濃香型白酒窖泥微生物評(píng)價(jià)體系的構(gòu)建

張夢夢，吳玉軒，呂志遠(yuǎn)，蘇 寧，胥鑫鈺

（濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司，山東濟(jì)南 250115）

濃香型白酒的生產(chǎn)是以窖泥微生物、大曲微生物、酒醅微生物等復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝為前提，其中窖泥微生物的作用使得濃香型白酒產(chǎn)生濃郁的窖香，因此窖泥微生物區(qū)系對(duì)白酒的風(fēng)味與品質(zhì)至關(guān)重要。

窖泥微生物屬于厭氧發(fā)酵體系,其研究的難點(diǎn)在于大量具有重要代謝功能的微生物在實(shí)驗(yàn)室條件下難以培養(yǎng)[1]。而這些微生物群落組成及多樣性反映了窖泥質(zhì)量,并在很大程度上決定了濃香型白酒品質(zhì)。窖泥中富集多種厭氧功能菌，主要為嫌氣性梭狀芽孢桿菌，它們參與濃香型白酒發(fā)酵的生香作用。據(jù)資料顯示，老窖中嫌氣芽孢桿菌超過新窖的3 倍。濃香型白酒以固態(tài)窖泥發(fā)酵為特征,窖泥中微生物的生長代謝活動(dòng)對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要影響[2]。老熟窖泥的細(xì)菌多樣性指數(shù)及均勻度指數(shù)高于新窖泥和趨老熟窖泥[3]。全面剖析窖泥中功能微生物菌群組成及多樣性、窖泥質(zhì)量與微生物群落之間的關(guān)聯(lián)性為深入認(rèn)識(shí)白酒生產(chǎn)機(jī)制,進(jìn)而為從根本上提升白酒品質(zhì)提供理論依據(jù)。同時(shí)也是帶動(dòng)白酒傳統(tǒng)生產(chǎn)技術(shù)升級(jí)及實(shí)現(xiàn)白酒可持續(xù)發(fā)展的必要環(huán)節(jié)[4]。

廣義的細(xì)菌是指所有的原核生物，是所有生物中數(shù)量最多的一類。細(xì)菌中有很多釀酒有益菌，對(duì)白酒風(fēng)味起著舉足輕重的作用，如：己酸菌是老窖發(fā)酵生香的一種功能菌；乳酸菌具有產(chǎn)乳酸酯的能力，并能將己糖同化為乳酸、酒精和CO2。不同的釀酒有益菌對(duì)白酒發(fā)酵均起著不可忽視的作用。

梭菌屬是芽孢桿菌科的一個(gè)屬，是能形成芽孢、厭氧生長的革蘭氏染色陽性大桿菌，因芽孢常比菌體大，致使菌體呈梭狀而得名，又稱厭氧芽孢桿菌屬。梭菌因其能夠代謝合成白酒中的重要風(fēng)味物質(zhì)而被認(rèn)為是窖泥中的優(yōu)勢菌之一，例如C.tyrobutyricum及C.butyricum的主要代謝產(chǎn)物為丁酸，同時(shí)伴有乙酸生成等[5]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要以PCR-DGGE 條帶為依據(jù)，并將條帶采取一定方法換算出條帶分值。根據(jù)結(jié)果分析條帶得分高低與窖池酒質(zhì)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，找到適合本廠窖泥的微生物評(píng)價(jià)體系。因此，此實(shí)驗(yàn)對(duì)窖泥追蹤、提高酒質(zhì)、改良生產(chǎn)等有著重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

窖泥樣品：取樣對(duì)象為濃香型窖池的池壁窖泥，由于時(shí)間原因，窖泥取樣分4 輪不同窖池的窖泥。此次實(shí)驗(yàn)以窖泥普查為主，各輪次穿插同一窖池不同輪次的窖泥樣品。因檢修結(jié)束后（比正常輪次發(fā)酵期延長60 d），生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)可知，優(yōu)質(zhì)原酒一般出現(xiàn)在中下層，故實(shí)驗(yàn)選擇池壁下層窖泥取樣分析。本次分析樣本數(shù)目較豐富，共573 個(gè)窖泥樣品，其中一輪164 個(gè)樣品、二輪188 個(gè)、三輪170 個(gè)、四輪51 個(gè)。此報(bào)告主要針對(duì)四個(gè)輪次所取樣品進(jìn)行階段性匯總分析，分細(xì)菌界和梭菌屬兩大體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

試劑及耗材：Easy taq 酶、DNA Maker、loading buffer、GelStain 染液，北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；DNA 提取試劑盒、丙烯酰胺、去離子甲酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、尿素、四甲基乙二胺、過硫酸銨（均為分析純），生工生物工程(上海)股份有限公司。

