蛇膽川貝液中蛇膽汁的摻偽篩查與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)商榷

劉德麗，馬斐，張艷紅，張靜，任菲菲

(德州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 德州 253015)

蛇膽川貝液為祛痰止咳類非處方藥，其主要成份為蛇膽汁和平貝母，輔料為杏仁水、薄荷腦和防腐劑等，用于風(fēng)熱咳嗽，痰多氣喘，胸悶，咳嗽不爽或久咳不止。經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局?jǐn)?shù)據(jù)查詢系統(tǒng)查詢，蛇膽川貝液共有138個(gè)生產(chǎn)廠家，遍布湖北、廣西、吉林、江西、山東等十多個(gè)省份。近年來(lái)不同廠家蛇膽川貝液多次出現(xiàn)在藥品質(zhì)量公告不合格名單中，同時(shí)經(jīng)市場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)不同廠家產(chǎn)品售價(jià)在幾元到幾十元不等，價(jià)格差異懸殊，提示其原料質(zhì)量或生產(chǎn)工藝存在較大差別。

蛇膽汁具有止咳化痰、疏風(fēng)定痛的功效，是蛇膽川貝液中的主藥，其原料的優(yōu)劣和投料量直接影響成藥的療效。蛇膽汁雖然臨床應(yīng)用廣泛、歷史悠久，但目前尚無(wú)統(tǒng)一的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，《中國(guó)藥典》2020年版一部未收載蛇膽汁的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，僅在四部[1]“成方制劑中本版藥典未收載的藥材和飲片”中指出“蛇膽汁為眼鏡蛇科、游蛇科或蝰科動(dòng)物多種蛇的膽汁”；湖南、甘肅、江西、安徽、福建等省地方藥材標(biāo)準(zhǔn)有收載，但其名稱、來(lái)源、質(zhì)量控制指標(biāo)和項(xiàng)目不同[2-6]。由于資源稀缺、價(jià)格昂貴、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，導(dǎo)致市售蛇膽汁藥材來(lái)源復(fù)雜，亦存在以豬、牛、羊等其他動(dòng)物膽汁摻偽入藥的現(xiàn)象，而不同動(dòng)物膽汁的化學(xué)成分和藥理作用存在較大差異[7]，不宜替代混用。針對(duì)這一現(xiàn)狀，國(guó)內(nèi)外學(xué)者[8-15]進(jìn)行了大量研究，其中馬婷婷等[13]對(duì)安徽安科余良卿藥業(yè)有限公司提供的12批蛇膽汁及豬、牛、羊兔四種動(dòng)物膽汁進(jìn)行研究，薄層色譜顯示12批蛇膽汁均檢出與牛磺膽酸鈉對(duì)照品相應(yīng)的斑點(diǎn)，各批蛇膽汁在一定Rf值范圍內(nèi)差異明顯，與蛇膽汁對(duì)照藥材在斑點(diǎn)顏色和亮度上均有差異；12批蛇膽汁均含有?；且宜?，豬、牛、羊、兔膽汁中未檢出此種物質(zhì)；豬膽汁中檢出甘氨豬去氧膽酸(GHDCA)，蛇膽汁中未檢出。陳家春團(tuán)隊(duì)[14-15]對(duì)44批自采蛇膽汁、3批商品蛇膽汁及24批常見(jiàn)摻偽動(dòng)物膽汁進(jìn)行成分分析與比較，發(fā)現(xiàn)豬膽汁中含有大量GHDCA，而蛇膽汁中未檢出；牛、羊膽汁成分相似，含有較多的?；悄懰岷透拾比パ跄懰?，二者含量之比在1∶1.14～29.26之間；蛇膽汁中?；悄懰岷扛摺⒏拾比パ跄懰岷康?，二者含量之比大于6 156∶1?？衫靡陨喜町悓?duì)蛇膽汁和其他動(dòng)物膽汁進(jìn)行鑒別。

