直鏈淀粉的傅里葉衰減全反射中紅外特征光譜篩選與定量分析

王 廣，劉 宇，夏蘭欣，李 偉，程 超,

（1.生物資源與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北民族大學(xué)），湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000）

淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉兩大主要部分構(gòu)成，這兩種淀粉在理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)和相對(duì)分子質(zhì)量等方面存在一定差異，直鏈淀粉含量是影響淀粉產(chǎn)品加工品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，如稻米中直鏈淀粉含量高則米質(zhì)松散，而支鏈淀粉含量高的米質(zhì)較黏稠[1]，因此能及時(shí)快速掌握原料中直鏈淀粉的含量對(duì)其加工產(chǎn)品種類(lèi)具有一定指導(dǎo)作用。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的測(cè)定支鏈淀粉和直鏈淀粉含量的方法有單標(biāo)單波長(zhǎng)法、單標(biāo)雙波長(zhǎng)法、雙標(biāo)單波長(zhǎng)法、雙標(biāo)雙波長(zhǎng)法、自動(dòng)分析檢測(cè)法、伴刀豆球蛋白法及排阻色譜分析法，這些方法需要將產(chǎn)品進(jìn)行復(fù)雜的前處理才能測(cè)得直鏈淀粉含量，且此過(guò)程易導(dǎo)致淀粉損失，這不僅使得研究數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，還限制了某些領(lǐng)域的生產(chǎn)速度[2]。

近年來(lái)快速、無(wú)損紅外定量檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速，如利用近紅外和中紅外光譜定量分析肉制品、乳制品等產(chǎn)品中摻假成分[3-8]、米酒和巧克力的抗氧化能力[9-10]、脂肪酸、淀粉結(jié)晶度等指標(biāo)測(cè)定[11-14]等。有資料報(bào)道中紅外定量分析效果略?xún)?yōu)于近紅外，如向伶俐等[15]用近、中紅外光譜儀采集中國(guó)4 個(gè)不同葡萄主栽產(chǎn)地153 個(gè)葡萄酒樣品的近紅外透射光譜和中紅外衰減全反射光譜，建模后發(fā)現(xiàn)4 個(gè)產(chǎn)區(qū)葡萄酒判別模型建模集的平均準(zhǔn)確率為78.21%（近紅外）和82.57%（中紅外），檢驗(yàn)集平均準(zhǔn)確率為82.50%（近紅外）和81.98%（中紅外），但二者融合后均優(yōu)于單獨(dú)采用一種光譜技術(shù)。鄒小波等[16]發(fā)現(xiàn)中紅外光譜建立的玉米淀粉回生模型較近紅外光譜更佳。熊艷梅等[17]用近紅外和中紅外法測(cè)定氰戊菊酯、馬拉硫磷定量模型的相關(guān)系數(shù)分別為0.998 1、0.999 4和0.994 6、0.999 8，外部驗(yàn)證集標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.082、0.081和0.092、0.075，中紅外的定量方法略?xún)?yōu)于近紅外。Musingarabwi等[18]利用傅里葉變換近紅外和衰減全反射中紅外光譜技術(shù)對(duì)不同發(fā)育階段的白蘇維翁葡萄漿果進(jìn)行了定性和定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中紅外光譜分析結(jié)果更可靠。

多組分樣品紅外光譜數(shù)據(jù)相對(duì)較大，很難辨析目標(biāo)成分的特征分析光譜，需要選擇合理的光譜區(qū)間進(jìn)行分析，合適、準(zhǔn)確的波段區(qū)間能減少計(jì)算量，同時(shí)提高精度[19]，因此區(qū)間選擇法和變量篩選法等在優(yōu)化紅外光譜模型方面得到了廣泛的應(yīng)用，如肖朝耿等[20]利用區(qū)間偏最小二乘（partial least squares，PLS）法，向后PLS法、向前PLS法進(jìn)行波譜區(qū)間選擇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)向后PLS法模型效果最優(yōu)。此外詹雪艷等[21]利用MATLAB軟件的移動(dòng)窗口PLS、組合間隔PLS和競(jìng)爭(zhēng)自適應(yīng)抽樣方法進(jìn)行建模的變量篩選，發(fā)現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)自適應(yīng)抽樣方法能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分紅外特征大部分化學(xué)特征的解析，有利于增強(qiáng)模型的解釋性。

鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以馬鈴薯直鏈淀粉與支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品為原材料，在iD7ATR Transmission衰減全反射附件上對(duì)樣品進(jìn)行掃描，獲取其紅外圖譜，嘗試?yán)肧imca軟件的主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘（orthogonal partial least squares，OPLS）回歸分析篩選影響直鏈淀粉含量的全反射中紅外光譜的特征波段，而后結(jié)合TQ analyst軟件對(duì)比分析以此波段建立的直鏈淀粉含量定量分析預(yù)測(cè)模型的可行性和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品、馬鈴薯支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PTY-224/323電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司；iS5傅里葉紅外光譜儀、iD7 ART Transmission衰減全反射附件 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取馬鈴薯直鏈淀粉、馬鈴薯支鏈淀粉兩種標(biāo)準(zhǔn)品，使其直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、24%、26%、28%、30%、32%、34%、36%、38%、40%、42%、44%、46%、48%、50%、52%、54%、56%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、86%、88%、90%、92%、94%、96%、98%、100%，將上述稱(chēng)取的樣品裝入PE管中，擰緊管蓋，旋渦振蕩混合均勻，備用。

1.3.2 中紅外光譜數(shù)據(jù)的采集

用藥匙取少量1.3.1節(jié)制備的淀粉樣品，置于傅里葉紅外光譜儀的iD7 Transmission衰減全反射附件上，進(jìn)行紅外掃描，波數(shù)范圍為400～4 000 cm－1，掃描次數(shù)共32 次，分辨率為8 cm－1，掃描間隔為2 cm－1[22]。每個(gè)直鏈淀粉含量的樣品做2 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)及圖形處理

利用Simca14.1軟件對(duì)不同直鏈淀粉含量的中紅外圖譜進(jìn)行PCA和OPLS回歸分析[23]，而后采用TQ analyst 8軟件對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用PLS建立定量模型并驗(yàn)證。所有圖形均利用Origin2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 直鏈淀粉和支鏈淀粉的傅里葉中紅外全反射圖譜

一般認(rèn)為紅外光譜中4 000～1 500 cm－1區(qū)域?yàn)楣倌軋F(tuán)區(qū)；1 500～400 cm－1為指紋區(qū)[24]，當(dāng)分子結(jié)構(gòu)略有變化時(shí)即可在指紋區(qū)的吸收峰上表現(xiàn)出細(xì)微差異。純直鏈淀粉和支鏈淀粉及二者混合樣品的衰減全反射中紅外圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 直鏈淀粉和支鏈淀粉及其混合樣品的傅里葉全反射中紅外圖譜Fig.1 FT-MIR spectra of amylose, amylopectin and their mixed samples

由圖1可看出，在指紋區(qū)含有兩種淀粉的特征結(jié)構(gòu)，該區(qū)間含有淀粉基本結(jié)構(gòu)α-D-吡喃葡萄糖環(huán)、淀粉晶體和無(wú)定形結(jié)構(gòu)的特征振動(dòng)，將圖譜進(jìn)行解卷積處理后發(fā)現(xiàn)，1 047 cm－1和1 022 cm－1分別具有淀粉結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)域的特征振動(dòng)，這與文獻(xiàn)[16,25]的研究結(jié)果一致，同時(shí)測(cè)定發(fā)現(xiàn)同等濃度時(shí)由于不同樣品結(jié)晶度不同，這兩個(gè)波段的吸收峰也有差異。此外在900～1 000 cm－1為α-1,4-糖苷鍵的C—O—C伸縮振動(dòng)等[26-28]，因此可以利用這些振動(dòng)信息與直鏈淀粉含量相關(guān)聯(lián)建立預(yù)測(cè)模型。

2.2 傅里葉中紅外光譜定量分析直鏈淀粉含量的特征波段的選擇

每種化合物都具有特征紅外吸收光譜，因此才得以進(jìn)行定性和定量分析。由于樣品組分眾多，其獲取的紅外光譜分析數(shù)據(jù)集相對(duì)較大，因此要選擇合適的波段，減少計(jì)算量、提高計(jì)算精度。

2.2.1 直鏈淀粉含量與其中紅外圖譜相關(guān)性確定

利用Simca軟件對(duì)所有不同含量直鏈淀粉的中紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，為降低噪音的影響，對(duì)中紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行Ctr中心化處理后進(jìn)行PCA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以分為4 個(gè)PC，其中R2X為0.986，Q2為0.982，表明4 個(gè)PC包含了樣品的大部分信息，能代表樣品中直鏈淀粉含量的主要光譜特征，PCA的scoreplot見(jiàn)圖2。由圖2可看出，PCA結(jié)果可以客觀地分析中紅外光譜數(shù)據(jù)和直鏈淀粉含量的分布態(tài)勢(shì)，隨著PC1在－10～8、PC2在－2.5～1.5范圍的遷移，直鏈淀粉的含量逐漸增加，說(shuō)明傅里葉中紅外圖譜數(shù)據(jù)與直鏈淀粉含量具有一定的相關(guān)性。

