基于氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定梔子飲片中農(nóng)藥殘留

劉杰，茍琰,，高必興,，鐘戀,，蒙春旺，耿昭▲，郭力▲

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137； 2.四川省食品藥品檢驗檢測院，成都 611731)

梔子為茜草科梔子屬梔子GardeniajasminoidesEllis 的干燥成熟果實，東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》中最早提及，在我國有廣泛的分布，是原國家衛(wèi)生部發(fā)布的第一批藥食兩用資源品種，《中國藥典》[1]中描述其功效為“瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒”，現(xiàn)代藥理研究表明其具有降血糖血壓、調(diào)節(jié)血脂、保肝利膽、緩解疲勞、抗炎、抗氧化、抗血栓和保護(hù)神經(jīng)等多種生物活性[2-3]。隨著人們對健康生活的追求不斷提高，梔子的保健作用受到越來越多的關(guān)注，除藥用外，梔子被廣泛應(yīng)用于保健品和食品的研究與開發(fā)中，并且已開發(fā)出功能性飲料、保健茶、保健酒、梔子果油等產(chǎn)品[4-6]，在人們的生產(chǎn)和生活中發(fā)揮著重要的作用。

近年來，關(guān)于蔬菜、瓜果、茶葉和中藥材等農(nóng)藥殘留的報道[7-9]層出不窮，讓大家心生疑慮。梔子生長過程中，有蚜蟲、花面天蛾幼蟲、灰蝶、紅蠟蚧等蟲害以及炭疽病、斑枯病等真菌感染[10-12]，為提高梔子產(chǎn)量，農(nóng)藥的使用不可避免。但其大量使用必然會危害人體健康并對環(huán)境造成污染。梔子的農(nóng)藥殘留檢測顯得尤其重要，它直接關(guān)系到相關(guān)藥品和食品的安全性，同時對于指導(dǎo)和提高梔子的規(guī)范化種植具有重要意義[13-14]。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)憑借其高靈敏度、強(qiáng)專屬性、同時定性定量和檢測高通量等優(yōu)勢成為目前最為重要的農(nóng)藥檢測手段[15]。本研究采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)對市場上收集的105批梔子飲片中不同種類農(nóng)藥進(jìn)行分析，涵蓋常用的有機(jī)磷、氯類和擬除蟲菊酯類等共計57種，以期為梔子的種植和開發(fā)提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

配備電子轟擊離子源(EI)的GCMS-TQ8040三重四級桿型氣質(zhì)聯(lián)用儀(日本Shimadzu)；彈性石英GC毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，DB-17 ms，美國Agilent)；AOC-6000 CTC進(jìn)樣器(瑞士CTC Analytics)；MS3 digital渦旋振蕩混合器(德國IKA)；3-30k低溫離心機(jī)(德國Sigma)；Mill-Q純水儀(美國Millipore)；WondaPak QuEChERS 15 mL C18/PSA/GC-e/硅膠凈化管(日本Shimadzu)；C18固相萃取柱(中國Bonna-Agela Technologies)；HLB固相萃取柱(美國waters)；PSA填料(中國Bonna-Agela Technologies)。

1.2 藥材與試劑

WondaPak QuEChERS醋酸鈉提取管：6 g MgSO4、1.5 g NaOAc(日本Shimadzu，批號：5010-050020)；分析保護(hù)劑：D-(+)-Ribonic Acid gamma-Lactone(北京百靈威科技，批號：20205336083)；乙腈和丙酮均為色譜純(美國Fisher Chemical，批號：MFCD00001878、MFCD00008765)；冰醋酸為分析純(成都科隆化學(xué)品有限公司，批號：2020072001)；水為超純水。

敵敵畏等57種農(nóng)藥對照品分別購自Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司(德國)、AccuStandard Inc 公司(美國)、農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所(AEPI)、北京曼哈格生物科技有限公司,具體信息見表1。105 批梔子樣品由各中藥材飲片企業(yè)送樣或藥房購買，梔子樣品由成都中醫(yī)藥大學(xué)高繼海副教授鑒定為為茜草科梔子屬梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實。樣品信息及編號見表2。

