聚乙二醇修飾β-乳球蛋白羧基對其抗原性和結(jié)構(gòu)的影響

羅舜菁，吉 莉，熊紹百，鐘俊楨，朱曉明，江辛琳，劉成梅,

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西省輔食營養(yǎng)食品工程技術(shù)研究中心，江西 贛州 341000）

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是牛乳中主要的過敏原之一[1]，降低其致敏性對牛乳過敏人群十分必要。在針對致敏性的研究中，化學(xué)方法如糖基化[2-3]、磷酸化[4]、PEG化[5]是目前國際乳制品加工研究的熱點。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾也稱PEG化，是將活化的PEG分子通過共價鍵偶聯(lián)到蛋白質(zhì)或者多肽上，從而改變其理化性質(zhì)的一種方法。由于無毒、無免疫原性、生物相容性良好[6]，PEG已經(jīng)用于多種蛋白質(zhì)和多肽藥物的修飾，以降低其免疫原性，降低酶解速度，延長半衰期，保持生物活性[7-10]。研究發(fā)現(xiàn)PEG鏈在氨基酸序列上的位置以及每個蛋白質(zhì)分子上連接的PEG數(shù)目對偶聯(lián)物的性質(zhì)均有很大影響[11]。

本課題組前期分別針對β-LG的N-末端氨基，谷氨酰胺殘基（Gln）及游離巰基進行PEG修飾，探究不同修飾位點對β-LG抗原性的影響，發(fā)現(xiàn)不同位點修飾后β-LG的抗原性變化大相徑庭，N-末端和Gln修飾后抗原性顯著降低[12-13]，對游離巰基修飾后則表現(xiàn)為抗原性大幅度升高[14]，而目前關(guān)于羧基修飾對β-LG抗原性影響的研究鮮見報道。β-LG具有多個游離羧基，是進一步探究PEG化程度對抗原性影響的理想基團。但由于羧基數(shù)目較多，控制PEG化程度難度大，且修飾產(chǎn)物難以分離純化，給相關(guān)研究造成了極大困難。本研究在前期制備獲得β-LG羧基單點和兩點修飾產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，使用SP Sepharose Fast Flow陽離子交換柱對修飾產(chǎn)物分離純化，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）進行鑒定，間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）表征抗原性變化，游離巰基含量、內(nèi)源熒光光譜、外源熒光光譜及圓二色譜表征結(jié)構(gòu)變化，以探究PEG修飾和PEG化程度對β-LG抗原性和結(jié)構(gòu)的影響以及二者間的關(guān)系，為調(diào)控β-LG的抗原性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛β-LG、豬明膠 美國Sigma公司；單甲氧基聚乙二醇酰肼（methoxypoly (ethylene glycol) hydrazide，mPEG-Hz，5 kDa） 北京鍵凱科技股份有限公司；BCA蛋白試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG二抗 北京索萊寶科技有限公司；兔抗β-LG IgG一抗、單組分超靈敏TMB顯色液 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；1-乙基-3-二甲氨基丙基碳二亞胺鹽酸鹽（N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽（N-hydroxysulfosucciniimide sodium，sulfo-NHS）北京阿拉丁生化科技股份有限公司；所有試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini-PROTEAN小型垂直電泳儀、NGC Quest 10 Plus中高壓柱層析系統(tǒng)、Enrich SEC70 10 mm×300 mm凝膠柱 美國Bio-Rad公司；SP Sepharose Fast Flow色譜柱美國GE公司；Five Easy Plus pH計、ME104型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Heraeus Multifuge X1R型冷凍離心機 美國Thermo公司；Amico U1tra-15超濾離心管 美國Millipore公司；MOS 405型圓二色譜儀 法國Bio-Logic公司；F-7000熒光分光光度計日本Hitachi公司；Synergy H1酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；4800 Plus MALDI-TOF/TOFTMAnalyzer質(zhì)譜儀美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 修飾產(chǎn)物的制備

