基于金納米顆粒信號(hào)放大ELISA檢測(cè)食品中恩諾沙星

李 堅(jiān)，張富源，劉敏軒，劉若冰，王向紅

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

氟喹諾酮類(lèi)藥物憑借其強(qiáng)大的廣譜殺菌活性而被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療動(dòng)物細(xì)菌感染等疾病[1]。恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）作為一種喹諾酮類(lèi)藥物具有抗菌譜廣、吸收速度快等優(yōu)點(diǎn)[2]，其主要通過(guò)阻止原核生物中DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和終止等過(guò)程從而具有抑菌功效[3]，可有效抑制需氧性革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的生長(zhǎng)繁殖，因而被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域[4]。但非法或不當(dāng)使用ENR易導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中ENR的殘留超標(biāo)[5]，并通過(guò)食物鏈危害人體健康，包括引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)[6]、“三致”毒害[7]和急慢性毒性[8]等，且易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加和環(huán)境生態(tài)毒性[9-10]。許多國(guó)家和政府已經(jīng)設(shè)定了動(dòng)物源性食品中ENR最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）[11]，以確保食品安全。例如，美國(guó)已經(jīng)禁止ENR在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用[12]；歐盟在《歐盟食品中農(nóng)獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)》中，規(guī)定牛奶中ENR的MRL為100 μg/kg[13]；日本等國(guó)家設(shè)定為50 μg/kg[14]。我國(guó)規(guī)定其在各類(lèi)可食動(dòng)物性組織中ENR殘留不得超過(guò)300 μg/kg，在牛奶中的MRL為100 μg/kg[15]。但是近年來(lái)，動(dòng)物源性食品中ENR檢測(cè)超標(biāo)事件頻有發(fā)生。2019年，韓國(guó)因雞蛋中ENR超標(biāo)而宣布召回相應(yīng)產(chǎn)品；2020年，貴州在對(duì)豬肉檢疫中查出ENR超標(biāo)[16-17]。因此，為維護(hù)食品安全及保障食品經(jīng)濟(jì)正常進(jìn)行，建立針對(duì)ENR快速、靈敏、可靠的檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，ENR檢測(cè)方法主要有儀器檢測(cè)法[18-19]、電化學(xué)方法[20]、熒光分光光度法[21]和免疫分析法[22]等。其中，高效液相色譜[23-24]等方法使用最為廣泛，但所用儀器設(shè)備昂貴、前處理復(fù)雜、對(duì)操作人員要求高等限制了該類(lèi)方法的普及。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等免疫分析技術(shù)由于具有快速、低成本、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)備受關(guān)注[13,25-26]，成為ENR重要的快速檢測(cè)技術(shù)。

近年來(lái)，基于納米材料的新型信號(hào)放大免疫分析方法逐漸被應(yīng)用于食品安全和醫(yī)學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域，并展現(xiàn)出優(yōu)異的檢測(cè)性能。金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）具有易于合成、尺寸可控、生物相容性好、易于修飾等特點(diǎn)[27-28]，已被廣泛用作信號(hào)放大和生物醫(yī)學(xué)分析的信號(hào)載體提高免疫檢測(cè)的性能[29]。Agrawal等[30]利用AuNPs固定鳥(niǎo)分枝桿菌副結(jié)核亞種重組蛋白，開(kāi)發(fā)了一種對(duì)肺結(jié)核副結(jié)核病快速、經(jīng)濟(jì)、有效、靈敏而特異檢測(cè)的新型生物傳感器。Lee等[31]將黑曲霉孢子特異性結(jié)合肽固定在AuNPs表面，開(kāi)發(fā)出一種簡(jiǎn)單快速的比色法檢測(cè)過(guò)敏性真菌孢子，實(shí)現(xiàn)了在10 min內(nèi)快速檢測(cè)約50 個(gè)孢子的高靈敏度。

