基于QuEChERS-高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術檢測食用菌中8種煙堿類化合物

陳榮鋒，陳鳳明，潘裕添，張國廣,，張 峰,

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.閩南師范大學菌物產(chǎn)業(yè)工程技術中心，福建 漳州 363000；3.國家衛(wèi)生健康委職業(yè)安全衛(wèi)生研究中心，北京 102308）

煙堿類化合物是一類含有氮雜環(huán)的堿性物質(zhì)，目前已鑒定的有40多種，包括尼古丁、可替寧、新煙堿、二烯煙堿、去氫新煙堿、2,3’-二聯(lián)吡啶、麥斯明、降煙堿8種主要的生物堿，其中尼古丁含量最高[1]。尼古丁會使人上癮或產(chǎn)生依賴性，重復使用會增加心率和升高血壓并降低食欲。大劑量的尼古丁會引起嘔吐以及惡心，嚴重時人會死亡[2]。

2008年11 月，有德國實驗室公布中國產(chǎn)牛肝菌干片尼古丁含量超標，德國禁止中國的牛肝菌干片在德國市場上銷售[3]。隨后牛肝菌干片在德國、意大利、法國等國的銷售受到嚴重阻礙，牛肝菌面臨在歐盟退市的危機[4]。我國科研工作者通過對不同品種食用菌的檢測發(fā)現(xiàn)，很多野生食用菌中含有尼古丁，包括歐州在內(nèi)的不同產(chǎn)地產(chǎn)品。最后根據(jù)實驗結果結合調(diào)研情況得出結論：尼古丁在此類低等植物中是普遍存在的內(nèi)源性微量物質(zhì)。從而為中國的牛肝菌出口挽回巨大的經(jīng)濟損失。經(jīng)歐盟食品安全委員會調(diào)查并對食用菌[5-9]中尼古丁限量作出緊急修訂，尼古丁在食用菌鮮品和干品（不含牛肝菌）中最高限量分別為0.036 mg/kg和1.17 mg/kg，而在牛肝菌干品的最高限量則為2.3 mg/kg。此后，食用菌類中煙堿類物質(zhì)引起了廣大科研工作者的關注。

目前僅見檢測煙草和體液中此類生物堿的研究，采用分光光度法[10-11]、光譜法[12-13]、毛細管電泳法[14]、氣相色譜法[15-17]、液相色譜法[18-19]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-23]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[24-30]等。分光光度法針對官能團相同的化學性質(zhì)，能夠測定一類物質(zhì)如煙堿類總生物堿的含量，但對于其中各生物堿含量則無法測定。光譜法建模較難，而且對于基質(zhì)復雜樣品專屬性不強。電化學分析法和示波極譜法應用范圍較小。毛細管電泳影響因素多，操作復雜。高效液相色譜法檢測靈敏度不高，難以得到結構信息，在對復雜混合未知物的結構分析方面顯得薄弱，在常規(guī)紫外檢測器上對無紫外吸收化合物的檢測和大量未知化合物的定性分析還需依賴于其他手段。而色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術結合了色譜技術對復雜基質(zhì)的分離能力和質(zhì)譜檢測器高靈敏度高專屬性的特點，對煙堿類化合物的檢測更具有優(yōu)勢。

本研究對食用菌中8種煙堿類化合物用QuEChERS提取凈化，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行分析研究，具有處理簡便、靈敏度高、重復性好的特點，可滿足食用菌中8種煙堿類化合物的快速測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮食用菌（銀耳、香菇、黑木耳、猴頭菇、口蘑）、屈臣氏純化水 市場。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨（均為色譜純） 美國迪馬公司；可替寧（純度99.8%）、降煙堿（純度98.8%）、新煙堿（純度98.7%）、二烯煙堿（純度99.6%）、去氫新煙堿（純度98.2%）、2,3-聯(lián)吡啶（純度98.7%）、麥斯明（純度99.8%）、尼古丁（純度99.3%）標準品 美國Chromadex公司。

1.2 儀器與設備

QTRAP 5500 LC/MS/MS系統(tǒng)超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配備有電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）、高壓二元泵、自動進樣器、柱溫箱） 美國AB SCIEX公司；ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相A為0.1%甲酸-10 mmol/L乙酸銨溶液、B為乙腈，等度洗脫（A∶B，20∶80，V/V），流速0.3 mL/min，進樣量2 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