2.2.2 直鏈淀粉含量與中紅外圖譜回歸模型分析

為進(jìn)一步探索傅里葉中紅外光譜數(shù)據(jù)是否能足夠預(yù)測(cè)直鏈淀粉含量，利用Simca軟件進(jìn)行OPLS回歸模型分析。

OPLS是一種新型的多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析方法，可研究Y變量和多元X變量之間的關(guān)系，最大特點(diǎn)是可去除自變量中與分類(lèi)變量無(wú)關(guān)的數(shù)據(jù)變異，使分類(lèi)信息主要集中在一個(gè)或幾個(gè)PC中，模型變得簡(jiǎn)單和易于解釋?zhuān)渑袆e效果及PC得分圖可視化效果更明顯[29]，因此利用Simca軟件建立直鏈淀粉含量與中紅外圖譜的OPLS回歸模型，模型的R2X為0.979，R2Y為0.958，Q2為0.940，說(shuō)明此回歸模型較好，為進(jìn)一步考察此回歸模型的可靠性，對(duì)此OPLS模型進(jìn)行擬合和置換檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 基于OPLS法回歸模型的直鏈淀粉含量擬合效果Fig.3 Fitting of actual amylose contents to predicted values from OPLS regression model

由圖3可以看出，R2為0.958 1，說(shuō)明此回歸方程擬合程度較高。從圖4的R2和Q2可以看出，隨機(jī)數(shù)據(jù)產(chǎn)生的模型比現(xiàn)有模型差很多，說(shuō)明現(xiàn)有OPLS模型可靠。為深入了解在400～4 000 cm－1中對(duì)直鏈淀粉含量影響最顯著的波段，對(duì)OPLS模型進(jìn)行變量重要度投影[30]（variable importance for the projection，VIP）分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 基于OPLS回歸模型的置換檢驗(yàn)圖Fig.4 Permutation plot based on OPLS regression model

圖5 基于OPLS回歸模型VIP圖Fig.5 VIP plot based on OPLS regression model

由圖5可看出，直鏈淀粉含量模型擬合貢獻(xiàn)比較大波段主要有400～765、969～1 158、3 250～3 329 cm－1，這3 個(gè)波段區(qū)間的VIP大于1，因此可以認(rèn)為此波段可作為影響直鏈淀粉含量預(yù)測(cè)的特征波段。

2.3 不同直鏈淀粉含量的中紅外圖譜模型建立及驗(yàn)證

鑒于400～765 cm－1的噪音干擾過(guò)大，3 250～3 329 cm－1受羥基影響大，因此只選擇VIP大于1的969～1 158 cm－1作為不同直鏈淀粉含量的中紅外圖譜檢測(cè)的分析波段。利用TQ analyst軟件對(duì)傅里葉中紅外的全波段和此分析波段分別進(jìn)行建模預(yù)測(cè)和驗(yàn)證。使用TQ analyst8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選擇原始光譜數(shù)據(jù)、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)的處理方法，在PLS法的基礎(chǔ)上建模。

2.3.1 直鏈淀粉混合樣品定量模型的建立

分別用隨機(jī)數(shù)生成器，在淀粉紅外圖譜中隨機(jī)選擇2/3為建模集，1/3為驗(yàn)證集，驗(yàn)證集為隨機(jī)選擇包含高中低濃度的樣品圖譜，依次選用400～2 000 cm－1、主要指紋峰波段800～1 200 cm－1、OPLS分析的VIP大于1的969～1 158 cm－1三大波段為建模波段，在PLS方法基礎(chǔ)上，每個(gè)波段分別以原始圖譜數(shù)據(jù)、一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)處理的光譜數(shù)據(jù)建立兩個(gè)模型，模型內(nèi)部采用交叉驗(yàn)證的方法。表1為400～4 000、800～1 200、969～1 158 cm－1建模和交叉驗(yàn)證的結(jié)果。

表1 不同分析波段PLS建模的模型參數(shù)Table 1 Parameters of PLS models within different bands

所構(gòu)建的模型，其內(nèi)部穩(wěn)健性和擬合效果是根據(jù)決定系數(shù)（RC2）和校正集均方根誤差（root mean square error for calibration，RMSEC）為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)定。模型內(nèi)部預(yù)測(cè)能力以決定系數(shù)（RV2）和交互驗(yàn)證均方根誤差（root mean squares error of cross-validation，RMSECV）為評(píng)價(jià)指標(biāo)。其中決定系數(shù)越大，其均方差越小，對(duì)應(yīng)的模型擬合效果就越好。

