富血小板血漿對(duì)肩袖損傷后脂肪浸潤干預(yù)作用的研究

趙晨 胡勁濤 張瓊 賁定嚴(yán)

肩袖損傷是引起肩關(guān)節(jié)持續(xù)疼痛的主要原因，在所有人群中發(fā)生率為5%～33%，而在年齡＞60歲人群中發(fā)生率高達(dá)25%[1]。盡管有相當(dāng)多的患者肩袖損傷無臨床表現(xiàn)，但其中部分患者會(huì)逐漸出現(xiàn)癥狀。肩袖損傷后會(huì)出現(xiàn)相關(guān)肌肉的萎縮、纖維化和脂肪浸潤等病理改變，這些肌肉中成脂指標(biāo)[CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 β（CCAAT/enhancer binding protein beta,C/EBPβ）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptors γ,PPARγ）]表達(dá)水平增高，并且伴有脂肪浸潤的肩袖損傷患者在手術(shù)修復(fù)后肩關(guān)節(jié)功能恢復(fù)較差，且更容易出現(xiàn)肩袖再撕裂[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)即使修復(fù)肩袖仍不能阻止脂肪浸潤的進(jìn)展，因此有效控制和治療肩袖損傷后脂肪浸潤將有利于提高肩袖手術(shù)修復(fù)的臨床療效[4]。富血小板血漿（plateletrich plasma,PRP）是血液離心后獲得的血小板和各種生長因子的濃縮物，具有促進(jìn)組織修復(fù)的能力[5-6]。本研究擬探討PRP對(duì)肩袖損傷模型大鼠脂肪浸潤的干預(yù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠30只，體重200～230 g，購自上海西普爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006，在溫度（22±2）℃、濕度40%～60%、晝夜各12 h的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)浙江省人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 試劑 磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）、絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（mammalian target of rapamycin,mTOR）、C/EBPβ、PPARγ抗體（英國Abcam公司）。SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒（美國MCE公司）、TRIzol試劑（美國Life Technologies公司）、RIPA裂解液（美侖生物科技有限公司）。

1.3 分組及造模 將30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、PRP組，每組10只。3組大鼠均右側(cè)肩關(guān)節(jié)造模，左側(cè)為健側(cè)。假手術(shù)組僅予以切開皮膚，暴露肩袖組織后縫合，于岡上肌多部位肌肉內(nèi)注射0.9%氯化鈉注射液0.5 ml，每2 d注射1次；模型組和PRP組暴露肩袖后予以切斷岡上肌肌腱，然后縫合皮膚。模型組于岡上肌多部位肌肉內(nèi)注射0.9%氯化鈉注射液0.5 ml，每2 d注射1次；PRP組于岡上肌多部位肌肉內(nèi)注射PRP 0.5 ml，每2 d注射1次。3組大鼠均干預(yù)4周。

1.4 標(biāo)本收集及指標(biāo)檢測 所有大鼠均在造模8周后采用CO2窒息方式處死，以尖刀片分離獲取岡上肌。

1.4.1 肌肉濕重比 將新鮮獲取的健側(cè)及造模側(cè)岡上肌進(jìn)行稱重，肌肉濕重比=造模側(cè)肌肉濕重/健側(cè)肌肉濕重×100%。

1.4.2 造模側(cè)岡上肌病理組織學(xué)觀察 將岡上肌組織固定于10%甲醛溶液中，石蠟包埋后制作成2 μm厚切片，采用油紅O染色觀察岡上肌組織中脂肪形成情況。隨機(jī)選取岡上肌中腹部5個(gè)區(qū)域，采用Image J軟件計(jì)算每個(gè)區(qū)域內(nèi)20根肌纖維的橫截面積，取其平均值。

