誘導多能干細胞移植后對急性前壁心肌梗死小鼠ST-T改變的影響分析

魏新偉，張曉剛，楊梁

（河南省安陽市人民醫(yī)院 心內一科，河南 安陽 455000）

急性心肌梗死是當今世界上最常見的死亡原因之一，由于誘導多能干細胞（iPSc）的出現(xiàn)為干細胞移植治療缺血性心肌病研究注入了活力。但是iPSc 移植治療心肌受損也是一把雙刃劍，移植后會不會發(fā)生畸胎瘤；其移植后對心肌組織急性缺血損傷有何影響？ST-T 改變是典型急性心肌梗死的基本心電圖變化，并與其病理過程息息相關；前壁急性心肌梗死（AMI）心肌缺血、損傷、壞死的病理過程與ST-T 演變亦相對應。因此，以基本電生理指標ST-T 改變作為本實驗的切入點研究iPSc 移植后對前壁AMI 心肌缺血損傷的影響具有準確、便捷、易測量等優(yōu)點，穩(wěn)定性和重復性亦很好，所以采用ST-T 改變的檢測對AMI 心肌損傷進行研究值得進一步探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

取自由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供癌癥研究機構（Institute of Cancer Research,ICR）品系小鼠：雄性，體重25～30 g，8～12 周，共80 只，于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心飼養(yǎng)。由中國科學院動物研究所北京干細胞庫提供實驗中使用小鼠iPSc 細胞系。

1.2 主要試劑、儀器及iPSc 細胞鑒定、移植前準備

1.2.1 主要試劑 ①培養(yǎng)基采用10%優(yōu)質胎牛血清培養(yǎng)液、緩沖液應用磷酸緩沖液（PBS）液。②免疫組化法采用一抗為：兔抗縫隙連接蛋白43，容量0.2 mL；依次采用二抗為：生物素化羊抗兔免疫球蛋白G（IgG），容量6 mL。

1.2.2 主要儀器 ①體式鏡：XTL-3A 重慶光學儀器有限公司。②電生理儀器：BL-420F 多導電生理儀及生物機能實驗系統(tǒng)，產(chǎn)自成都泰盟科技有限公司。③細胞移植工具：微量進樣器，容量50 μL，產(chǎn)自寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠。

1.2.3 iPSc 細胞鑒定 首先形態(tài)學觀察，其次功能學上用堿性磷酸酶染色進行最后移植前鑒定。

1.2.4 iPSc 細胞移植前的準備 首先采用SD 胎鼠成纖維細胞為飼養(yǎng)層的方法對iPSc 培養(yǎng)，其移植前應用顯微鏡下計數(shù)方法備用。

1.3 動物實驗方法

1.3.1 實驗分組 ①正常對照組（NCG）的設置：在造小鼠動物模型前按照數(shù)字隨機化方法取20 只正常ICR 小鼠依次編號順序為1～20，設為正常對照組，于移植后5 min、1 周、2 周、3 周各時間點取5 只小鼠用于對照；②其他實驗組設置：將造模成功的實驗小鼠按1～45 編號，用完全隨機法分為假手術對照急性心肌梗死+生理鹽水（AMI+NS）組、急性心肌梗死+移植iPS 細胞（AMI+iPSc）組及急性心肌梗死+移植成纖維細胞（AMI+Fb）組，每組15 只小鼠。經(jīng)重慶醫(yī)科大學動物實驗中心倫理委員會批準，實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的標準［1］。

1.3.2 iPSc 移植方法 于小鼠左前降支結扎后30 min內采用微量注射器吸取濃度為2×1012/L iPSc 懸液10 μL，分別以其前壁肉眼可見輕微紫紅色壞死區(qū)中心為圓點按12 點、3 點、6 點、9 點鐘方向選擇4 個點，每點用量2.5 μL 小心緩慢注射入心肌肌層。假手術對照組生理鹽水的注射方法及作為比較的Fb 細胞移植方法均效仿iPSc 進行移植。

