備

分別精密移取0.5 mL“1.2.2”中2 種肉堿對映體的混合工作溶液于10 mL 離心管中，按照“1.3.2”方法衍生，制備成質量濃度為0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 mg/L的標準溶液，相當于樣品中含有25、50、100、250、500、1 000 mg/kg的2種肉堿對映體。

2 結果與討論

2.1 提取方法的優(yōu)化

文獻報道中通常采用乙腈［6－7］、無水乙醇［4］、甲醇［10］對肉堿進行提取。本文考察了上述3 種試劑的提取效果，在3 份不含左旋肉堿和右旋肉堿的保健品樣品中添加肉堿對映體混合工作溶液，分別采用上述3種試劑進行提取，按照“1.3.2”方法衍生后上機檢測。結果表明，采用乙腈、無水乙醇、甲醇的平均提取效率分別為13.4%、98.5%、70.3%。因此，實驗采用無水乙醇進行提取。另外，實驗對振蕩和超聲提取方式進行了比較，在2 份空白保健品樣品中添加肉堿對映體混合工作溶液，分別采用振蕩和超聲提取方式進行提取，按照“1.3.2”方法衍生后上機檢測。結果顯示，振蕩提取和超聲提取的平均提取效率分別為54.5%和96.8%，因此選擇超聲提取。同時還考察了超聲提取時間分別為10、20、30、60 min 時的提取效率，在4 份空白保健品樣品中添加肉堿對映體混合工作溶液，超聲提取不同的時間，按照“1.3.2”方法衍生后上機檢測。結果表明超聲提取10 min 時，2種肉堿對映體的平均提取效率為70.0%；延長提取時間至20 min時，平均提取效率為91.0%；超聲提取時間增至30 min和60 min時，平均提取效率分別為91.8%和93.2%，2種肉堿對映體的提取效率并未顯著增加。因此，實驗確定最佳提取條件為超聲提取20 min。

2.2 衍生條件的優(yōu)化

本實驗嘗試用手性色譜柱將L-肉堿和D-肉堿直接分離測定，結果顯示未衍生肉堿的儀器響應較低，分離度差，因此采用手性試劑衍生化法，生成2 種有極性差異且含紫外基團的衍生產物，從而實現(xiàn)2種肉堿對映體衍生產物的分離，該實驗結果與文獻［2，11］報道相符。氯甲酸乙酯［4］、氯甲酸丁酯［18］均可用作衍生反應的催化劑，因氯甲酸乙酯沸點低、毒性較強，且不易購買，故選用氯甲酸丁酯為衍生反應的催化劑。采用0.5 mL 催化劑進行實驗，結果發(fā)現(xiàn)隨著肉堿對映體質量濃度（0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 mg/L）的增加，衍生產物呈線性增加，說明0.5 mL 催化劑對于高濃度的肉堿對映體衍生反應也是完全的，故采用催化劑用量為0.5 mL。

考察了反應溫度（4、20、40、60 ℃）對衍生反應的影響，吸取10 mg/L 肉堿對映體混合工作溶液0.2 mL于離心管中，反應時間為10 min。結果顯示，反應溫度從4 ℃升至20 ℃時，衍生產物逐漸增加；而當反應溫度從20 ℃升至60 ℃時，衍生產物逐漸減少（見圖1）。說明反應溫度為20 ℃時，衍生產物含量最高，因此選擇衍生反應溫度為20 ℃。

圖1 衍生溫度對衍生反應的影響Fig.1 Effects of derivatization temperature on derivative reaction

考察了反應時間（10、30、60、90 min）對衍生反應的影響，吸取10 mg/L 肉堿對映體混合工作溶液0.2 mL于離心管中，反應溫度為20 ℃。結果顯示，隨著反應時間的延長，衍生產物逐漸增加；當反應時間從60 min 增至90 min 時，衍生產物的增加不顯著。因此選擇衍生反應時間為60 min。實驗比較了肉堿對映體衍生反應終止液（即萃取試劑）萃取次數(shù)對回收率的影響。向衍生反應溶液中依次加入2 mL反應終止液進行2 次萃取，結果顯示，相比第1 次萃取的衍生產物，第2 次萃取的2 種肉堿對映體衍生產物增加不明顯，因此實驗采用2 mL衍生反應終止液進行1次萃取。

