新型口腔細(xì)菌絲氨酸蛋白酶抑制劑Tannerpin的制備與結(jié)晶

楊婷婷，許佳偉，周愛(ài)武，葉 瑋

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔預(yù)防科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國(guó)家口腔醫(yī)學(xué)中心，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200011；2.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)，珠海 519040；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，上海 200025

絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitor，Serpin）是一類具有相似三維空間結(jié)構(gòu)的蛋白酶抑制劑，廣泛存在于各種生命物種中，包括動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌、古生菌以及一些病毒［1］?？s寫詞Serpin是基于首先發(fā)現(xiàn)的該類蛋白具有抑制胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性而得名［2］。研究［3-4］顯示，多數(shù)Serpin由350～400個(gè)氨基酸組成，且該家族成員之間的序列同源性不高（大約為25%）。典型的Serpin由蛋白主體和反應(yīng)中心環(huán)（reactive center loop，RCL）組成。其中，蛋白主體結(jié)構(gòu)具有高度保守性，通常包括3個(gè)β折疊（A、B、C）和8～9個(gè)α螺旋（hA～hI）［5］；RCL包含了能被靶蛋白酶的底物結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別的氨基酸（即活性中心P1）［6］，該氨基酸為Serpin的抑制專一性位點(diǎn)，如位點(diǎn)發(fā)生突變則可能會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生［7］。Serpin可分為抑制型和非抑制型［8］。大多數(shù)的Serpin家族成員具有抑制活性［9］，以獨(dú)特的“自殺式底物”的方式［即其構(gòu)象由嚴(yán)緊型（S型）轉(zhuǎn)變成松弛型（R型）］調(diào)節(jié)蛋白酶的功能，從而使蛋白酶失活［10］；另一部分Serpin成員則可行使非抑制功能，如血液凝集、炎癥反應(yīng)［4］、激素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)［11］、分子伴侶［12］及腫瘤抑制［13］等。

在人體內(nèi)，除自身基因編碼的36個(gè)Serpin外，眾多寄生菌也可分泌多種Serpin。研究［14］顯示，Serpin在體內(nèi)的各種病理生理過(guò)程中可能扮演了重要角色，其中有關(guān)細(xì)菌分泌的Serpin的研究相對(duì)較少。直到2002年，Serpin可由原核生物分泌才得到首次證實(shí)［15］，且僅針對(duì)少數(shù)幾個(gè)人體寄生菌分泌的Serpin進(jìn)行了研究［16］。Miropin是第一個(gè)被研究的由人體寄生菌［牙周病相關(guān)病原體福氏單胞菌（Tannerella forsythia，Tf）］分泌的絲氨酸蛋白酶抑制劑，能夠有效抑制多種絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶，可能參與了牙周炎的發(fā)生與發(fā)展［16-17］。

研究［18-19］顯示，口腔微生物菌落是僅次于腸道微生物菌落的第二大人類相關(guān)微生物群落，目前包括了超過(guò)600個(gè)的物種或種系型（http：//www.homd.org）。牙周病是一種廣泛存在的多因素慢性炎癥性疾病，困擾了全球約20%的人群［20-21］。Tf是一種專性寄生在牙周袋內(nèi)的細(xì)菌［22］，且已有不少針對(duì)該病原菌的相關(guān)報(bào)道。Dewhirst等［23］發(fā)現(xiàn)了牙周內(nèi)的其他相關(guān)菌，如Tannerellasp.BU045（又稱HOT 808）；且該菌所寄生的牙周袋內(nèi)的絲氨酸蛋白酶活性較為異常［24］。我們通過(guò)基因組序列分析及氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，該病原體可能分泌了一個(gè)新型Serpin，而其是否具有蛋白酶抑制活性尚未可知。基于此，本研究構(gòu)建了融合表達(dá)載體pSUMO3-新型Serpin，通過(guò)原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備高純度的新型Serpin，并對(duì)其進(jìn)行蛋白結(jié)晶條件的篩選及作用底物的初篩，以期為后續(xù)的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）、pSUMO3載體由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供。本研究所用的pSUMO3載體經(jīng)實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化，刪去了小分子泛素相關(guān)修飾物蛋白（small ubiquitin-related modifier protein，SUMO）標(biāo)簽中最后1個(gè)甘氨酸（包括）至BamHⅠ酶切位點(diǎn)前的一段堿基序列，即當(dāng)融合蛋白被SUMO特異性蛋白酶2（SUMO-specific protease 2，SENP2）酶切后，目的蛋白的N端僅殘留1個(gè)絲氨酸殘基，以減少過(guò)多殘留氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)晶和結(jié)構(gòu)解析的影響。