蛇膽川貝液現(xiàn)執(zhí)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-1832-94-2016[16]，檢驗(yàn)項(xiàng)目包括性狀，平貝母、蛇膽汁的薄層鑒別，裝量、相對(duì)密度、pH值等常規(guī)檢查項(xiàng)，氫氰酸、?；悄懰岬暮繙y(cè)定，項(xiàng)目比較完善，但是缺少蛇膽汁專屬性指標(biāo)的檢測(cè)。因此，本研究采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)蛇膽川貝液中的蛇膽汁是否存在其他動(dòng)物膽汁摻偽進(jìn)行篩查，同時(shí)對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)提出合理化建議，以期為更加科學(xué)有效的控制藥品質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(TSQ Quantum Access MAX，賽默飛世爾科技有限公司)，電子分析天平(XS105DU，德國(guó)梅特勒-托利多公司)，自動(dòng)液液萃取儀(STC-302A，濟(jì)南盛泰科技有限公司)。

1.2 試藥

甘氨去氧膽酸(GDCA)對(duì)照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：wkq20070808，含量：98.0%)；甘氨豬去氧膽酸對(duì)照品 (四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：wkq20050711，含量：98.0%)；?；悄懰徕c對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110815-201911，含量：87.3%)；蛇膽汁對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：120938-201707)。乙腈、甲醇為色譜純，購(gòu)自默克化工技術(shù)有限公司；冰乙酸、乙酸銨為色譜純，購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；水為娃哈哈瓶裝飲用純凈水；其他試劑均為分析純。蛇膽川貝液樣品共35批，來(lái)自13個(gè)生產(chǎn)廠家，見(jiàn)表3。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 供試品溶液[16]精密量取本品20 mL，用乙醚振搖提取2次(20 mL、15 mL)，水液備用，合并乙醚液，用水洗滌2次，每次5 mL，分別分取水液，與備用水液合并，置水浴上蒸至無(wú)醚味，通過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱(內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為10 cm)，用水200 mL洗脫，棄去水液，再用乙醇60 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液 實(shí)驗(yàn)室前期檢驗(yàn)結(jié)果表明，35批蛇膽川貝液樣品中?；悄懰岷烤陀?00 μg/mL，其中1批樣品含量為11 μg/mL，不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(不得少于105 μg/mL)，其余34批樣品含量均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。根據(jù)文獻(xiàn)資料[14-15]計(jì)算得樣品中GDCA含量應(yīng)低于50 ng/mL,按1.2.1制備的供試品溶液中GDCA的濃度應(yīng)低于200 ng/mL，因此按如下濃度進(jìn)行對(duì)照品溶液的配制。分別稱取GHDCA對(duì)照品10.17 mg、 GDCA對(duì)照品10.08 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。臨用前精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL置200 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得工作溶液。精密量取上述工作溶液2.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL分別置5 mL、10 mL、20 mL、50 mL、100 mL量瓶中，用甲醇稀釋制成GHDCA濃度為199.3、99.67、49.83、19.93、9.967 ng/mL，GDCA濃度為197.6、98.78、49.39、19.76、9.878 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(150 mm×3.0 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨水溶液(用冰乙酸調(diào)至PH 4.0)、流動(dòng)相B為乙腈∶甲醇(1∶3)[11-13]，按表1梯度進(jìn)行洗脫。0～10 min的色譜柱洗脫液由六通閥切換至廢液，10～15 min進(jìn)質(zhì)譜檢測(cè)。

表1 流動(dòng)相梯度

2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；毛細(xì)管電壓：-3 000 V；蒸發(fā)溫度：300℃；鞘氣：30 units；輔氣：10 units；毛細(xì)管溫度：350℃。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2.4 測(cè)定法

分別取供試品溶液和混合對(duì)照品溶液各10 μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，測(cè)定。