2.3 分離條件的優(yōu)化

2.3.1 流動相中助溶劑的優(yōu)化UPC2采用超臨界二氧化碳為主要流動相，通常加入少量有機助溶劑調節(jié)流動相的極性，以增強對目標物的溶解能力和洗脫能力。為獲得良好的峰形和分離效果，實驗對有機助溶劑進行了考察。選擇Acquity Trefoil CEL1 手性色譜柱（3.0 mm × 150 mm，2.5 μm），在背壓13.8 MPa、柱溫40 ℃條件下，比較了乙腈、甲醇、異丙醇3 種不同極性的助溶劑對肉堿分離效果的影響。結果顯示，使用上述3種助溶劑時，2種肉堿對映體的分離度均不佳、峰形展寬明顯，但甲醇作為助溶劑的分離度稍好。由于肉堿含有羥基，屬于極性較強的化合物，加入氨水能夠明顯改善2 種肉堿對映體的峰形。進一步考察了不同體積比（0.1∶99.9、0.5∶99.5、1∶99）的氨水甲醇溶液作為助溶劑的分離效果。由圖2可見，隨著氨水含量的增加，2種肉堿對映體的峰形和分離效果得到明顯改善，因此實驗選擇氨水甲醇溶液（1∶99）作為助溶劑。

圖2 不同助溶劑對右旋肉堿和左旋肉堿分離效果的影響Fig.2 Effect of cosolvent on separation of D-carnitine and L-carnitine

2.3.2 系統(tǒng)背壓的選擇UPC2中，系統(tǒng)背壓也是影響分離過程的重要因素，其主要作用是控制二氧化碳在整個操作過程中處于超臨界流體狀態(tài)。由于二氧化碳在溫度超過31 ℃且壓力超過7.38 MPa時才會進入超臨界狀態(tài)。因此本實驗以氨水甲醇溶液（1∶99）作為助溶劑，在柱溫40 ℃條件下，考察了背壓分別為10.3、13.8、17.2、20.7 MPa 時2種肉堿對映體的分離效果。結果顯示，隨著系統(tǒng)背壓升高，目標化合物的保留時間提前。當背壓為10.3 MPa時，左旋肉堿的峰形展寬明顯；背壓升至13.8 MPa時，2種肉堿對映體的峰形良好，且在11 min內實現(xiàn)良好的基線分離；背壓升至17.2 MPa時，2種肉堿對映體的分離度降低；背壓繼續(xù)升至20.7 MPa時，系統(tǒng)出現(xiàn)超壓報警。綜合考慮分離效果和分析速度，實驗選擇最佳系統(tǒng)背壓為13.8 MPa。

2.3.3 色譜柱溫度的選擇在UPC2系統(tǒng)中，色譜柱溫度主要通過影響流動相密度，從而影響目標物的分離效果。一般隨著色譜柱溫度升高，超臨界流體密度變小，溶劑化能力降低，超臨界流體對目標化合物的交換及溶解能力可能減弱，使得目標物的保留時間增大?？紤]到Acquity Trefoil CEL1 手性色譜柱的最高推薦運行溫度為40 ℃，且二氧化碳需在溫度超過31 ℃且壓力超過7.38 MPa 時才會進入超臨界狀態(tài)，因此本實驗在系統(tǒng)背壓為13.8 MPa下，考察了色譜柱溫度分別為31、35、40 ℃時對目標物分離效果的影響。結果顯示，隨著柱溫的升高，2 種肉堿對映體的分離度和色譜峰形均有改善，柱溫為40 ℃時，2種肉堿對映體可實現(xiàn)基線分離。因此，實驗確定最佳色譜柱溫度為40 ℃。

按照上述優(yōu)化的色譜條件進行拆分，如圖3所示，右旋肉堿和左旋肉堿得到良好的分離。

圖3 最佳條件下右旋肉堿和左旋肉堿的分離色譜圖Fig.3 Separation chromatogram of D-carnitine and Lcarnitine under optimal conditions