本實(shí)驗(yàn)利用AuNPs高比表面積、易于修飾、分散性好、穩(wěn)定性高、能偶聯(lián)多個(gè)辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗且不影響其活性等特點(diǎn)，將AuNPs作為信號(hào)放大載體，固定HRP標(biāo)記的二抗（AuNPs-HRP-IgG），建立一種基于AuNPs的信號(hào)放大酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法（AuNPs signal amplification enzyme-linked immunosorbent assay，AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA），該方法與傳統(tǒng)ELISA相比將顯著提高檢測(cè)靈敏度，適用于動(dòng)物性食品中ENR的靈敏、穩(wěn)定、可靠、快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純牛奶實(shí)際樣品 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)宜家旺超市；ENR、諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、氧氟沙星（ofloxacin，OFLO）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）上海源葉科技生物有限公司；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG北京索萊寶科技有限公司；包被原（ENR-OVA）北京博奧龍生物科技公司；3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）、氯金酸美國(guó)Sigma公司；ENR兔多克隆抗體為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院食品分析與營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室前期制備；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；IKA MS 3 digital微孔板振蕩器 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；TGL-16G離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；96 孔不可拆卸酶標(biāo)板（40301） 蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；UV-2800A紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AuNPs及AuNPs-HRP-IgG探針、HRP-AuNPs-IgG的制備

參考文獻(xiàn)[32]的方法，將100 mL 0.01%氯金酸溶液置于圓底燒瓶，在控溫?cái)嚢杵髦屑訜嶂练序v。迅速加入2 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，持續(xù)加熱至溶液顏色均勻穩(wěn)定，呈酒紅色，繼續(xù)煮沸15 min，室溫自然冷卻，定容至100 mL。采用掃描電鏡進(jìn)行表征。取制備好的AuNPs溶液10 mL，用0.1 mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5～8.0，靜置5 min。緩慢加入500 μL 1 mg/mL的羊抗兔IgG-HRP二抗，在4 ℃條件下避光反應(yīng)1 h。然后，分別加入200 μL的20% BSA和100 μL的20%聚乙二醇，低溫條件下振蕩30 min進(jìn)行封閉。將上述產(chǎn)物于3 000 r/min離心15 min，取上清液，10 000 r/min離心30 min，棄上清液，所得紅色沉淀（記為AuNPs-HRP-IgG探針）用AuNPs存儲(chǔ)液（0.01 mol/L PBS、pH 7.4、3%蔗糖、5%海藻糖、2% BSA）復(fù)溶，4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

將羊抗兔IgG-HRP二抗替換為羊抗兔IgG抗體和HRP，制備步驟同AuNPs-HRP-IgG探針，即得產(chǎn)物（記為HRP-AuNPs-IgG）。

1.3.2 傳統(tǒng)ELISA方法的建立

采用棋盤(pán)方陣法確定最佳抗原包被量及抗體作用質(zhì)量濃度。將質(zhì)量濃度為2 mg/mL的偶聯(lián)抗原ENR-OVA分別稀釋為1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.01 μg/mL進(jìn)行包被，每孔100 μL?？笶NR多克隆抗體從800 倍依次倍比稀釋至51 200 倍，酶標(biāo)二抗5 000 倍稀釋后使用。選取最佳抗原包被量和抗體稀釋質(zhì)量濃度，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)優(yōu)化的最佳實(shí)驗(yàn)條件，ENR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度從500 ng/mL依次倍比稀釋到0.16 ng/mL，同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和適宜稀釋度的抗體溶液作為混合溶液為陰性對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作為空白對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3 個(gè)平行，構(gòu)建間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.3 AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA的建立

檢測(cè)原理見(jiàn)圖1。包被抗原量和AuNPs標(biāo)記羊抗兔IgG-HRP二抗的使用濃度優(yōu)化同1.3.2節(jié)?？乖毁|(zhì)量濃度設(shè)置同上，AuNPs-HRP-IgG探針初始稀釋倍數(shù)為50，依次倍比稀釋400 倍。選取最佳抗原包被量和AuNPs-HRP-IgG使用質(zhì)量濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。由于牛奶樣品中其他物質(zhì)會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，所以本實(shí)驗(yàn)采用直接稀釋法消除樣品基質(zhì)的影響。用0.01 mol/L PBS將牛奶樣品空白提取液進(jìn)行梯度稀釋后繪制基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，與已建立的緩沖液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較，分析基質(zhì)的影響。選擇ENR結(jié)構(gòu)類(lèi)似物CIP、OFLO、NOR以及ENR分別進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)M(jìn)行交叉反應(yīng)率的測(cè)定，按下式計(jì)算：

圖1 AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA示意圖Fig.1 Schematic diagram of the developed AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA

式中：IC50（ENR）為ENR半數(shù)抑制濃度/（ng/mL）；IC50（結(jié)構(gòu)類(lèi)似物）為ENR結(jié)構(gòu)類(lèi)似物半數(shù)抑制濃度/（ng/mL）。