采用ESI源，正離子多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式，氣簾氣流速20 L/h，霧化氣流速55 L/h，輔助氣流速55 L/h，輔助加熱氣溫度650 ℃，噴霧電壓5 500 V。去簇電壓80 V，碰撞電壓分別為25 V和35 V。一級全掃描范圍為m/z50～500。

1.3.3 標準溶液制備

精密稱取10 mg各標準物質(zhì)，用乙腈溶解配制成質(zhì)量濃度100 μg/mL的儲備液，貯存于－4 ℃。精密吸取適量的儲備液于容量瓶中，用流動相定容，配成0.03～500 ng/mL系列混合標準工作液。

1.3.4 樣品溶液制備

食用菌子實體，包括菌蓋和菌柄經(jīng)凍干后粉碎混勻，待用。樣品處理參考文獻[5,20]的方法，取樣品0.5 g（精確至0.01 g）置于50 mL試管中加入2 mL去離子水后渦旋2 min混勻樣品，靜置5 min后加入10 mL甲醇（含2%甲酸）渦旋10 min，加入3.0 g氯化鈉至提取溶液然后再渦旋10 min，離心后取上層溶液3 mL至裝有150 mg無水硫酸鎂，50 mg PSA和50 mg C18凈化試劑的試管中。渦旋5 min后離心，取上層溶液至干凈試管中氮吹至干，加入200 μL初始流動相復溶后待測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel（2013版）進行處理計算，色譜優(yōu)化結果采用Origin 9.1作圖處理。

2 結果與分析

2.1 提取條件確定

用體積分數(shù)2%甲酸溶液、水、甲醇、2%甲酸-甲醇溶液、乙腈5種常見提取溶劑，分別超聲提取處理，與QuEChERS方法提取處理比較，然后按色譜、質(zhì)譜條件測定，以測定結果進行評價，結果發(fā)現(xiàn)，2%甲酸溶液和水提取后，很難吹干濃縮，樣品檢測結果小于定量限無法準確定量。

其余包括QuEChERS方法，檢測結果在線性范圍內(nèi)，以測定結果回收率評價，QuEChERS提取測定回收率最高（圖1），同時基質(zhì)效應影響程度最小，綜合評價，最終選定QuEChERS方法。

圖1 不同提取方法回收率測定結果Fig.1 Effect of extraction methods on recoveries of eight nicotine compounds

2.2 色譜質(zhì)譜條件確定

首先考察T3色譜柱，在等度洗脫條件下的結果，以乙腈為流動相B，A相為水相，考察A相體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%和80%條件下8種目標物的保留情況，通過增加水相的初始濃度，二烯煙堿和2,3-聯(lián)吡啶的保留時間逐漸延長，保留能力逐漸增加，但是其他6種目標物的保留能力沒有明顯增加。8種物質(zhì)未能完全分離。

更換為HILIC色譜柱，以等度洗脫條件，A為乙腈，B為水相，考察體積分數(shù)分別為10%、20%、30%、40%和50%條件下目標物的保留能力，與T3色譜柱等度洗脫相比較，在初始水相為10%以上，隨著水相比例增大，大部分目標物有所保留，目標峰保留效果有所改善，最終選擇親水性的HILIC色譜柱，參考文獻[19,25,31]選擇定性定量離子，建立MRM方法，每種化合物選擇1 個定量離子和1 個定性離子。每種化合物的保留時間及定量、定性離子和碰撞能量見表1，不同標準品的選擇離子色譜圖見圖2。

圖2 不同煙堿類化合物標準品的選擇離子色譜圖Fig.2 Selective ion chromatograms of eight nicotine standards

表1 MRM的優(yōu)化條件Table 1 Optimized conditions for multi-reaction ion monitoring

2.3 線性范圍、檢出限和定量限結果

將系列混合標準工作液注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀中，測定相應的峰面積，以標準工作液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標，繪制校準曲線并列出校準曲線的線性方程和線性范圍。如表2所示，本法線性范圍較寬，在3 個數(shù)量級以上，線性相關系數(shù)（R2）大于0.99。