2.4 穩(wěn)定性的考察

分別準確移取7份0.5 mL的4.00 mg/L肉堿對映體混合工作溶液于7個離心管中，經衍生后轉移至7 個帶鋁蓋密封的進樣小瓶中，用封口膜封好后于－20 ℃下保存，上機檢測前再逐個轉移至UPC2專用進樣小瓶中。按照“1.4”色譜條件測定剛衍生化的以及已衍生化并分別儲存1、3、5、7、14、30、60 d 的肉堿對映體標準溶液，30 d 內D-肉堿、L-肉堿含量的相對標準偏差（RSD）分別為4.4%、3.2%，60 d 內D-肉堿、L-肉堿含量的RSD 分別為10%、8.2%。采用T檢驗法比較剛衍生化與衍生后儲存不同天數(shù)的肉堿對映體含量是否存在顯著性差異。結果顯示，2 種肉堿對映體衍生化后－20 ℃下放置30 d時p>0.05，在統(tǒng)計學上無顯著性差異，表現(xiàn)良好的穩(wěn)定性；－20 ℃下放置60 d時p<0.05，說明2種肉堿對映體衍生化后的溶液在60 d 時具有顯著性差異。結果表明，2 種肉堿對映體標準物質衍生化后的溶液在規(guī)定條件下可保存30 d。

2.5 線性關系與定量下限

將衍生后右旋肉堿和左旋肉堿的系列混合標準溶液按上述色譜條件進行測定。以標準品的峰面積（Y）為縱坐標，對應質量濃度（X，mg/L）為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，2 種肉堿對映體在0.50～20.00 mg/L 質量濃度范圍內呈良好的線性關系，相關系數(shù)（r2）大于0.999。通過在不含肉堿的保健品樣品中添加標準品，按照本方法進行測定，以10 倍信噪比（S/N=10）計算定量下限（LOQ），得到右旋肉堿和左旋肉堿的LOQ均為25 mg/kg。

2.6 準確度與精密度

分別在不含肉堿的固體類和液體類保健食品中添加標準溶液，左旋肉堿和右旋肉堿的加標水平均為25、50、250 mg/kg，平行測定6次，計算加標回收率及RSD。由表1可知，2種肉堿對映體的回收率為86.0%～110%，RSD 為4.3%～7.0%，符合SN/T 0001－2016［19］的要求，說明準確度和精密度能夠滿足不同劑型保健食品的分析要求。

表1 保健食品中2種肉堿對映體的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 1 Spiked recoveries and relative standard deviations of 2 kinds of carnitine enantiomers in health food（n=6）

2.7 方法應用

2.7.1 實際樣品測定應用本方法對10 份市售保健食品中D-肉堿和L-肉堿的含量進行測定，其中片劑保健品5份，膠囊保健品2份，液體保健品3份。結果顯示，10份保健食品中均未檢出D-肉堿，片劑保健品和膠囊保健品中檢出L-肉堿的含量為25.3～270.2 mg/g，液體保健品中L-肉堿的含量分別為144 g/L 和160 g/L，含量均達到標簽值的96%～102%。歐盟規(guī)定L-肉堿的每日限量為1～2 g［20］，中國的L-肉堿用量主要參考歐盟規(guī)定，成人L-肉堿的食用量不應超過2 g/d［21］。所采購的10份L-肉堿保健食品的推薦服用量為0.12～1.8 g/d，均符合歐盟和中國規(guī)定的要求。

2.7.2 外消旋體標準品的拆分應用本方法對所采購的肉堿外消旋體標準品進行拆分及測定。結果顯示，肉堿外消旋體含有D-肉堿和L-肉堿2 種對映體，以兩者的峰面積之和作為100%，計算2 種肉堿對映體的占比，其中D-肉堿占肉堿外消旋體的51.2%，L-肉堿占肉堿外消旋體的48.8%。

3 結 論

本文優(yōu)化了保健食品中肉堿對映體的前處理方法、衍生條件以及色譜分離條件，建立了超高效合相色譜拆分肉堿2種對映體及測定其在保健食品中含量的方法?？疾炝?種肉堿對映體標準品衍生產物的穩(wěn)定性，同時還利用所建立的方法對肉堿外消旋體標準品和市售保健食品進行了測定。研究結果表明，本方法具有分析速度快、分離效果好、靈敏度高、綠色環(huán)保等特點，能夠滿足保健食品中左旋肉堿的快速定量及純度分析需要。