1.1.2 試劑與儀器 氨芐青霉素［生工生物工程（上海）股份有限公司］，IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside）（上海麥約爾生物技術(shù)有限公司），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）（Invitrogen，美國(guó)），2×YT培養(yǎng)基（Oxoid，英國(guó)）。實(shí)驗(yàn)室自制：buffer A［20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH=7.5），含500 mmol/L NaCl和20mmol/L咪唑］，buffer B［20mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH=7.5），含500mmol/L NaCl和300mmol/L咪唑］。蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)?KTA Prime Plus system、HisTrap HP預(yù)裝柱（GE healthcare，美國(guó)），NanoDrop8000分光光度計(jì)（Thermo Scientific，美國(guó)），低溫超速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），高壓細(xì)胞破碎機(jī)［永聯(lián)生物科技（上海）有限公司］，96孔坐滴結(jié)晶板（Hampton Research，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 新型Serpin的篩選與融合表達(dá)載體的構(gòu)建 通過(guò)分析口腔牙周疾病相關(guān)菌Tannerellasp.BU045基因組序列，并利用經(jīng)典的Serpin超家族成員α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-AT，PDB：1QLP）和Miropin的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，篩選出由該菌分泌的新型Serpin。而后，將獲得的Serpin基因序列交由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行全基因技術(shù)合成及密碼子優(yōu)化，同時(shí)委托其完成融合表達(dá)載體的構(gòu)建。

1.2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及驗(yàn)證將“1.2.1 ”中構(gòu)建好的融合表達(dá)載體（pSUMO3-新型Serpin）轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）中，隨后涂布至含氨芐青霉素（ampicillin，Amp）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑選單菌落至含Amp的2×YT液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。以1∶100的比例將過(guò)夜菌液接種至含Amp的2×YT培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)2 h。當(dāng)菌液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值達(dá)0.6 時(shí)，將搖床溫度降至25℃并加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜，而后于4℃、10 000×g離心15min，收集菌體備用。分別于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后7 h和24 h留取菌液樣品，采用SDS-PAGE對(duì)融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 融合蛋白的純化及目的蛋白的收集 將菌體重懸于buffer A中，用高壓細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行細(xì)菌破碎，而后高速離心菌液1 h，收集上清液并上樣至HisTrap HP預(yù)裝柱，待蛋白樣品吸附在層析柱后，經(jīng)蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)進(jìn)一步純化，并調(diào)節(jié)Buffer B的濃度從0逐漸增加至100%（即通過(guò)增加咪唑的濃度，調(diào)節(jié)蛋白與鎳離子的結(jié)合程度）對(duì)樣品進(jìn)行梯度洗脫，收取每個(gè)蛋白峰對(duì)應(yīng)的樣品并進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證。將收集到的融合蛋白（SUMO3-新型Serpin）經(jīng)透析過(guò)夜后，向其中加入SENP2，并在4℃下經(jīng)0.22 μm濾膜透析過(guò)夜。將獲得的透析液再次上樣至HisTrap HP預(yù)裝柱，去除SUMO融合標(biāo)簽和SENP2，并采用SDS-PAGE對(duì)酶切效果進(jìn)行驗(yàn)證。而后，使用HiLoad 16/60 Superdex 75 pg凝膠過(guò)濾柱對(duì)目的蛋白進(jìn)一步純化，并經(jīng)SDS-PAGE分析驗(yàn)證。最終，將目的蛋白濃縮、換液，保存于-80℃。

1.2.4 新型Serpin結(jié)晶條件的篩選、優(yōu)化和晶體衍射采用坐滴式氣相擴(kuò)散法對(duì)新型Serpin的結(jié)晶條件進(jìn)行初篩，即使用自動(dòng)化移液站將Hampton Research結(jié)晶篩選試劑盒分裝至96孔坐滴結(jié)晶板里，由自動(dòng)化結(jié)晶機(jī)器人在該結(jié)晶板上完成對(duì)蛋白晶體生長(zhǎng)條件的篩選。針對(duì)初篩結(jié)果，選取其中生長(zhǎng)狀態(tài)較好的晶體，在24孔晶體生長(zhǎng)板上進(jìn)行手動(dòng)優(yōu)化，即通過(guò)調(diào)整沉淀劑種類及濃度、新型Serpin濃度、結(jié)晶溫度以及pH值等，獲得高質(zhì)量蛋白晶體。將篩選得到的晶型較好的晶體取出后用液氮速凍備用，于上海同步輻射光源（Shanghai synchrotron radiation facility，SSRF）的生物大分子晶體學(xué)光束線/實(shí)驗(yàn)站（BL17U）收集晶體X射線衍射數(shù)據(jù)。