儀器設(shè)備：高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma 公司；T100 型PCR 擴(kuò)增儀、DCodeTM System 突變檢測系統(tǒng)及凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；DYCP-31 E型瓊脂糖電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分析方法

為進(jìn)一步探究原酒酒質(zhì)、窖泥理化指標(biāo)與窖泥微生物多樣性之間的關(guān)聯(lián)性，綜合所有樣品，對(duì)窖泥理化指標(biāo)與窖泥微生物所對(duì)應(yīng)指紋圖譜進(jìn)行了量化。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.2.1 窖泥DNA提取

窖泥DNA 的提取采用基因組DNA 提取試劑盒，試劑盒具體組成見表1。

表1 DNA提取試劑盒具體組成

取0.22～0.23 g的窖泥，加入400 μL 65 ℃預(yù)熱的Buffer SCL,振蕩混勻，置于65 ℃水浴15 min；室溫12000 r/min 離心3 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中；加入等體積Buffer SP，顛倒混勻，冰浴10 min；室溫12000 r/min 再次離心3 min，吸取上清液至一個(gè)干凈的1.5 mL離心管中；加入200 μL氯仿，充分混勻，12000 r/min 離心5 min。吸取上層水相至一個(gè)干凈的2 mL 離心管中；加入1.5 倍體積的Buffer SB，充分混勻后用移液器將其全部加入到吸附柱中，室溫靜置2 min；12000 r/min 離心30 s，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，加入700 μL Wash Solution，12000 r/min 離心30 s，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，加入300 μL Wash Solution，12000 r/min 離心1 min，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，12000 r/min離心2 min（此步絕不可省略，否則殘余的乙醇會(huì)嚴(yán)重影響得率和后續(xù)實(shí)驗(yàn)）。取出吸附柱，放入一個(gè)新的1.5 mL 離心管中，在吸附膜中加入50～100 μL TE Buffer，靜置3 min。12000 r/min 離心2 min，得到的DNA 溶液置于-20 ℃保存或直接用于后續(xù)試驗(yàn)。重復(fù)最后一個(gè)步驟或?qū)E Buffer 60 ℃預(yù)熱，以此提高DNA的得率。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增

配制所需樣品的總體系，見表2。

表2 細(xì)菌體系(共50 μL)

細(xì)菌引物：

（1）上游引物：F338（含GC夾子）。

（2）下游引物：R518。

表3 梭菌體系(共50 μL)

梭菌引物：

（1）上游引物：SJ-F（含GC夾子）。

（2）下游引物：SJ-R。

注：分裝完總體系，加模板DNA 時(shí)，注意換槍頭，防止交叉污染。標(biāo)記好順序，防止混亂。

擴(kuò)增體系配制結(jié)束后，混勻于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，不同類型菌種采用不同擴(kuò)增方式。

1.2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳

（1）制膠

①稱取0.3 g 瓊脂糖于三角瓶中，加入20 mL 1×TAE緩沖液，加熱溶解（注意瓊脂糖完全溶解，壁上勿沾，混勻）。

②加熱混勻后，加入1 μL gelstain（核酸染料），混勻充分。

③將混勻溶解后的瓊脂糖溶液倒入事先準(zhǔn)備好的模具中。

④室溫凝固約30 min，凝固后，拔下梳子于電泳槽中待用。

⑤電泳槽中緩沖液（1×TAE）倒至約max 位置，使緩沖液沒過凝膠，進(jìn)行點(diǎn)樣。

⑥將提取的DNA 與Loading Buffer 混勻后，點(diǎn)入到孔中（依次點(diǎn)入，不亂順序）。

（2）點(diǎn)樣結(jié)束后，插入電極，130 V，30 min左右。

此步驟用來檢測DNA 是否提取成功，若用試劑盒提取后的DNA相對(duì)穩(wěn)定，此步驟可省略。

1.2.2.4 DGGE（變性梯度凝膠電泳）

（1）制備丙烯酰胺凝膠

①將預(yù)先洗干凈的制膠條安裝正確。

②變性劑的制備。

表4 細(xì)菌變性劑的制備

表5 梭菌變性劑的制備

相關(guān)藥品加入完畢后，均定容至100 mL備用。

注：a.40 %Arc-Bis 制備法：Arc：38.93 g；Bis：1.07 g。

B.50×TAE 溶液制備：Tris-Base：242 g+500～600 mL H2O；EDTA：18.6 g+200 mL H2O。

水：750 mL；冰乙酸：57.1 mL。

③準(zhǔn)備兩個(gè)高低變性梯度的離心管，制備相應(yīng)菌種變化梯度。

④將制好的高低濃度變性劑混勻充分，灌膠。

⑤凝膠制好后，輕輕插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡。

⑥凝膠待用，室溫約凝4 h左右。

（2）點(diǎn)樣，電泳

①細(xì) 菌：將PCR 擴(kuò) 增好 的DNA 模板+9 μL Loading buffer（6×），離心混勻，全部吸取點(diǎn)入點(diǎn)樣孔，緩沖液封孔，放入電泳槽內(nèi)準(zhǔn)備電泳，待液面到達(dá)run 線，設(shè)置儀器為20 V，20 min 沖洗泳道，之后電泳。