表1 農(nóng)藥對照品信息

表2 樣品信息

(見續(xù)表2) 續(xù)表2

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：DB-17 ms型彈性石英GC毛細(xì)管柱；升溫程序：起始溫度為60℃，恒溫1 min，以10℃min的速率升至160℃，以2℃/min的速率升至230℃，以15℃/min的速率升至300℃，恒溫6 min，最后以25℃/min的速率升至320℃，恒溫5 min，不分流進(jìn)樣1 μL；柱流速為線速度控制模式，初始流速1.3 mL/min；進(jìn)樣口溫度為240℃。離子源條件：70 eV，EI離子源溫度200℃，接口溫度280℃[16]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液

取1 μg/mL 的磷酸三苯酯乙腈溶液2 mL，加乙腈稀釋50倍至100 mL容量瓶中，搖勻，即得(每1 mL含內(nèi)標(biāo)磷酸三苯酯約20 ng)。

2.2.2 對照品貯備液

在配制混標(biāo)工作液時，由于常用農(nóng)藥中不同化合物的響應(yīng)情況不同，故配制樣品濃度各不相同；禁限用農(nóng)藥的配置參考擬定限：分別移取相應(yīng)量的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用丙酮配制成5～50 μg/mL的混標(biāo)溶液，作為混標(biāo)貯備液。

2.2.3 供試品溶液

取梔子飲片粉碎后過三號篩粉末3.0 g，精密稱定，置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%CH3COOH溶液15 mL，使用渦旋儀對藥粉進(jìn)行渦旋使其充分浸潤，靜置30 min，精密加入乙腈15 mL，置振蕩器上以2 000次/min的頻率劇烈振蕩20 min。冰箱中冷凍靜置30 min，加入無水MgSO4與無水NaOAc的混合粉末(4∶1)7.5 g，震搖使其均勻分布，再以2 000次/min的頻率置振蕩器上劇烈振蕩10 min，而后以離心半徑8 cm,速率8 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，精密量取上清液3 mL，氮吹至約0.1 mL，加丙酮使溶解并定容至2 mL，精密量取搖勻后的溶液1 mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液0.3 mL，搖勻，即得。作為供試品溶液。

2.2.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液

取基質(zhì)(無檢出農(nóng)殘的梔子樣品)3.0 g，以與供試品溶液相同的制備方法進(jìn)行處理，精密量取上清液3 mL，置氮吹儀上，且于溫水浴(約40℃)濃縮至約0.1 mL，分別加入混標(biāo)工作液(混標(biāo)貯備液稀釋50倍) 2、4、10、20、40、100、200 μL，加丙酮定容至2 mL，精密量取1 mL，加2.2.1內(nèi)標(biāo)溶液0.3 mL，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，分別作為ST 1-ST 7，供GC-MS/MS測定。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

結(jié)合前期工作基礎(chǔ)，并以基質(zhì)加標(biāo)進(jìn)行驗證，選擇響應(yīng)高、無基質(zhì)干擾的MRM模式采集。禁限用農(nóng)藥質(zhì)譜條件參考驗證條件，常用農(nóng)藥參考島津數(shù)據(jù)庫中MRM方法進(jìn)行，MRM色譜圖見圖1，混標(biāo)MRM參數(shù)見表3。

圖1 混標(biāo)MRM(GC-MS/MS)