1.2.5 新型Serpin作用底物的初步篩選 于室溫下，將純化后的新型Serpin與作用底物按照質(zhì)量比為1∶1混勻，37℃孵育30m in。而后，采用SDS-PAGE對(duì)上述混合液進(jìn)行檢測(cè)。本次新型Serpin作用底物的初篩范圍主要為本實(shí)驗(yàn)室常用的蛋白酶，包括人凝血因子Ⅱ a（coagulation factor Ⅱ a，F(xiàn) Ⅱ a）、FⅨa、FⅪa、抗凝蛋白C（protein C，PC）、組織型纖溶酶原激活劑（tissueplasminogen activator，t-PA）、人白細(xì)胞彈性蛋白酶（human leukocyte elastase，HLE）、人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（elastase）、胰蛋白酶（trypsin）、激肽釋放酶1（Kallikrein 1，KLK1）、KLK7、蛋白酶3（proteinase 3，PR3）、組織蛋白酶B（cathepsin B，CB）、組織蛋白酶G（cathepsin G，CG）。

2 結(jié)果

2.1 新型Serpin的篩選及融合表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)基因組序列分析及氨基酸序列比對(duì)，本研究篩選得到了口腔牙周疾病相關(guān)菌Tannerellasp.BU045分泌的Serpin，我們將其命名為Tannerpin；氨基酸序列比對(duì)結(jié)果（圖1）顯示，α1-AT、Miropin和Tannerpin的RCL氨基酸序列相對(duì)保守，但活性中心有所不同，即α1-AT的活性中心是甲硫氨酸（Met，M）、Miropin是蘇氨酸（Thr，T）、Tannerpin則是少見(jiàn)的丙氨酸（A la，A）。隨后，我們以Tannerpin基因序列構(gòu)建融合表達(dá)載體pSUMO3-Tannerpin，圖譜如圖2所示。

2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及目的蛋白的獲取

BL21經(jīng)融合表達(dá)載體pSUMO3-Tannerpin轉(zhuǎn)化后，分別于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后（7 h和24 h）裂解細(xì)胞，用SDSPAGE檢測(cè)細(xì)菌總蛋白和上清液中可溶蛋白的表達(dá)。結(jié)果（圖3A）顯示，與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后（7 h和24 h）的細(xì)菌總蛋白中出現(xiàn)了1條相對(duì)分子質(zhì)量約為58 000的特異性條帶，與融合蛋白的理論分子量相符，同時(shí)其上清液中也出現(xiàn)了少量可溶的融合蛋白；且隨著誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的延長(zhǎng)（從7 h到24 h），融合蛋白的表達(dá)量有明顯增加。

隨后，經(jīng)蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)進(jìn)一步純化、洗脫后，SDS-PAGE的檢測(cè)結(jié)果（圖3B）顯示，經(jīng)過(guò)HisTrap HP預(yù)裝柱后，上清液中相對(duì)分子質(zhì)量58 000附近的蛋白條帶消失了，而在后續(xù)的洗脫液中又見(jiàn)該蛋白條帶；繼而說(shuō)明，洗脫下來(lái)的蛋白即為結(jié)合在HisTrap HP預(yù)裝柱上的SUMO3-Tannerpin。經(jīng)SENP2酶切后再次經(jīng)過(guò)HisTrap HP預(yù)裝柱，用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖3C）顯示，融合蛋白被酶切出2條蛋白條帶，相對(duì)分子質(zhì)量分別在43 000和15 000附近（SUMO的相對(duì)分子質(zhì)量約15 000），而經(jīng)過(guò)HisTrap HP預(yù)裝柱的蛋白條帶在43 000附近，與Tannerpin的理論分子量相符，繼而說(shuō)明該蛋白即為已去除SUMO標(biāo)簽的Tannerpin。采用HiLoad 16/60 Superdex 75 pg凝膠過(guò)濾柱對(duì)第二次過(guò)HisTrap HP預(yù)裝柱的透析液進(jìn)行純化并行SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在相對(duì)分子質(zhì)量43 000附近有均一的蛋白條帶，即為Tannerpin。

圖3 融合蛋白（SUMO3-Tannerpin）的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及驗(yàn)證Fig 3 Induced expression,purification and validation of fusion protein(SUMO3-Tannerpin)

2.3 Tannerpin結(jié)晶條件的篩選、優(yōu)化和晶體衍射結(jié)果

首先，我們嘗試在20℃、20%聚乙二醇8000、0.1mol/LTris（pH=8.5）、0.2mol/LM gCl2條件下對(duì)Tannerpin進(jìn)行結(jié)晶，得到了小的、片狀、針狀及不規(guī)則狀的晶體（圖4A）。在此初篩基礎(chǔ)上，我們對(duì)晶體條件進(jìn)行優(yōu)化，即在20℃、Tannerpin濃度為15 mg/m L、結(jié)晶pH=6.0、沉淀劑為28%聚乙二醇3350和8%Tacsimate條件下，獲得了更大、形狀更好的蛋白晶體（圖4B）。隨后，對(duì)優(yōu)化的狀態(tài)較好的Tannerpin晶體進(jìn)行X射線衍射分析，結(jié)果（圖4C）顯示該晶體的分辨率為1.7 ?（1?=10-10m）。