1.4.3 造模側(cè)岡上肌 PI3K、Akt、mTOR、C/EBPβ、PPARγ mRNA表達(dá)水平檢測 采用qRT-PCR法。取100 mg造模側(cè)岡上肌剪碎后，加入10倍體積的TRIzol裂解液，于勻漿機(jī)充分勻漿裂解后提取總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用PI3K、Akt、mTOR、C/EBPβ、PPARγ、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyc-eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）引物進(jìn)行 qRT-PCR 檢測，配置 10 μl反應(yīng)體系[5 μl SYBR Master mix（2×）、0.2 μl 10 μM 上游引物、0.2 μl 10 μM下游引物、1 μl cDNA、3.6 μl ddH2O]，按熱啟動(dòng)（95 ℃5～10 min）、變形（95 ℃ 15 s）和退火延伸（60 ℃ 30 s）40個(gè)循環(huán)、延伸（95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s）1個(gè)循環(huán)，以2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.4 造模側(cè)岡上肌 PI3K、Akt、mTOR、C/EBPβ、PPARγ蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。取100 mg造模側(cè)岡上肌剪碎后，加入岡上肌組織10倍體積的RIPA裂解液，于勻漿機(jī)充分勻漿裂解后提取總蛋白，測定蛋白濃度后進(jìn)行電泳轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂牛奶封閉2 h，去除封閉液加入1:1 000比例稀釋的一抗（PI3K、Akt、mTOR、C/EBPβ、PPARγ、GAPDH），于 4 ℃搖床下孵育過夜，第2天去除一抗后進(jìn)行二抗孵育，完成后加入ECL顯影液在Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠岡上肌肌肉濕重比比較 造模8周后，模型組、PRP組、假手術(shù)組大鼠岡上肌肌肉濕重比分別為（67.93±6.70）%、（84.03±3.45）%、（97.47±2.90）%。模型組大鼠岡上肌肌肉濕重比小于假手術(shù)組和PRP組（均P＜0.01），PRP組大鼠岡上肌肌肉濕重比大于假手術(shù)組（P＜0.05）。

2.2 3組大鼠岡上肌病理切片脂肪浸潤情況和肌纖維橫截面積比較 模型組大鼠岡上肌中脂滴形成較假手術(shù)組明顯增多，且肌肉組織出現(xiàn)萎縮；PRP組岡上肌中脂滴形成數(shù)量較模型組明顯減少，且肌肉組織萎縮程度也較輕，見圖1（插頁）。模型組、PRP組、假手術(shù)組大鼠肌纖維橫截面積分別為（1 064.33±76.81）、（1 767.33±85.05）、（2 118.00±266.28）cm2。模型組大鼠肌纖維橫截面積小于假手術(shù)組和PRP組（均P＜0.01），PRP組肌纖維橫截面積大于假手術(shù)組（P＜0.01）。

圖1 3組大鼠岡上肌組織病理檢查所見[a：假手術(shù)組；b：模型組；c：富血小板血漿（PRP）組；油紅O染色，×100]

2.3 3組大鼠C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 模型組大鼠C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組（均P＜0.05），提示肩袖損傷后岡上肌中脂肪分化水平升高；而PRP組大鼠C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于模型組（均P＜0.05），表明PRP可以起到抑制肩袖損傷后肩袖肌肉組織脂肪分化的作用，見圖2和表2。

2.4 3組大鼠 PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 模型組大鼠PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組（均P＜0.05），提示肩袖損傷后岡上肌中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被激活；而PRP組大鼠 PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于模型組（均 P＜0.05），PI3K、Akt、mTOR mRNA 及蛋白表達(dá)的趨勢與成脂指標(biāo)一致，提示PRP可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，從而抑制肩袖損傷后肩袖肌肉組織中脂肪分化，見圖3和表3～4。

表3 3組大鼠PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)水平比較

圖3 3組大鼠磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（mTOR）mRNA及蛋白表達(dá)水平比較（a：3組大鼠 PI3K、Akt、mTOR mRNA 表達(dá)水平比較；b：3組大鼠 PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)的電泳圖；c：3組大鼠 PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)水平比較；PRP為富血小板血漿；*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

肩袖損傷后相應(yīng)肌肉的脂肪浸潤是肩袖肌肉組織中出現(xiàn)異位脂肪的形成，盡管大量研究者們對(duì)肩袖損傷后脂肪浸潤的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探索，但其具體的作用機(jī)制仍未被闡明。目前認(rèn)為年齡、肌肉損傷、機(jī)械失負(fù)荷、激素失衡等是引起肌肉組織中異位脂肪形成的重要原因，肌肉組織中的多能干細(xì)胞或前體細(xì)胞在脂肪形成信號(hào)通路激活后向脂肪細(xì)胞分化是其潛在的分子機(jī)制[7-8]。