1.3.4 樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取10 mL牛奶，3 500 r/min離心10 min，除脂，取5 mL除脂后的牛奶依次加入150 μL 0.36 mol/L的K4Fe(CN)6·3H2O與1 mol/L的ZnSO4溶液，混勻5 min。3 500 r/min離心10 min，取上清液，用0.01 mol/L PBS溶液進(jìn)行稀釋后，進(jìn)行測(cè)定[33]。本實(shí)驗(yàn)牛奶樣品選擇的加標(biāo)質(zhì)量濃度為100、50、25 ng/mL。樣品經(jīng)前處理提取并稀釋到適宜倍數(shù)后，利用新建的AuNPs信號(hào)增強(qiáng)ic-ELISA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

使用Excel 2019及Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNPs及AuNPs-HRP-IgG探針的鑒定及表征

由圖2a可知，本實(shí)驗(yàn)所制備的AuNPs溶液外觀澄清透明，呈紅色，無(wú)肉眼可見(jiàn)顆粒沉淀，AuNPs在400～700 nm波長(zhǎng)區(qū)間內(nèi)有單一最大吸收峰，且有較窄的半峰寬。由圖2b可看出，所合成AuNPs粒徑較為均一，粒徑約為20 nm，分散均勻。將AuNPs與IgG-HRP結(jié)合后，吸光度明顯下降，其最大吸收峰由519 nm紅移至525 nm（圖2c），修飾后的納米顆粒粒徑均一，分散性較好（圖2d）。在包被有兔抗體的酶標(biāo)板中分別加入AuNPs、IgG-HRP、HRP-AuNPs-IgG和AuNPs-HRP-IgG探針進(jìn)行顯色，結(jié)果顯示（圖3），在AuNPs孔中沒(méi)有觀察到明顯的顏色變化，說(shuō)明單一的AuNPs對(duì)本檢測(cè)策略的背景影響較小，IgG-HRP孔可觀察到明顯的顯色結(jié)果，其OD450nm約為0.5，說(shuō)明所用羊抗兔酶標(biāo)二抗能夠識(shí)別所包被的兔抗體；HRP-AuNPs-IgG和AuNPs-HRPIgG探針孔，由于信號(hào)放大作用，其OD450nm明顯大于IgG-HRP孔，同時(shí)HRP-AuNPs-IgG的顯色說(shuō)明了AuNPs-HRP-IgG的顯色并不是殘留的IgG-HRP作用的結(jié)果，這也表明了AuNPs-HRP-IgG探針標(biāo)記成功。

圖2 AuNPs和AuNPs-HRP-IgG探針的紫外吸收光譜（a、c）和掃描電鏡圖（b、d）Fig.2 UV absorption spectra (a, c) and scanning electron micrographs (b, d) of AuNPs and AuNPs-HRP-IgG probes

圖3 IgG-HRP、HRP-AuNPs-IgG、AuNPs-HRP-IgG探針和AuNPs ELISA鑒定Fig.3 Identification of IgG-HRP, HRP-AuNPs-IgG, AuNPs-HRP-IgG probe and AuNPs

2.2 傳統(tǒng)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立

按照1.3.2節(jié)方法，通過(guò)棋盤(pán)法確定了傳統(tǒng)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的反應(yīng)條件：抗原最佳包被質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，封閉液為1% BSA，抗ENR多克隆抗體最佳稀釋倍數(shù)為6 400 倍。以ENR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，繪制抑制率曲線(xiàn)（圖4），曲線(xiàn)方程為y=0.133 5lnx＋0.210 2（R2=0.994 3），檢測(cè)范圍為0.8～100 ng/mL，IC50為8.76 ng/mL，IC15為0.63 ng/mL，與CIP、OFLO、NOR的交叉反應(yīng)率均小于0.1%，說(shuō)明該抗體特異性良好，能夠較為靈敏地特異性識(shí)別ENR。

圖4 傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)ENR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 Standard curve of traditional ELISA for ENR detection

2.3 AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA條件的優(yōu)化和建立

2.3.1 包被原及抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

選取包被原為1.00、0.50、0.25、0.10、0.05 μg/孔和0.01 μg/孔六個(gè)不同包被量進(jìn)行包被，ENR多克隆抗體稀釋倍數(shù)選取800、1 600、3 200、6 400、12 800、25 600、51 200七個(gè)倍數(shù)進(jìn)行間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1、2，選取不同包被原包被量、不同抗體稀釋倍數(shù)下OD450nm值在1.0附近的組合為最佳組合，選擇包被原包被量為1.0 μg/孔和0.5 μg/孔，抗體稀釋倍數(shù)為6 400 倍的條件，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1、3，當(dāng)包被原包被量為0.5 μg/孔，抗體稀釋倍數(shù)為6 400時(shí)，顯色穩(wěn)定且IC50較低。因此，確定該組合為包被原包被量和抗體稀釋倍數(shù)的最優(yōu)條件。