羧基修飾的原理如下：

在弱酸性條件下，β-LG的氨基質(zhì)子化，mPEG-Hz由于具有較低的解離常數(shù)（pKa），在EDC和sulfo-NHS的活化和助活化作用下會與蛋白質(zhì)羧基選擇性交聯(lián)[15]。將β-LG溶于磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.0），質(zhì)量濃度為2 mg/mL，按照β-LG、EDC、sulfo-NHS物質(zhì)的量比為1∶50∶10，依次加入EDC和sulfo-NHS，混合均勻后按照β-LG與PEG物質(zhì)的量比為1∶20加入mPEG-Hz（5 kDa），置于4 ℃反應(yīng)過夜。

1.3.2 SDS-PAGE分析

配制12%分離膠及5%濃縮膠，取30 μL反應(yīng)混合物與10 μL 4×上樣緩沖液（含二硫蘇糖醇）混合，煮沸5～10 min后離心1～2 min，取上清液10 μL加入樣品孔，以80 V電壓跑濃縮膠15 min，隨后以120 V的電壓跑分離膠，待溴酚藍條帶至底部時停止電泳，取出膠條于考馬斯亮藍染色液中染色1 h后脫色至蛋白條帶清晰。

1.3.3 陽離子交換色譜分析

參考Zhong Junzhen等[5]的方法，使用SP Sepharose Fast Flow陽離子交換柱對修飾產(chǎn)物分離純化。使用3 倍柱體積的醋酸鈉緩沖液（0.04 mol/L，pH 4.0）對離子柱平衡后上樣，使用含1.0 mol/L NaCl的醋酸鈉緩沖液（0.04 mol/L，pH 4.0）0%～100%對樣品線性梯度洗脫150 min，流速2 mL/min，在280 nm波長處測定吸光度。產(chǎn)物的修飾率通過層析系統(tǒng)自帶軟件計算，計算如式（1）所示：

1.3.4 凝膠過濾色譜分析

使用Enrich SEC70 10 mm×300 mm凝膠柱對修飾產(chǎn)物純度進行分析。使用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 7.0）平衡凝膠柱，待基線水平且電導(dǎo)率保持不變后，上樣0.2 mL進行洗脫，流速1 mL/min，于280 nm波長處檢測吸光度。

1.3.5 MALDI-TOF-MS分析

使用4800 Plus MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀對修飾前后β-LG的分子質(zhì)量進行分析鑒定。取1 μL樣品點至樣品靶上自然干燥，再取1 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶液點至對應(yīng)靶位上自然干燥，同樣的方法在相鄰靶位上點校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品（4700 Proteomics Analyzer Calibration Mixture 1）。采用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品進行外標(biāo)一級校準(zhǔn)，波長349 nm，電壓2 kV，在正離子，線性模式下進行檢測，掃描范圍5 000～50 000 Da，質(zhì)量誤差小于0.5 Da，數(shù)據(jù)通過軟件Data Explorer V4.5進行分析。

1.3.6 抗原性分析

參考Meng Xuanyi等[16]的方法，用間接競爭ELISA法對修飾產(chǎn)物與抗體的結(jié)合能力進行分析測定，通過半抑制濃度（IC50）表征產(chǎn)物抗原性變化。1）包被：在96 孔酶標(biāo)板中每孔加入100 μLβ-LG（2.5 μg/mL）作為包被抗原，4 ℃過夜；2）封阻：次日用含0.05% Tween 20的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline Tween-20，PBST）重復(fù)洗滌扣干3 次，每孔加入250 μL 1%豬明膠進行封阻，37 ℃孵育1 h；3）競爭抑制：另一酶標(biāo)板以同一方法封阻，洗滌后每孔分別加入60 μL不同質(zhì)量濃度（0.1、2.5、5、10、15、25、50 μg/mL）的競爭抗原（mono-PEG-β-LG、di-PEG-β-LG、未修飾β-LG）和等體積兔抗β-LG IgG一抗（1∶35 000稀釋），用PBST代替競爭抗原作空白對照，37 ℃孵育1 h，每孔取100 μL轉(zhuǎn)移至第一塊板內(nèi)進行競爭，37 ℃孵育1 h；4）二抗反應(yīng)：洗滌扣干后每孔加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG酶標(biāo)二抗（1∶5 000稀釋）100 μL，37 ℃孵育1 h；5）顯色終止：洗滌后每孔加100 μL單組分TMB顯色液，37 ℃避光25 min后加入等體積終止液終止反應(yīng)；6）檢測計算：5 min后于450 nm波長處檢測OD值。以修飾產(chǎn)物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，計算IC50值，表征修飾產(chǎn)物抗原性變化。抑制率計算如式（2）所示：