取上述1 ng/mL混合標準工作液0.2 mL加入到0.5 g空白基質(zhì)中，按照1.3.4節(jié)同法處理，逐級稀釋，過濾膜進行分析得出8種化合物的檢出信號，以信噪比為10時對應的檢出量為定量限，信噪比為3時對應的檢出量為檢出限，結果見表2。定量限及檢出限較低，檢出限為0.004～0.04 μg/kg，定量限在0.012～0.12 μg/kg之間，完全滿足食用菌內(nèi)煙堿類化合物測定的量值范圍和最低檢出量。

表2 煙堿類化合物線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear range, linear equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of each nicotine compound

2.4 準確度、精密度和基質(zhì)效應結果

按照樣品處理方法，分別在基質(zhì)中加入3 個水平8種成分的標準物質(zhì)溶液，配制低（0.5 μg/kg）、中（2 μg/kg）、高含量（10 μg/kg）供試品溶液，各含量平行配制6 份，根據(jù)標準曲線計算含量，計算加標回收率，結果見表3。8種煙堿類化合物的回收率在78.7%～107.8%之間，說明本法準確度高。

表3 煙堿類化合物加標回收率、基質(zhì)效應和精密度（n =6）Table 3 Spiked recoveries, matrix effect and precision of each nicotine compound (n = 6)

按照樣品處理方法，分別在基質(zhì)中加入8種成分3 個水平的標準物質(zhì)溶液，配制低（0.5 μg/kg）、中（2 μg/kg）、高含量（10 μg/kg）供試品溶液，每個水平平行配制6 份樣品，分別于當日連續(xù)測定3 次和3 d內(nèi)分別測定，代入當日標準曲線計算含量及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表3。本法的日內(nèi)精密度為1.8%～10.3%，日間精密度在2.8%～11.1%之間。本法基質(zhì)效應在81.5%～106.6%之間，說明用本方法處理的樣品溶液在本儀器上測定，基質(zhì)效應很小。

2.5 樣品測定

隨機抽取5 份市場購買的銀耳等5種食用菌，按照本實驗建立的QuEChERS方法處理后，采用本實驗所建立方法檢測，計算樣品含量，結果見表4。5種食用菌中能檢出除去氫煙堿外7種煙堿類化合物，本研究所建立方法完全能夠滿足真實樣品的測定。食用菌樣品中含量最高的為黑木耳中尼古?。ǎ?0.301±0.634）μg/kg）。目前尚未有食用菌中8種煙堿類化合物成分的檢測報道，只有研究測定部分食用菌中尼古丁含量，有報道牛肝菌中尼古丁含量為0.038～1.011 mg/kg，羊肚菌中尼古丁含量為0.009～0.561 mg/kg，姬松茸中尼古丁含量為0.011～0.725 mg/kg，松茸中尼古丁含量為0.002～0.216 mg/kg[20]。本研究測定結果與文獻報道基本在相同水平范圍內(nèi)。

3 討論與結論

色譜條件優(yōu)化時，比較水-乙腈流動相梯度洗脫和50%～10%起始不同梯度等度洗脫，觀察目標峰分離程度，最終選擇本實驗的等度洗脫條件。

本實驗建立檢測食用菌中8種煙堿類物質(zhì)的QuEChERS-高效液相色譜-質(zhì)譜檢測方法，定量限和檢出限分別在0.012～0.12 μg/kg和0.004～0.04 μg/kg之間，8種煙堿類化合物的回收率在78.7%～107.8%之間，日內(nèi)精密度和日間精密度分別為1.8%～10.3%和2.8%～11.1%，符合殘留分析要求。本方法簡便、快速、準確、靈敏、分析時間短，完全滿足對食用菌中尼古丁等內(nèi)源性物質(zhì)的檢測。

目前鮮見同時檢測食用菌中8種煙堿類化合物的報道，并且無法同時檢測多種生物堿[23,31]，本實驗建立了能夠同時檢測食用菌中8種煙堿類生物堿的方法，經(jīng)5種食用菌檢測驗證，完全能夠滿足檢測需求。文獻報道的食用菌中煙堿類含量與本方法檢測結果相近。QuEChERS-高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術目前逐步應用于食品微量物質(zhì)檢測，本方法克服了分光光度法、液相色譜紫外檢測器、毛細管電泳檢測過程繁瑣、準確度差、檢出限不能滿足需求的缺點，既簡化了前處理步驟，又在保證準確度的前提下，提高了靈敏度和專屬性。