2.5 結(jié)果判斷

以m/z 448.1→73.9、m/z 448.1→386.2和m/z 448.1→368.2提取的供試品離子流圖色譜中，若同時(shí)出現(xiàn)與GHDCA對(duì)照品保留時(shí)間一致(偏差在±5%以內(nèi))的色譜峰，且離子豐度比與濃度相當(dāng)?shù)膶?duì)照溶液的離子豐度比一致，則說(shuō)明存在豬膽汁摻偽。以m/z 448.1→73.9和m/z 448.1→386.2提取的供試品離子流色譜中，若同時(shí)出現(xiàn)與GDCA對(duì)照品色譜保留時(shí)間一致(偏差在±5%以內(nèi))的色譜峰，且供試品中m/z 448.1→73.9的峰面積超過(guò)GDCA對(duì)照品中m/z 448.1→73.9的峰面積，則說(shuō)明存在牛、羊膽汁摻偽。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 檢出限與定量限 精密移取濃度約為10 ng/mL的對(duì)照品，以甲醇為溶劑逐級(jí)稀釋，采用上述方法進(jìn)樣測(cè)定，按S/N≥3計(jì)算檢出限，S/N≥10計(jì)算定量限，則GDCA色譜峰(m/z 448.1→73.9)的檢出限為0.6 ng/mL，定量限為1.9 ng/mL；GHDCA色譜峰(m/z 448.1→386.2)的檢出限為0.3 ng/mL，定量限為0.8 ng/mL。

2.6.2 樣品殘留 在測(cè)定高濃度對(duì)照品(約200 ng/mL)之后，運(yùn)行一針空白溶劑(甲醇)，結(jié)果圖譜中未出現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，表明該方法無(wú)明顯殘留，在分析高濃度樣品后無(wú)需清洗系統(tǒng)即可進(jìn)行后續(xù)樣品的分析。

2.6.3 線性范圍考察 取“2.1.2”項(xiàng)下的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液注入液質(zhì)色譜儀，同一濃度溶液連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄GHDCA中m/z 448.1→386.2離子的峰面積和GDCA中m/z 448.1→73.9的峰面積。分別以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得GHDCA回歸方程：Y=686.79X-208 0.3(R2=0.998 8)，線性范圍為199.3～9.967 ng/mL；GDCA回歸方程：Y=75.524X-473.82(R2=0.999 3)，線性范圍為197.6～9.878 ng/mL。

2.6.4 精密度 取含GHDCA 99.67 ng/mL、GDCA 98.78 ng/mL的混合對(duì)照品溶液，按上述方法測(cè)定，記錄GHDCA中m/z 448.1→386.2離子的峰面積和GDCA中m/z 448.1→73.9的峰面積，計(jì)算其RSD值，分別為1.82%、1.10%，說(shuō)明該法精密度良好。

2.7 試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)，13批樣品檢出GHDCA，說(shuō)明存在豬膽汁摻偽；1批樣品檢出GDCA，且m/z 448.1→73.9的峰面積大于對(duì)照品中m/z 448.1→73.9的峰面積，說(shuō)明存在牛膽汁、羊膽汁摻偽。色譜圖見(jiàn)圖1至圖4，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 混合對(duì)照溶液的液相質(zhì)譜圖圖2 豬膽汁摻偽樣品的液相質(zhì)譜圖圖3 牛、羊膽汁摻偽樣品的液相質(zhì)譜圖圖4 陰性樣品的液相質(zhì)譜圖

表3 非法添加豬膽汁、牛膽汁及羊膽汁的篩查結(jié)果

3 討論

實(shí)驗(yàn)室前期按法定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)35批樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果1批不合格，不合格率為2.9%；而用LC-MS法對(duì)樣品進(jìn)行蛇膽汁摻偽篩查，結(jié)果14批存在其他動(dòng)物膽汁的非法添加，占比40.0%。說(shuō)明現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)不能真實(shí)全面地反映藥品質(zhì)量，亟待提高和完善。