表4 3組大鼠PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)水平比較

RP是自體血在離心后獲得的血小板濃縮血漿，血小板是由巨核細(xì)胞釋放的無核細(xì)胞碎片，包含各種生長因子、細(xì)胞因子、ATP、鈣離子、5-羥色胺、多巴胺等多種物質(zhì)，對(duì)維持組織穩(wěn)態(tài)具有重要作用，在臨床上PRP已被廣泛應(yīng)用于治療各種軟組織疾患[9-10]。Fitzpatrick等[11]應(yīng)用PRP治療慢性臀肌腱病，結(jié)果顯示PRP能明顯減輕患者的疼痛癥狀，改善臀部肌肉功能。一項(xiàng)關(guān)于PRP治療肩袖相關(guān)疾病的Meta分析表明，PRP能提高患者短期和長期的肩關(guān)節(jié)功能，而且還可以減少肩袖損傷修復(fù)后再撕裂的發(fā)生[12]。PRP對(duì)組織穩(wěn)態(tài)的維持和修復(fù)能力很可能與其能夠調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞的分化，從而維持組織完整結(jié)構(gòu)有關(guān)。Liao等[13]應(yīng)用不同濃度的PRP干預(yù)脂肪干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PRP能夠顯著促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)抑制了脂肪干細(xì)胞向成脂的分化。另一項(xiàng)研究觀察了不同PRP濃度對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）分化的影響，結(jié)果顯示PRP血小板濃度＞1 500×109pl/L可以顯著增加MSCs的增殖，低血小板濃度僅有輕微促進(jìn)MSCs成脂分化的作用，而在血小板濃度＞1 800×109pl/L時(shí)促進(jìn)成脂分化的作用顯著，血小板濃度在（200～3 000）×109pl/L可以促進(jìn)MSCs向成骨分化，（1 000～3 000）×109pl/L能夠促進(jìn)MSCs向成軟骨分化[14]。因此，PRP很可能通過調(diào)節(jié)肩袖肌肉組織中細(xì)胞的分化起到預(yù)防肩袖損傷后脂肪浸潤發(fā)生的作用。本研究應(yīng)用PRP干預(yù)肩袖損傷模型大鼠的岡上肌，發(fā)現(xiàn)PRP治療后大鼠岡上肌中脂滴的形成明顯減少，模型組中反映脂肪形成指標(biāo)的C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，而PRP干預(yù)過的岡上肌中C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表達(dá)水平相比模型組有明顯下降，這表明PRP能夠有效阻止肩袖損傷后脂肪浸潤的發(fā)生。Takase等[15]的研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似，他們同時(shí)進(jìn)行了體內(nèi)和體外研究，體外研究顯示PRP促進(jìn)了C2C12細(xì)胞（小鼠成肌細(xì)胞）的增殖，而抑制了其成脂分化潛能；體內(nèi)研究顯示PRP明顯減少了肩袖肌肉組織中脂滴的形成，組織內(nèi)成脂相關(guān)基因被抑制。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路之一，通過調(diào)節(jié)下游相關(guān)靶蛋白的活化狀態(tài)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化及蛋白質(zhì)合成，其在脂肪形成過程中具有重要意義[16-17]。Joshi等[18]發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可以通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子PPAR調(diào)節(jié)肩袖組織內(nèi)脂肪浸潤的發(fā)生，而PPAR和C/EBPβ參與了MSCs分化為脂肪前期細(xì)胞的過程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肩袖損傷模型大鼠岡上肌中PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組升高，這表明肩袖損傷會(huì)激活肩袖肌肉組織中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，從而促進(jìn)肩袖肌肉組織內(nèi)脂肪的形成；而在PRP干預(yù)后，PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低，岡上肌中脂肪的形成也相應(yīng)減少，這表明PRP能夠抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，減少肩袖肌肉組織內(nèi)脂肪分化。

綜上所述，本研究結(jié)果表明PRP能夠通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，減少肩袖損傷后脂肪浸潤的發(fā)生。