表1 AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化Table 1 Optimization of experimental conditions for AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA

表2 包被原和抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化Table 2 Optimization of dilution ratios of coating antigen and antibody

表3 最佳包被原和抗體稀釋倍數(shù)下的檢測(cè)效果Table 3 Detection efficiency at optimized coating antigen and antibody dilution factors

2.3.2 包被條件的優(yōu)化

為了探究包被條件的影響，本實(shí)驗(yàn)將包被原分別在37 ℃ 2 h、4 ℃ 12 h和37 ℃ 1 h條件下進(jìn)行包被。結(jié)果見(jiàn)圖5，與37 ℃條件下包被相比，當(dāng)包被原在4 ℃ 12 h條件下包被時(shí)，所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的IC50最低?？赡苁且?yàn)榈鞍踪|(zhì)與酶標(biāo)板聚苯乙烯固相載體之間是非特異性的物理吸附，包被原在4 ℃下，其活性相對(duì)較高且穩(wěn)定，同時(shí)包被時(shí)間長(zhǎng)，更容易固定在微孔板的表面，從而包被更充分，所以選其作為最適工作條件。

圖5 包被條件的優(yōu)化Fig.5 Optimization of coating conditions

2.3.3 封閉液的優(yōu)化

封閉液的作用是封閉未被包被原包被的游離位點(diǎn)，避免抗體與固相載體之間非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽(yáng)性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇合適的封閉液溶度是ELISA的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)分別選擇0.5%脫脂奶粉、1%脫脂奶粉、0.5% BSA、1% BSA 4種封閉液進(jìn)行封閉，比較不同封閉條件下的ODmax值和IC50值，結(jié)果見(jiàn)表1、4。與其他3種封閉條件相比，0.5% BSA的封閉條件下所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的IC50（1.47 ng/mL）最低，靈敏度最高，表明0.5% BSA對(duì)酶標(biāo)板上非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)封閉效果較好，因此選擇0.5%的BSA作為封閉液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表4 封閉液的優(yōu)化Table 4 Optimization of blocking solution

2.3.4 AuNPs-HRP-IgG探針稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

基于上述優(yōu)化條件，分別將制備好的AuNPs-HRPIgG探針從50～400 倍依次稀釋?zhuān)㈤g接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，計(jì)算各條件下的IC50值。當(dāng)AuNPs-HRP-IgG探針稀釋50 倍時(shí)，顯色穩(wěn)定，IC50較低。因此，確定此條件為方法的最佳工作條件。確定AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA的最佳反應(yīng)條件抗原最佳包被質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，AuNPs-HRP-IgG探針最佳稀釋倍數(shù)為50 倍，封閉液為0.5% BSA。以競(jìng)爭(zhēng)抗原ENR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，曲線(xiàn)方程為y=0.057 6lnx＋0.582 6（R2=0.983 1），檢測(cè)范圍為0.16～500 ng/mL，IC50為0.24 ng/mL，IC15為5×10－4ng/mL。

利用同一ENR兔多克隆抗體，發(fā)現(xiàn)與常規(guī)ic-ELISA（IC50=8.76 ng/mL）相比，AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA檢測(cè)（IC50=0.24 ng/mL）更靈敏。本研究利用AuNPs高比表面積和表面易功能化的特點(diǎn)，將AuNPs作為納米載體，固定多個(gè)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，達(dá)到多聚HRP的效果，可以檢測(cè)到分析物質(zhì)量濃度較低的樣品，從而提高檢測(cè)靈敏度[34]。相對(duì)于游離的IgG-HRP，AuNPs-HRPIgG探針上的酶標(biāo)二抗與檢測(cè)抗體結(jié)合，固定于AuNPs上的IgG-HRP均會(huì)參與到后續(xù)顯色反應(yīng)中，使檢測(cè)信號(hào)放大，相比傳統(tǒng)ic-ELISA，檢測(cè)靈敏度得到提升。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的消除