式中：B為競爭抗原對應(yīng)的OD值；B0為空白對照孔的OD值。

1.3.7 游離巰基含量分析

使用Ellmans’ DTNB法[17]對修飾前后樣品的游離巰基含量進行測定。取1 mL待測蛋白溶液（1.0 mg/mL）加入到4 mL Tris-Gly緩沖溶液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、5 mmol/L EDTA，pH 8.0）中，加入50 μL Ellmans’試劑（4 mg/mL），37 ℃反應(yīng)20 min后使用Synergy H1酶標(biāo)儀于412 nm波長處檢測吸光度。游離巰基含量計算如式（3）所示：

式中：A412nm為樣品在412 nm處的吸光度；D為稀釋倍數(shù)；C為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.8 表面疏水性分析

以1-氨基萘-8-磺酸（1-anilinonaphthalene-8-sulfonate，ANS）為熒光探針，使用熒光分光光度計對修飾前后β-LG的表面疏水性進行分析。PBS溶液（10 mmol/L，pH 7.0）稀釋樣品至0.1 mg/mL，取4 mL樣品與20 μL ANS（8 mmol/L）混合，避光反應(yīng)5～10 min，激發(fā)波長370 nm，發(fā)射波長400～600 nm，狹縫寬度5 nm，掃描速率1 200 nm/min，以PBS替代樣品作空白對照。

1.3.9 內(nèi)源熒光光譜分析

使用熒光分光光度計分析修飾前后β-LG內(nèi)源熒光強度的變化。10 mmol/L PBS溶液（pH 7.0）稀釋樣品至0.1 mg/mL，激發(fā)波長為280 nm，掃描發(fā)射波長范圍300～450 nm，狹縫寬度2.5 nm，掃描速率1 200 nm/min，重復(fù)掃描3 次。

1.3.10 圓二色譜分析

使用圓二色譜儀對修飾產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)組成及含量進行分析。樣品質(zhì)量濃度0.1 mg/mL，使用石英比色皿于25 ℃在氮氣環(huán)境下檢測，掃描范圍190～250 nm，步進分辨率1 nm，譜帶寬度1 nm，掃描速率100 nm/min，重復(fù)掃描3 次。通過在線網(wǎng)站Dichroism Website分析擬合圓二圖譜并計算二級結(jié)構(gòu)相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Origin 8.5軟件作圖，SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)顯著性（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物分離純化及修飾率檢測

等電點是離子交換層析的重要依據(jù)。β-LG分子質(zhì)量為18.3 kDa，等電點在5.1～5.3之間[18]，在醋酸鈉（40 mmol/L，pH 4.0）緩沖體系中帶正電，與帶負電的陽離子交換樹脂結(jié)合。使用含1.0 mol/L NaCl的醋酸鈉緩沖液（40 mmol/L，pH 4.0）在0%～100%進行線性梯度洗脫，結(jié)果如圖1A所示，得到3 個明顯的洗脫峰F1、F2和F3。帶正電的β-LG與不帶電的PEG分子結(jié)合減弱了蛋白質(zhì)與吸附表面之間的靜電作用，使其與離子柱結(jié)合能力降低，PEG化程度越高，結(jié)合能力越弱[19]，洗脫所需的鹽濃度越低，因而PEG修飾產(chǎn)物先于未修飾的β-LG被洗脫。推測峰F1和F2為兩種修飾產(chǎn)物的洗脫峰，且F1的PEG化程度高于F2，F(xiàn)3為未修飾的β-LG。