圖4 Tannerpin蛋白結(jié)晶條件的篩選、優(yōu)化及晶體X射線衍射Fig 4 Screening and optimization of crystallization conditions of Tannerpin protein and its crystal X-ray diffraction

2.4 Tannerpin作用底物的初步篩選

SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，泳道4（HLE）、5（elastase）、12（trypsin）蛋 白 酶 將Tannnerpin作 為了水解底物，即在相對(duì)分子質(zhì)量43 000附近的Tannerpin因被上述3個(gè)靶酶消耗而減少，出現(xiàn)了蛋白條帶下移。

圖5 Tannerpin作用底物的初步篩選結(jié)果Fig 5 Preliminary screening results of Tannerpin substrates

3 討論

眾所周知，Serpin在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要且廣泛的病理生理作用，其功能障礙與多種疾病相關(guān)。目前，有關(guān)人體編碼Serpin的結(jié)構(gòu)與功能的報(bào)道較多。例如，在炎性腸道疾病中α1-AT的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變，而在給炎性腸道疾病小鼠使用Serpin后，其炎癥得到有效抑制，組織損傷有所減輕［25］；相關(guān)臨床數(shù)據(jù)表明，在肥胖及2型糖尿病患者的脂肪組織中，Vaspin大量表達(dá)［26］；有研究［27］證實(shí)，非抑制型絲氨酸蛋白酶抑制劑Maspin與乳腺癌和前列腺癌高度相關(guān)，可以幫助推測(cè)患者的預(yù)后情況。細(xì)菌在人體健康中扮演了非常重要的角色，通過(guò)參與多種病理生理過(guò)程發(fā)揮維持穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)免疫等作用［28］。例如，具核梭桿菌（Fusobacterium，F(xiàn)n）在結(jié)直腸癌組織中富集，能夠通過(guò)TIGIT（T-cell immunoglobulin and ITIM domain）抑制T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK cell，NK細(xì)胞）的抗腫瘤作用，幫助癌細(xì)胞進(jìn)行免疫逃逸，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展［29］；相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，清除腸道中的Fn可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，并有助于恢復(fù)腫瘤小鼠對(duì)化學(xué)治療藥物的敏感性［30］。

雖然在人體內(nèi)存在大量的Serpin，但其中僅有36個(gè)Serpin是由人的基因組編碼，其余大部分則是由腸道菌群和口腔菌群分泌，且鮮少有關(guān)于這些細(xì)菌的Serpin的研究［5］。牙周致病菌Tf分泌的Miropin具有廣泛的抑制活性，能夠有效抑制多種絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶，推測(cè)該菌在牙周病的致病過(guò)程中可發(fā)揮毒力作用［16］。本研究通過(guò)比對(duì)口腔牙周疾病相關(guān)菌Tannerellasp.BU045的基因組序列及Serpin超家族成員α1-AT、Miropin的氨基酸序列，篩選到該菌分泌的一種新型Serpin，即為Tannerpin；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，α1-AT、Miropin和Tannerpin的RCL氨基酸序列均相對(duì)保守，但活性中心有所不同，其中Tannerpin是以少見(jiàn)的丙氨酸作為其活性中心。在大腸埃希菌BL21（DE3）原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)融合蛋白SUMO3-Tannerpin，經(jīng)純化、酶切、驗(yàn)證后得到目的蛋白Tannerpin，再經(jīng)對(duì)該抑制劑結(jié)晶條件的初篩及優(yōu)化，最后在Tannerpin濃度為15mg/m L、結(jié)晶pH=6.0、沉淀劑濃度為28%聚乙二醇3350和8%Tacsimate的條件下，獲得了分辨率為1.7 ?的Tannerpin晶體。在Tannerpin作用底物的初篩實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)其并不能有效抑制一些常見(jiàn)的絲氨酸蛋白酶如HLE、elastase和trypsin，而是作為它們的水解底物被分解［即當(dāng)Tannerpin與上述底物發(fā)生反應(yīng)時(shí)，其RCL插入A-β折疊片層中的速度較慢，使Tannerpin與靶酶形成的共價(jià)結(jié)合在靶酶失活前被破壞，因此Tannerpin則會(huì)作為靶酶的水解底物被消耗，一般表現(xiàn)為其RCL被切斷（多發(fā)生在P1位點(diǎn)）］，這可能是由于底物篩選范圍（僅來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室）較窄所致。后續(xù)，我們將擴(kuò)大篩選范圍來(lái)尋找Tannerpin的作用底物，同時(shí)解析其三維空間結(jié)構(gòu)，對(duì)其作用機(jī)制與功能進(jìn)行更深入的探索。

參·考·文·獻(xiàn)

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