為探究基質(zhì)效應(yīng)，以獲得樣品預(yù)處理的最佳方法，本研究通過(guò)將樣品提取液稀釋一定倍數(shù)后，以消除樣品基質(zhì)對(duì)ELISA檢測(cè)曲線(xiàn)的影響。陰性樣品提取液用0.01 mol/L PBS稀釋5、10 倍和20 倍，用于ENR標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋液，進(jìn)行AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)?；|(zhì)效應(yīng)分析結(jié)果表明（圖6），牛奶樣品提取液經(jīng)0.01 mol/L PBS 稀釋10 倍后，所得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與緩沖液標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(xiàn)（0.01 mol/L PBS稀釋?zhuān)┗鞠嗤?，此時(shí)基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響很小，故后續(xù)檢測(cè)時(shí)，樣品提取液需經(jīng)10 倍稀釋?zhuān)韵|(zhì)效應(yīng)。

圖6 牛奶提取液基質(zhì)影響Fig.6 Matrix effect elimination for milk extract

2.5 AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA檢測(cè)法特異性分析

該方法特異性分析結(jié)果表明（表5），雖然CIP、OFLO和NOR的結(jié)構(gòu)和ENR具有很大的相似性，但是交叉反應(yīng)率均小于0.1%，均無(wú)交叉反應(yīng)，所建立的AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA可特異性的檢測(cè)樣品中的ENR，這與所建立的傳統(tǒng)ELISA結(jié)果一致，表明所應(yīng)用檢測(cè)抗體和建立的ELISA方法具有良好的特異性。

表5 ENR及3種結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率Table 5 Cross-reactivity of the developed ELISA toward three structural analogs of ENR %

2.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究向陰性牛奶樣品中分別添加質(zhì)量濃度為25、50 ng/mL和100 ng/mL的ENR標(biāo)準(zhǔn)品，并用0.01 mol/L PBS將樣品提取物稀釋10 倍，分別采用建立的AuNPs-HRPIgG ic-ELISA和商業(yè)ENR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品3 個(gè)平行，并重復(fù)3 次。結(jié)果見(jiàn)表6，AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA和商業(yè)ENR試劑盒2種方法在牛奶樣品中的加標(biāo)回收率分別為80.52%～102.66%和91.06%～108.04%，AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA的結(jié)果與商業(yè)ENR試劑盒的結(jié)果較為一致，半數(shù)抑制率均低于我國(guó)和歐盟規(guī)定的ENR最高限量標(biāo)準(zhǔn)，表明所建立AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA能夠用于實(shí)際牛奶樣品中ENR的測(cè)定。

表6 牛奶樣品加標(biāo)回收率（n =3）Table 6 Recoveries for spiked milk samples (n = 3)

2.7 本研究與相關(guān)文獻(xiàn)比較

由表7可知，本研究建立的AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA靈敏度（IC50=0.24 ng/mL）較低，檢測(cè)范圍（0.16～500 ng/mL）較廣，建立的AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA在靈敏度方面具有一定優(yōu)勢(shì)。與建立的常規(guī)ELISA相比，明顯提升了檢測(cè)的靈敏度，這主要是由于AuNPs作為信號(hào)放大載體，結(jié)合了多個(gè)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗參與顯色反應(yīng)，從而增加了檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度和靈敏度。

表7 AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA與其他文獻(xiàn)比較Table 7 Comparison of AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA with other detection methods

3 結(jié) 論

本研究成功制備了AuNPs-HRP-IgG探針，用來(lái)替代傳統(tǒng)ELISA中的酶標(biāo)記二抗，建立基于AuNPs信號(hào)增強(qiáng)ELISA檢測(cè)動(dòng)物性食品中的ENR，以提高檢測(cè)的靈敏度。與傳統(tǒng)ELISA相比，靈敏度從8.76 ng/mL提高到0.24 ng/mL，檢測(cè)限（IC15）下降至5×10－4ng/mL，與ENR結(jié)構(gòu)類(lèi)似物CIP、NOR、OFLO的交叉反應(yīng)率均小于0.1%，牛奶實(shí)際樣品加標(biāo)回收率為80.52%～102.66%，能夠用于實(shí)際樣品中ENR的靈敏定量檢測(cè)分析。結(jié)果表明，所提出的新型AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA，可以明顯提高傳統(tǒng)ELISA的檢測(cè)靈敏度，可作為高靈敏檢測(cè)方法用于牛奶樣品中ENR的靈敏檢測(cè)，并對(duì)建立食品中其他抗生素及小分子有害物質(zhì)的高靈敏檢測(cè)方法具有重要指導(dǎo)意義。