圖1 PEG修飾混合物的陽離子交換色譜圖（A）和純化得到的各洗脫峰SDS-PAGE圖（B）Fig.1 Cation exchange chromatogram of PEGylation mixture (A) and SDS-PAGE analysis of elution peaks obtained from purification (B)

本研究采用的mPEG-Hz會在EDC和sulfo-NHS的助活化作用下與蛋白質(zhì)羧基選擇性交聯(lián)。收集洗脫峰進行SDS-PAGE分析，如圖1B所示，峰F3位于18 kDa左右，與β-LG分子質(zhì)量相同，保留時間最短的峰F1在34～43 kDa之間有一條帶，F(xiàn)2在26～34 kDa之間有一條帶，修飾后β-LG分子質(zhì)量顯著增加，通過層析系統(tǒng)自帶軟件分析，產(chǎn)物的總修飾率為82.91%。

2.2 修飾產(chǎn)物純度分析

因F1和F2未完全分開，分別大量收集F1峰前及F2峰后，用截留分子質(zhì)量10 kDa的Amico Ultra-15超濾離心管于4 ℃、6 000 r/min離心20 min，用10 mmol/L PBS（pH 7.0）對樣品中溶液進行置換。利用凝膠柱的分子篩作用，各物質(zhì)按照分子質(zhì)量遞減順序洗脫，對修飾產(chǎn)物純度進行鑒定。如圖2所示，兩種產(chǎn)物的洗脫峰均窄而尖，峰F1的濃縮樣品純度高達98.61%（圖2A），峰F2的濃縮樣品純度高達99.66%（圖2B），表明成功制備純度均在95%以上的兩種PEG修飾產(chǎn)物。

圖2 PEG修飾產(chǎn)物的凝膠過濾色譜圖Fig.2 Gel filtration chromatogram of PEGylation products

2.3 修飾產(chǎn)物的鑒定

2.3.1 SDS-PAGE分析

大量收集兩種修飾產(chǎn)物并濃縮，稀釋4 倍后進行SDS-PAGE分析。如圖3所示，泳道2和3分別在26～34 kDa之間和34～43 kDa之間具有一條明顯的條帶，表明陽離子交換柱分離效果較好。

圖3 PEG修飾產(chǎn)物的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of PEGylation products

溶液中PEG分子的乙氧基會結(jié)合水分子，使PEG修飾產(chǎn)物的流體力學(xué)體積增大，因而修飾產(chǎn)物的表觀分子質(zhì)量是未修飾蛋白的分子質(zhì)量與2.5 倍PEG分子質(zhì)量之和[20]，泳道2的表觀分子質(zhì)量是β-LG分子質(zhì)量與單個2.5 倍PEG分子質(zhì)量（5 kDa）之和，泳道3對應(yīng)的是β-LG分子質(zhì)量與兩個2.5 倍PEG分子質(zhì)量（5 kDa）之和，表明泳道2（峰F2）和3（峰F1）分別為mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG。

2.3.2 MALDI-TOF-MS分析

為進一步鑒定兩種修飾產(chǎn)物，使用MALDI-TOF-MS對β-LG及修飾產(chǎn)物的實際分子質(zhì)量進行測定。

如圖4所示，β-LG標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量為18.3 kDa（圖4A），兩種修飾產(chǎn)物的分子質(zhì)量分別為23.3 kDa（β-LG分子質(zhì)量與一個PEG分子質(zhì)量之和）和28.6 kDa（β-LG分子質(zhì)量與兩個PEG分子質(zhì)量之和），進一步證明純化得到的PEG修飾產(chǎn)物為mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG。

圖4 PEG修飾產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS圖Fig.4 MALDI-TOF-MS analysis of PEGylation products