比較表1的3 個(gè)波段的PLS建模參數(shù)可知，選用400～4 000 cm－1建模時(shí)，在兩個(gè)模型中，原始光譜的建模效果均顯著優(yōu)于一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)處理后，這可能是由于全光譜建模會(huì)將很多噪聲信息納入，這些噪音信息和反映直鏈淀粉含量的光譜信息混合，而光譜導(dǎo)數(shù)處理同時(shí)也放大了噪聲信息，進(jìn)而對(duì)模型造成嚴(yán)重干擾[31]。以800～1 200 cm－1和969～1 158 cm－1兩個(gè)波段的光譜數(shù)據(jù)的建模效果顯著優(yōu)于400～4 000 cm－1，這兩個(gè)波段建模的RC2和RV2基本上均大于0.97，說(shuō)明模型的擬合效果和內(nèi)部預(yù)測(cè)能力均較好，通過(guò)比較可以看出這兩個(gè)波段建模效果的順序均為二階導(dǎo)數(shù)＞一階導(dǎo)數(shù)＞原始光譜，尤其是以Simca軟件篩選VIP大于1的969～1 158 cm－1RC2顯著優(yōu)于800～1 200 cm－1，達(dá)到了0.999 8；這可能是由于Simca篩選的分析變量去除光譜中噪音變量和冗余變量，從而提高模型的穩(wěn)定性，此外對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)處理后，反映直鏈淀粉的信息量得到放大，使光譜之間的差異更加明顯，能將重疊的峰分開(kāi)，提供了比原光譜更高的分辨率和更清晰的光譜輪廓變化，因此二階導(dǎo)數(shù)處理的建模效果最優(yōu)。

2.3.2 模型驗(yàn)證結(jié)果

進(jìn)一步用驗(yàn)證集對(duì)模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，由于400～4 000 cm－1建模效果較差，同時(shí)800～1 200、969～1 168 cm－1的原始數(shù)據(jù)建模效果也較差，因而驗(yàn)證時(shí)舍棄。驗(yàn)證集數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果如表2所示。為更直觀地比較預(yù)測(cè)效果，將模型中驗(yàn)證效果良好的800～1 200 cm－1波段和969～1 158 cm－1的一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)建模的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值進(jìn)行擬合作圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。

表2 全波長(zhǎng)驗(yàn)證數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)效果Table 2 Validation of prediction models based on full-band spectra

圖6 驗(yàn)證集驗(yàn)證效果Fig.6 Validation with validation set in the region of 800 -1 200 cm-1 and 969-1 158 cm-1

所構(gòu)建好的模型，根據(jù)驗(yàn)證樣品的預(yù)測(cè)能力，以線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（RP2）和預(yù)測(cè)集均方根誤差（root mean square error for prediction，RMSEP）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，相關(guān)系數(shù)越接近1，RMSEP越小，則其所對(duì)應(yīng)模型的預(yù)測(cè)效果就越好。此外，相對(duì)分析誤差（relative percent deviation，RPD）也是評(píng)價(jià)模型預(yù)測(cè)能力的關(guān)鍵指標(biāo)之一，RPD可以對(duì)不同樣本集造成的影響進(jìn)行有效消除，并能夠提高實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，使其更加標(biāo)準(zhǔn)化。RPD越大，表征其相對(duì)應(yīng)模型的預(yù)測(cè)能力越好。當(dāng)RPD＞3時(shí)，表明模型有很好的預(yù)測(cè)效果。

由表2可以看出，驗(yàn)證集的RPD都大于3，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)在0.93以上，說(shuō)明這兩個(gè)波段模型1、2具有很好的預(yù)測(cè)效果。但通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，以969～1 158 cm－1為分析波段經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)數(shù)據(jù)處理后建模驗(yàn)證時(shí)，其預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)最高可達(dá)到0.962 7，而預(yù)測(cè)均方差也相對(duì)較低，同時(shí)圖6B的驗(yàn)證結(jié)果也說(shuō)明中紅外光譜模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值接近，具有較好的線(xiàn)性關(guān)系。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用傅里葉衰減全反射中紅外光譜建模定量分析直鏈淀粉含量，為提高預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性，利用Simca軟件的PCA和OPLS分析篩選了中紅外定量分析的特征波段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)969～1 158 cm－1特征波段，主要對(duì)應(yīng)直鏈淀粉的結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)，同時(shí)也是α-1,4-糖苷鍵C—O—C伸縮振動(dòng)的特征波段，基于此特征波段、全波段等，利用TQ analyst軟件采用PLS法使用原始光譜、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)的處理方法建模驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)，969～1 158 cm－1光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理后建模的效果最優(yōu)，模型的預(yù)測(cè)性能較全波段等得到了提高，模型相關(guān)系數(shù)為0.999 8，RMSEC和RMSEP分別為0.587%和6.26%，RPD為5.177 8，預(yù)測(cè)值和真實(shí)值相關(guān)系數(shù)為0.962 7。因此OPLS篩選的變量能實(shí)現(xiàn)直鏈淀粉中紅外區(qū)大部分化學(xué)特征的解析，可增強(qiáng)預(yù)測(cè)模型的解析性。