1.3.3 造模方法 ①造模的重要步驟：結扎小鼠左冠前降支方法采用8～0 絲線穿過前降支近端以及其下方少量肌束。②造模成功后標準：形態(tài)學上可見小鼠前降支對應供血區(qū)域前壁心肌由紅潤變?yōu)樽霞t色，略顯一點蒼白。體表心電圖基本指標肢體導聯(lián)Ⅰ、加壓肢體導聯(lián)（AVL）的ST 段抬高大于0.1 mV。③術后處理：手術后即刻及術后3 d，肌肉注射青霉素注射液8 萬IU/d 預防感染。

1.3.4 心臟組織學標本采集 模型建立后1 周、2周、3 周時用10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉動物，仰臥位將小鼠固定，氣管插管，開胸暴露心臟。沿結扎縫合線層面以下剪取厚約3 mm 組織，用生理鹽水沖洗干凈，放置于4%的多聚甲醛溶液固定。制作石蠟切片，用于伊紅（HE）染色。

1.4 指標檢測

1.4.1 標本取材 心臟組織學標本采樣于動物模型成功建立后1 周、2 周、3 周各個時間點時采集心肌標本。

1.4.2 各組小鼠心電圖ST-T 改變記錄、測量和分析 采用BL-420 生物機能系統(tǒng)多導電生理儀分階段按時間點檢測體表心電圖I、AVL 肢體導聯(lián)ST-T 演變的變化。

1.4.3 酶免疫組化法檢測小鼠心肌組織縫隙連接蛋白（Cx43）的表達 AMI+NS 組、AMI+iPSc 組、AMI+Fb組等各組小鼠分別于模型建立后即刻、iPSc及Fb 移植后1 周、2 周、3 周各個時間點進行心電圖ST-T 改變檢測后迅速開胸切取心臟梗死區(qū)心肌組織，采用免疫組化Image-Pro Plus 圖像數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對比分析并計算出平均光密度值（mean density）。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 16.0 軟件對本實驗采集數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，iPSc 移植后各小組ST-T 改變指標應用單因素方差分析（ANOVA）進行多組間比較分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 造模前后心電圖、iPSc 及成纖維細胞（Fb）移植前后ST-T 比較

造模前正常對照組及假手術對照（AMI+NS）組小鼠造模后特征心電圖改變，見圖1、圖2。假手術對照組小鼠造模后即刻的ST 段壓低及T 波倒置與NCG 組小鼠比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。iPSc 移植后梗死小鼠ST-T 變化的對比，iPSc 組于移植后2 周ST 壓低、T 波倒置分別與假手術對照組心梗造模后即刻ST 壓低、T 波倒置比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與iPSc 移植后2 周ST 段壓低及T 波倒置指標改善效果相比較，AMI+Fb 組則無此效果。iPSc 及Fb 移植后對急性前壁心肌梗死小鼠ST-T 演變比較，見表1。

圖1 造模前正常對照組小鼠心電圖

圖2 假手術對照組造模后小鼠特征心電圖改變

表1 iPSc 及Fb 移植后對急性前壁心肌梗死小鼠ST-T 演變比較（±s,mV）

表1 iPSc 及Fb 移植后對急性前壁心肌梗死小鼠ST-T 演變比較（±s,mV）

注：?與移植前比較，P＜0.05。

2.2 iPSc 移植前后對ST-T 變化的影響

iPSc 移植前（造模后）即刻即開始了急性前壁心肌梗死小鼠缺血壞死的病理過程。ST-T 動態(tài)改變是反映心肌缺血的重要指標。通過對iPSc 及Fb 移植后2 周ST 段壓低及T 波倒置的檢測、對比發(fā)現(xiàn)，iPSc 移植后2 周對急性前壁心肌梗死小鼠缺血狀況有所改善。iPSc 移植后與移植前（造模后）即刻及假手術對照組小鼠的ST 段壓低及T波倒置的演變比較，見表2。