2.4 抗原性檢測結(jié)果

在間接競爭ELISA中，使用IC50值表征修飾產(chǎn)物與抗體的結(jié)合能力，IC50值越高，表明達到IC50值所需競爭抗原越多，即競爭抗原與抗體的結(jié)合能力越弱，修飾產(chǎn)物抗原性越弱[21]。如圖5所示，β-LG的IC50值最低，為1.90 μg/mL，mono-PEG-β-LG的IC50值為2.47 μg/mL，是β-LG的1.30 倍，而di-PEG-β-LG高達10.41 μg/mL，為β-LG的5.48 倍，表明PEG修飾后β-LG的抗原性顯著降低，且提高PEG化程度可以極顯著降低其抗原性。

圖5 PEG修飾產(chǎn)物的抗原性變化圖Fig.5 Changes in antigenicity of PEGylation products

研究表明，β-LG的抗原性取決于線性致敏表位和構(gòu)象致敏表位，而致敏表位與結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)[22]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，游離巰基修飾后β-LG抗原性升高的可能原因是由于結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致新致敏表位形成[14]，而N-末端及Gln修飾后抗原性降低的可能原因是PEG分子遮蔽了β-LG抗原性表位[12,23]。為明確羧基修飾后β-LG抗原性降低的原因，實驗需對修飾產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)變化進行分析。

2.5 游離巰基含量分析

巰基對維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)意義重大，每個β-LG單體含有5 個半胱氨酸殘基（Cys），其中Cys66和Cys160、Cys106和Cys160分別形成兩個二硫鍵，而游離巰基Cys121包埋于分子內(nèi)部[24]。修飾產(chǎn)物游離巰基含量如圖6所示，PEG修飾后，β-LG的游離巰基含量由52.54 μmol/g分別下降至42.70 μmol/g（mono-PEG-β-LG）和37.97 μmol/g（di-PEG-β-LG）。由于PEG鏈具有空間屏蔽作用[25]，可能會對Cys121造成遮蔽，PEG化程度越高，遮蔽作用越強，檢測到的游離巰基含量越低，抗原性降低越顯著。

圖6 PEG修飾產(chǎn)物的游離巰基含量分析Fig.6 Free sulfhydryl content analysis of PEGylation products

2.6 表面疏水性分析

表面疏水性與蛋白質(zhì)的構(gòu)象、穩(wěn)定性及抗原性變化密切相關(guān)[26]。以ANS為熒光探針，通過與蛋白質(zhì)表面暴露的疏水性氨基酸結(jié)合表征表面疏水性變化[16]。如圖7所示，β-LG的最大熒光強度為1 821，兩種修飾產(chǎn)物熒光強度分別為2 067和2 114，表明PEG修飾后β-LG的表面疏水性增強，且di-PEG-β-LG略高于mono-PEG-β-LG。

圖7 PEG修飾產(chǎn)物的表面疏水性分析Fig.7 Surface hydrophobicity analysis of PEGylation products

β-LG分子內(nèi)部具有大量疏水性氨基酸[27]，在PEG結(jié)合過程中，β-LG三級結(jié)構(gòu)展開，包埋于分子內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露于極性溶液中，使ANS與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力提高[28]，導(dǎo)致表面疏水性增強；另一方面，PEG鏈具有很強的遮蔽作用[19]，因此表現(xiàn)為mono-PEG-β-LG與di-PEG-β-LG表面疏水性沒有顯著區(qū)別。

2.7 內(nèi)源熒光光譜分析

在內(nèi)源熒光光譜分析中，常以色氨酸（Trp）為熒光探針，通過描述其所處微環(huán)境考察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。修飾后β-LG內(nèi)源熒光光譜變化如圖8所示，β-LG在333 nm波長處最大內(nèi)源熒光強度為2 495，mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG的內(nèi)源熒光強度分別為2 382和2 340，隨PEG化程度的升高，修飾產(chǎn)物熒光強度降低，最大發(fā)射波長未發(fā)生明顯紅移或藍移。

圖8 PEG修飾產(chǎn)物的內(nèi)源熒光光譜分析Fig.8 Intrinsic fluorescence spectra of PEGylation products