表6 菌種變化梯度

②梭菌：將PCR 擴(kuò)增好的DNA 模板+9 μL Loading buffer（6×），離心混勻，全部吸取點(diǎn)入點(diǎn)樣孔，緩沖液封孔，放入電泳槽內(nèi)準(zhǔn)備電泳，待液面到達(dá)run 線，設(shè)置儀器為20 V，20 min 沖洗泳道，之后按60 V+930 min條件進(jìn)行電泳。

（3）染色

電泳結(jié)束后，在板內(nèi)倒入染色液（核酸染料selstain），避光染色1 h，后于去離子水中清洗30 min左右，后于紫外線下顯像觀察。

（4）DGGE條帶順序

擴(kuò)增，篩選條帶較好的凝膠切下，于50 μL 無菌水中，65 ℃水溶和-20 ℃冰箱中反復(fù)凍融（4 ℃過夜也可），膠完全融化后作為DNA 模板放于4 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢修后細(xì)菌四輪窖泥評(píng)價(jià)與原酒酒質(zhì)分析

本次實(shí)驗(yàn)就檢修后第一輪至第四輪的540 個(gè)樣品進(jìn)行分析，去除25 個(gè)異常樣品后，以橫坐標(biāo)為窖泥評(píng)價(jià)得分，定60 分為及格線；縱坐標(biāo)代表平均己酸乙酯含量，其中一輪因發(fā)酵時(shí)間較長，己酸乙酯含量較高，因此己酸乙酯基準(zhǔn)線定為5.2 g/L，其余三輪己酸乙酯基準(zhǔn)線定3.8 g/L，據(jù)此繪制窖泥細(xì)菌評(píng)價(jià)與原酒酒質(zhì)分布圖。四輪對(duì)比圖如圖1所示。

圖1 檢修后細(xì)菌界窖池得分與原酒酒質(zhì)關(guān)系

圖1 整體表現(xiàn)為一三象限數(shù)據(jù)多，二四象限數(shù)據(jù)少的規(guī)律。一三象限，主要呈現(xiàn)窖泥綜合得分越高，平均己酸乙酯含量越高的規(guī)律，也就是窖泥綜合得分與原酒酒質(zhì)呈現(xiàn)正相關(guān)；二四象限呈現(xiàn)窖泥綜合得分較低，但平均己酸乙酯較高或窖泥綜合得分較高，但平均己酸乙酯較低的現(xiàn)象，出現(xiàn)這些偏離規(guī)律的數(shù)據(jù)，可能是窖泥質(zhì)量不是決定原酒酒質(zhì)的唯一因素，或者窖泥的評(píng)價(jià)體系并不完美。但是，大體規(guī)律還是有很強(qiáng)的指向性。

其中我們發(fā)現(xiàn)檢修期后第一輪次酒質(zhì)受窖泥影響比其他輪次要大，這應(yīng)該與發(fā)酵時(shí)間有關(guān)系。因?yàn)闄z修期結(jié)束后，各窖池的發(fā)酵期均增加了60 d左右，己酸乙酯轉(zhuǎn)化率提高。

由圖2 可以看出，數(shù)據(jù)點(diǎn)主要集中在一三象限，且分布在漸近線兩側(cè)?？梢缘贸鰯?shù)據(jù)總體的線性趨勢呈正相關(guān)，即窖泥評(píng)價(jià)得分越高，平均己酸乙酯越高。

圖2 四輪次細(xì)菌界綜合窖泥得分與原酒酒質(zhì)關(guān)系

白酒發(fā)酵是一個(gè)多微共酵的過程，窖泥微生物是決定白酒風(fēng)味與品質(zhì)的核心，但是發(fā)酵過程還受發(fā)酵時(shí)間、酒醅質(zhì)量、發(fā)酵情況、人工操作等多因素的共同影響。

2.2 檢修后梭菌四輪窖泥評(píng)價(jià)與原酒酒質(zhì)分析

本次實(shí)驗(yàn)就檢修后第一輪至第四輪的560 個(gè)樣品進(jìn)行分析，去除15 個(gè)異常樣品后，以橫坐標(biāo)為窖泥評(píng)價(jià)得分，定60 分為及格線；縱坐標(biāo)代表平均己酸乙酯含量，其中第一輪因發(fā)酵時(shí)間較長，己酸乙酯含量較高，因此己酸乙酯基準(zhǔn)線定為5.2 g/L，其余三輪己酸乙酯基準(zhǔn)線定3.8 g/L，據(jù)此繪制窖泥梭菌評(píng)價(jià)與原酒酒質(zhì)分布圖。四輪對(duì)比圖如圖3所示。