表2 iPSc 細胞移植前后AMI 小鼠ST-T 演變一覽表（±s,mV）

表2 iPSc 細胞移植前后AMI 小鼠ST-T 演變一覽表（±s,mV）

注：?表示與移植前比較，P＜0.05。

2.3 iPSc 移植后及Fb 移植后各個時間點ST-T變化比較

iPSc 移植后2 周ST 壓低、T 波倒置分別與移植前（造模后）即刻ST 壓低、T 波倒置及假手術對照組2 周ST 壓低、T 波倒置相比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。而Fb 移植后1 周及3 周分別與前者及后者相同時間點比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。

表3 iPSc 細胞移植后與假手術對照組的指標變化比較（n=20,±s,mV）

表3 iPSc 細胞移植后與假手術對照組的指標變化比較（n=20,±s,mV）

注：?iPSc 移植后2 周與假手術對照組比較，P＜0.05。

表4 Fb 細胞移植后與假手術對照組的指標變化比較（n=20,±s,mV）

表4 Fb 細胞移植后與假手術對照組的指標變化比較（n=20,±s,mV）

2.4 iPSc 移植后及Fb 移植后Cx43 的表達

iPSc 移植后梗死小鼠心肌Cx43 的表達iPSc 組及假手術對照組比較，前者的測定值高于后者的測定值，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與此同時AMI+Fb 組Cx43 的表達與假手術對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖3 AMI+iPSc 組小鼠移植后2 周發(fā)生的ST-T 改變

3 討論

急性心肌梗死是由于冠脈血流急劇減少或中斷進而部分心肌發(fā)生急性壞死。干細胞移植治療缺血性心臟病研究一直是該領域得到廣泛關注的研究熱點問題。日本科學家YAMANAKA 于2006年成功誘導多潛能干細胞（iPSc）引發(fā)了新的研究熱潮［2］。隨即iPSc 在移植治療急性心肌梗死方面的研究引爆了能量。然而該研究亦是一把雙刃劍，具有兩面性，如：移植后會不會發(fā)生室壁瘤？其次是移植后對急性心肌梗死小鼠缺血損傷有無改善？ST-T 改變是反應急性心肌梗死（AMI）心肌急性缺血損傷特征性心電圖演變。采用ST-T 改變作為觀察指標，研究iPSc 移植對急性前壁AMI 小鼠急性心肌缺血損傷的影響為解答這些問題提供了強有力的依據(jù)。

作為外源性物質的iPSc 移植首先遭到質疑是能否導致宿主發(fā)生畸胎瘤。新近研究由人類誘導的多能干細胞分化出的神經(jīng)干細胞或祖細胞在移植治療脊髓損傷的致腫瘤作用可被單純皰疹病毒胸苷激酶防止形成［3］。人類誘導的多能干細胞分化成心肌細胞及間充質細胞在急性心肌梗死中作用比較中均未發(fā)現(xiàn)致畸胎瘤現(xiàn)象進一步證實了這一點。其次就是其移植后所形成的干細胞異化細胞電生理學不穩(wěn)定，具有混雜性［4］。但iPSc 移植后可明顯改善心肌急性缺血損傷基本指標ST 段壓低、T 波倒置，其原因分析如下。