實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行多次試驗(yàn)研究和對(duì)比，發(fā)現(xiàn)法定標(biāo)準(zhǔn)[16]鑒別(1)中的方法存在不足，一是蛇膽汁對(duì)照藥材溶液濃度偏低，經(jīng)點(diǎn)樣、展開(kāi)、顯色后，Rf值小于?；悄懰徕c的斑點(diǎn)不能清晰顯示，見(jiàn)圖5；其他實(shí)驗(yàn)條件不變，增加對(duì)照藥材溶液的點(diǎn)樣量，得到的色譜圖中Rf值小于牛磺膽酸鈉的斑點(diǎn)隱約可見(jiàn)但不夠清晰，且出現(xiàn)拖尾、擴(kuò)散現(xiàn)象，見(jiàn)圖6；其他實(shí)驗(yàn)條件不變，增大對(duì)照藥材溶液的濃度(將標(biāo)準(zhǔn)中“……殘?jiān)訜o(wú)水乙醇4 mL使溶解”改為“……殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL使溶解”)，得到了斑點(diǎn)清晰的色譜圖，見(jiàn)圖7。二是供試品溶液顯示的斑點(diǎn)較多，且部分斑點(diǎn)分布集中，不易觀察，后期與LC-MS結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)摻偽樣品(圖5中樣品1、6，圖7中樣品1、4、5)和未摻偽樣品(圖5中樣品2、3、4、5、7，圖7中樣品2、3)的薄層斑點(diǎn)無(wú)明顯差異。此外薄層色譜法的試驗(yàn)結(jié)果容易受環(huán)境溫濕度、操作人員熟練程度等因素的影響，重現(xiàn)性較差，對(duì)于性質(zhì)相似的組分不易區(qū)分和鑒別。

S.?；悄懰徕c對(duì)照品 YC.蛇膽汁對(duì)照藥材溶液

1.點(diǎn)樣量5 μL 2、3.點(diǎn)樣量10 μL 4.點(diǎn)樣量15 μL

S:牛磺膽酸鈉對(duì)照品 YC:蛇膽汁對(duì)照藥材溶液

由表3數(shù)據(jù)可知13家企業(yè)中有5家企業(yè)的樣品生產(chǎn)過(guò)程中使用了摻偽的蛇膽汁，包括A企業(yè)5批，C企業(yè)4批，B企業(yè)2批，D企業(yè)2批，M企業(yè)1批。對(duì)于樣品量3批及以上的企業(yè)進(jìn)行摻偽率統(tǒng)計(jì)，則A、B、C、D、E企業(yè)樣品的摻偽率分別為：45.5%、50.0%、100.0%、50.0%、0.0%。說(shuō)明蛇膽汁摻偽不是偶然現(xiàn)象，是由于部分企業(yè)對(duì)原料質(zhì)量的把控能力差或者把控不嚴(yán)格造成的。蛇膽汁原料質(zhì)量的優(yōu)劣也決定了其產(chǎn)品售價(jià)的差異。

4 小結(jié)

蛇膽汁自古以來(lái)就是一味名貴稀缺的中藥，以其為原料的蛇膽川貝液、蛇膽川貝散、牛黃蛇膽川貝液等中成藥臨床應(yīng)用廣泛，但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均無(wú)針對(duì)蛇膽汁專屬性成分的檢測(cè)項(xiàng)目。隨著檢驗(yàn)儀器的不斷發(fā)展和檢驗(yàn)技術(shù)的日益完善，專家學(xué)者對(duì)蛇膽汁及其制劑的研究逐步深入。本研究采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蛇膽川貝液中的蛇膽汁進(jìn)行摻偽篩查，結(jié)果顯示市售蛇膽川貝液質(zhì)量參差不齊，不同廠家產(chǎn)品存在明顯的質(zhì)量差異，多個(gè)廠家存在其他動(dòng)物膽汁偽充蛇膽汁入藥的情況，尤其是用豬膽汁摻偽的情況嚴(yán)重，應(yīng)予以關(guān)注。蛇膽川貝液現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[16]鑒別(1)中的薄層色譜法可判斷蛇膽汁是否投料，但不能有效篩查是否存在摻偽情況，此外根據(jù)本研究結(jié)果建議增大蛇膽汁對(duì)照藥材溶液的濃度以得到清晰的薄層色譜圖；含量測(cè)定項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)牛磺膽酸不是蛇膽汁的特有成分，其含量亦不能反映產(chǎn)品的真實(shí)質(zhì)量，因此針對(duì)蛇膽汁進(jìn)行質(zhì)量控制的檢驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)予以修訂提高，建議增加雜膽汁的摻偽篩查方法，建立多元化質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。監(jiān)管及相關(guān)技術(shù)部門(mén)應(yīng)對(duì)企業(yè)加強(qiáng)監(jiān)督和跟蹤調(diào)查，同時(shí)為企業(yè)提供必要的技術(shù)支持，督促其從源頭把控藥品質(zhì)量。