圖3 檢修后梭菌屬窖池得分與原酒酒質(zhì)關(guān)系

4 個(gè)輪次共有560 個(gè)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)點(diǎn)分布平均，由圖3 不難看出，梭菌屬對(duì)比圖與細(xì)菌界的對(duì)比圖走向大致相同。整體呈現(xiàn)第一象限、第三象限窖池?cái)?shù)據(jù)最多，第二象限、第四象限數(shù)據(jù)少的規(guī)律。且樣品數(shù)據(jù)均分布在漸近線兩側(cè)，窖池綜合得分與原酒酒質(zhì)基本呈正相關(guān)，可以說明窖池綜合得分越高原酒酒質(zhì)越好，也可以說明梭菌屬對(duì)窖泥質(zhì)量有著重要影響。

此外還可以看出，梭菌屬檢修后第一輪窖泥樣品總體最接近趨勢線，可以得出檢修后第一輪次受窖泥質(zhì)量影響最大，后三輪次二四象限中偏離趨勢線的點(diǎn)可以說明原酒酒質(zhì)的好壞有諸多影響因素，窖泥質(zhì)量的好壞只能作為影響原酒酒質(zhì)的因素之一，還受發(fā)酵時(shí)間、操作過程等影響。

由圖4 可以看出，梭菌屬數(shù)據(jù)分布相比細(xì)菌界數(shù)據(jù)分布整體上移，可以看出梭菌對(duì)窖泥質(zhì)量的影響較大。整體樣品分布與細(xì)菌界相差不大，還是以一三象限為主，部分在第二象限和第四象限偏X 軸方向。這表明窖泥的綜合得分與平均己酸乙酯總體成正相關(guān)，即窖泥質(zhì)量較高的窖池，原酒酒質(zhì)也較好，窖泥質(zhì)量差的窖池，對(duì)應(yīng)的原酒質(zhì)量也較為遜色。

圖4 四輪次梭菌屬綜合窖泥得分與原酒酒質(zhì)關(guān)系

2.3 對(duì)細(xì)菌界、梭菌屬的評(píng)價(jià)體系驗(yàn)證

為驗(yàn)證以上評(píng)價(jià)體系是否準(zhǔn)確，現(xiàn)隨機(jī)抽取20組質(zhì)量等級(jí)不同的原酒樣品及其所對(duì)應(yīng)的窖泥樣品。對(duì)其原酒酒質(zhì)及窖泥樣品分別進(jìn)行檢測分析，分析圖譜如圖5—圖6。

圖5 原酒酒質(zhì)與細(xì)菌界窖泥得分關(guān)系

圖6 原酒酒質(zhì)與梭菌屬窖泥得分關(guān)系

由圖5、圖6 可看出，窖泥微生物評(píng)價(jià)得分基本遵循原酒的酒質(zhì)變化，這也說明所構(gòu)建的窖泥微生物評(píng)價(jià)體系可以運(yùn)用于實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)整個(gè)窖池所產(chǎn)原酒質(zhì)量的預(yù)估及評(píng)價(jià)。

3 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要以PCR-DGGE 條帶為依據(jù)，并將條帶采取一定方法換算出條帶分值。根據(jù)結(jié)果分析條帶得分高低與窖池酒質(zhì)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，找到適合本廠窖泥的微生物評(píng)價(jià)體系。對(duì)573 個(gè)窖泥樣品的細(xì)菌和梭菌分析表明，窖泥質(zhì)量對(duì)于原酒酒質(zhì)有著舉足輕重的作用，窖泥微生物多樣性與原酒酒質(zhì)兩者相互聯(lián)系、相互制約。原酒酒質(zhì)的好壞與窖泥質(zhì)量緊密相關(guān)，但窖泥質(zhì)量不是影響原酒酒質(zhì)的唯一因素，這與酒醅質(zhì)量、人工操作、發(fā)酵情況等也有著千絲萬縷的聯(lián)系，只有各個(gè)影響因素都處于最適狀態(tài)，酒質(zhì)才能最大程度的提高。同時(shí)，退化窖泥、正常新窖泥及優(yōu)質(zhì)老窖泥的理化因子差異與細(xì)菌總量亦有相關(guān)性[5]。窖泥中微生物的種類和白酒的風(fēng)味密切相關(guān)[6]，總而言之，白酒的發(fā)酵是一個(gè)多微共酵的過程，只有各個(gè)影響因素均處于最優(yōu)狀態(tài)，原酒質(zhì)量才能穩(wěn)定提升。