研究表明，位于疏水環(huán)境中的Trp暴露于極性溶劑中會發(fā)生熒光猝滅[29]，因此PEG的接入可能導(dǎo)致β-LG的三級結(jié)構(gòu)展開，分子內(nèi)部19Trp和61Trp暴露于溶劑中[30]，使熒光強度降低。mono-PEG-β-LG與di-PEG-β-LG的熒光強度沒有顯著區(qū)別，可能是由于盡管后者Trp暴露更多，但多個PEG鏈的屏蔽作用導(dǎo)致熒光強度變化不大。三級結(jié)構(gòu)展開造成構(gòu)象表位破壞，以及PEG的空間位阻效應(yīng)導(dǎo)致修飾產(chǎn)物抗原性降低。

2.8 二級結(jié)構(gòu)分析

通過圓二色譜分析PEG修飾對β-LG二級結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖9所示。β-LG是一個以β-折疊為主的蛋白，8 條反向平行的β-折疊在蛋白疏水內(nèi)部形成桶狀結(jié)構(gòu)，桶外是一條具有3 個β-轉(zhuǎn)角的α-螺旋和第9條β-折疊鏈[31]。192 nm波長處的正吸收峰、208 nm和222 nm波長附近的負吸收峰是α-螺旋的顯著特征；190～200 nm波長處的正譜帶及216～218 nm波長處的負峰是β-折疊的顯著特征。

圖9 PEG修飾產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)變化Fig.9 Circular dichroism spectra of PEGylation products

如表1所示，與未修飾的β-LG相比，mono-PEG-β-LG的二級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生顯著變化；而di-PEG-β-LG的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表現(xiàn)為α-螺旋相對含量顯著降低，無規(guī)卷曲相對含量顯著升高，說明在di-PEG-β-LG形成過程中β-LG的二級結(jié)構(gòu)展開，構(gòu)象致敏表位破壞程度加劇。

表1 PEG修飾產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)相對含量變化Table 1 Changes in secondary structure contents in PEGylated products%

3 結(jié) 論

采用mPEG-Hz（5 kDa）對β-LG羧基共價修飾，制備不同PEG化程度的產(chǎn)物，總修飾率為82.91%。對修飾產(chǎn)物進行分離純化，獲得純度分別為99.66%和98.61%兩種主要修飾產(chǎn)物；SDS-PAGE及MALDI-TOF-MS鑒定產(chǎn)物分子質(zhì)量分別為23.3 kDa和28.6 kDa，表明修飾產(chǎn)物分別為mono-PEG-β-LG及di-PEG-β-LG。

β-LG、mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG的IC50分別為1.90、2.47 μg/mL和10.41 μg/mL，mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG的IC50值分別是β-LG的1.30 倍和5.48 倍，表明羧基修飾后β-LG的抗原性顯著降低，且提高PEG化程度可以極顯著降低β-LG的抗原性。兩種修飾產(chǎn)物的游離巰基含量分別為42.70 μmol/g和37.97 μmol/g，表明隨著PEG化程度增強，結(jié)合的PEG分子增多，遮蔽作用增強；相比于mono-PEG-β-LG僅發(fā)生三級結(jié)構(gòu)的變化，di-PEG-β-LG的二級結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化（α-螺旋相對含量顯著降低，無規(guī)卷曲相對含量顯著升高），表明隨著PEG化程度增強，β-LG的空間結(jié)構(gòu)改變，可能導(dǎo)致構(gòu)象表位破壞加劇。在PEG分子的遮蔽和空間位阻效應(yīng)以及構(gòu)象致敏表位破壞兩重作用下，di-PEG-β-LG的抗原性發(fā)生了極顯著的降低。

因此后續(xù)研究可以通過以下兩種方法進一步降低β-LG的抗原性：1）通過條件優(yōu)化等方法提高PEG化程度，增強對線性致敏表位的遮蔽及空間位阻作用；2）使用物理化學(xué)等方法改變β-LG結(jié)構(gòu)，加劇破壞構(gòu)象致敏表位。為深入探究β-LG抗原性變化的機理，還需對PEG結(jié)合位點進行分析鑒定，明晰抗原性變化與結(jié)構(gòu)變化，結(jié)合位點之間的關(guān)系。