心電圖ST-T 改變主要反映的是心肌細胞的復極過程，Cx43 是構成心臟電生理結構縫隙連接的主要組成部分，其主要反映心肌細胞活化的電耦聯(lián)活動。AMI 時心肌細胞受到嚴重損傷，進而Cx43 表達異常，對心肌細胞的電活性及其復極化過程產(chǎn)生嚴重影響，最終引起心臟電重構。首先分析iPSc 移植后對受損心臟心肌重構影響：從受損心肌整體上看，有研究發(fā)現(xiàn)iPSc 移植后從形態(tài)學觀察上心肌受損部位再生組織，進而阻止受損心肌功能損傷進程，恢復缺血心臟功能［5］。而Fb細胞移植后則無此功效。再者從受損心肌重構微觀上分析：分別從iPSc 移植的有效性、定向性、融合性各方面分別來闡述：iPSc 移植的有效性是首先關注的熱點問題之一。新生小鼠大腦移植了來源于人iPSc 的小膠質細胞后會分化呈現(xiàn)出初級小膠質樣狀態(tài)，對其移植的有效性給予了很好的證明［6］。在心肌微循環(huán)中利用iPSc 發(fā)揮作用的小血管角度設計小鼠心肌薄片分化為心肌細胞并對AMI 小鼠心肌組織產(chǎn)生功能影響，提高心肌梗死邊緣帶微血管密度，穩(wěn)定梗死面積［7］。以上兩項研究充分證明iPSc 來源的細胞移植后不僅有效，而且可以改善受損心肌細胞的功能。iPSc 移植的定向性研究是熱點問題，更是難點問題。各個領域均有發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)自人類iPSc 細胞不是向臆想中的腎上腺細胞分化，反而分化為分泌雄激素的間質細胞，成為印證iPSc 分化定向性的研究亮點［8］；取自于人類iPSc 分化的耳源上皮祖細胞移植可使老鼠的聽覺缺失障礙得到明顯改善［9］更充分證明了其移植后定向性分化的問題。來自血液學方面發(fā)現(xiàn)多能干細胞可來源于人外周血單核細胞，對iPSc 正向分化充分性研究得到證實；但其也可定向分化成樹突狀細胞和單核細胞，從而對其逆向必要性研究也得到了進一步證實［10］。最后是其移植后融合性方面研究：iPSc 來源的外泌體在心力衰竭的精準治療為其移植后組織及細胞相融性提供了非常有力的依據(jù)［11］。

再者分析iPSc 移植后對受損心臟電重構影響：Cx43 發(fā)生重構，必然會引起心肌細胞的電耦聯(lián)障礙，導致急性心肌細胞損傷［12］。Cx43 表達增加可能是iPSc 移植后增加電活動穩(wěn)定性主要原因之一。iPSc 移植后不僅可改善小鼠急性心肌梗死受損心肌的電重構而且增強了其電位穩(wěn)定性，從電生理角度為心電圖ST-T 改變提供了直接依據(jù)。

iPSc 移植后改善基本電生理指標ST-T 主要機制是其旁分泌作用。新近研究證實旁分泌是iPSc移植后修復受損心肌組織發(fā)揮作用主要方式，其作用機制將成為今后研究的重點方向［13］。但其作用因子及時間怎樣發(fā)揮作用還不清楚。其正向調整作用表現(xiàn)在對心肌細胞效應持續(xù)時間正向調整作用，而心肌細胞亦可改善存活iPSc 離子通道功能從反方面亦很好的證實了旁分泌發(fā)揮的重用作用［14］，進而改善急性缺血損傷心肌細胞的功能。新的研究顯示誘導多能干細胞移植后對帕金森患者的有益影響及早期的臨床應用從神經(jīng)學方面再次證實了該移植細胞的有效作用［15］。iPSc 移植后2 周ST 壓低、T 波倒置分別與移植前（造模后）即刻及假手術對照組2 周比較均有統(tǒng)計學意義；而移植后1 周及3 周分別與前者及后者相同時間點比較均無統(tǒng)計學意義。心電圖ST-T 改善的這個時間節(jié)點為旁分泌作用產(chǎn)生一系列細胞調節(jié)因子，包括血管內皮生長因子（VEGF）、基質細胞衍生因子-1（SDF-1）、肝細胞生長因子（HGF）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）及以上諸多因子在心肌修復方面發(fā)揮基礎作用［16］的研究提供了很好的路標指引。同時心電圖ST-T 指標改善為iPSc 移植后通過旁分泌產(chǎn)生的這些因子可增強急性缺血損傷心肌細胞電位穩(wěn)定性、改善并修復其功能提供了新的證據(jù)。

但iPSc 移植治療缺血性心肌病臨床應用之路還很漫長，有許多技術難題亟待解決：如為其臨床應用提供最佳的種子細胞；研究外膜細胞移動至不同組織進而促進血管再生的旁分泌作用機制等。iPSc 移植對受損心肌重構及電重構的影響，進而改善其血供機制還需要進一步臨床試驗印證。