表3 GC-MS/MS農(nóng)藥分組、保留時間及定量、定性離子的選擇

(見續(xù)表3) 續(xù)表3

2.4 線性關(guān)系與檢測限考察

取對照品，加空白基質(zhì)配制成濃度為1×103～1×104ng/mL的混合對照品貯備液作為st①；精密量取st① 0.1 mL，加入空白基質(zhì)0.9 mL，混合均勻，作為st②；精密量取st①0.05 mL，加入空白基質(zhì)0.95 mL，混合均勻，作為st③；精密量取st①0.02 mL，精密加入空白基質(zhì)0.98 mL，混合均勻，作為st④；精密量取st①0.1 mL，精密加入空白基質(zhì)0.9 mL，混合均勻，作為st⑤；精密量取st②0.1 mL，精密加入空白基質(zhì)0.9 mL，混合均勻，作為st⑥；精密量取st③0.1 mL，精密加入空白基質(zhì)0.9 mL，混合均勻，作為st⑦；精密量取st④0.1 mL，精密加入空白基質(zhì)0.9 mL，混合均勻，作為st⑧。st②～st⑧，液質(zhì)檢測指標(biāo)直接進(jìn)樣檢測，氣質(zhì)混標(biāo)分別精密加入內(nèi)標(biāo)溶液0.3 mL，混合均勻，分別精密吸取上述7種溶液各1 μL，注入GC-MS/MS系統(tǒng)，記錄測定峰面積值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.998 9，表明線性關(guān)系良好。

將標(biāo)準(zhǔn)曲線中st⑦、st⑧，分別注入氣質(zhì)聯(lián)用儀，視各峰響應(yīng)情況，選擇不同濃度進(jìn)樣，以下列公式計算其檢出限。絕大多數(shù)農(nóng)藥檢測限均小于 0.01 mg/kg。

2.5 精密度考察

取st⑤，注入液質(zhì)聯(lián)用儀直接重復(fù)進(jìn)樣6次，氣質(zhì)混標(biāo)分別精密加入分析用內(nèi)標(biāo)0.3 mL，混勻，再次重復(fù)進(jìn)樣6次，以測定后的峰面積值進(jìn)行計算，各目標(biāo)物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15.00%，表明儀器精密度滿足試驗需求。

2.6 回收率考察

取測定樣品進(jìn)行加樣回收率試驗，分別精密加入氣質(zhì)混合對照品貯備液各20 μL(2 LOD)、50 μL(5 LOD)、100 μL(10 LOD)、200 μL(20 LOD)，同一濃度平行2份，按已確定的前處理方法和色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行樣品處理和測定，總數(shù)86.61%的農(nóng)藥測定結(jié)果回收率在80.00%～150.00%內(nèi)；總數(shù)94.01%的農(nóng)藥相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15.00%。

2.7 樣品測定結(jié)果

根據(jù)以上建立的GC-MS/MS對105批梔子樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果見表4。所監(jiān)測的56種農(nóng)藥中共檢出14種，分別為氯氰菊酯、毒死蜱、甲氰菊脂、三唑磷、硫丹硫酸酯、氯氟氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、敵敵畏、氰戊菊酯、o,p′-DDT、p,p′-DDD、p,p′-DDT、p,p′-DDE和百菌清。氯氰菊酯檢出范圍為0.01～0.3 mg/kg，檢出率為56.19%；毒死蜱檢出范圍為0.004～0.115 mg/kg，檢出率為40.95%；甲氰菊脂檢出范圍為0.002～0.298 mg/kg，檢出率為39.05%；三唑磷檢出范圍為0.004～0.15 mg/kg，檢出率為30.48%。總體來看，105批樣品中可檢出農(nóng)藥的品種不多，檢出量也大部分在限量范圍內(nèi)，但個別批次樣品出現(xiàn)了農(nóng)殘超標(biāo)的情況，特別是使用頻率較高的氯氰菊酯、毒死蜱和甲氰菊酯等，存在安全性隱患。

表4 梔子中檢出農(nóng)藥品種、批次、檢出率及殘留量結(jié)果范圍

3 討論

梔子適應(yīng)性強(qiáng)，在我國大部分地區(qū)均有分布。梔子的野生及栽培品均常見，形成栽培規(guī)模的集中在華東和西南、中南等地區(qū)，其中以浙江、江蘇、江西、湖北、湖南、四川、貴州等省份栽培較多。隨著市場需求量不斷增加，梔子的栽培面積和管理方法也在不斷擴(kuò)大和更新，據(jù)統(tǒng)計我國梔子的栽培面積達(dá)1.7萬公頃，栽培過程中使用的種源及其他問題：①未經(jīng)人為優(yōu)選，種質(zhì)資源不穩(wěn)定;②從野生采種繁育等現(xiàn)象使得市面無良種可循，再反復(fù)的使用野生種源繁育后，梔子的抗逆性與野生相比明顯降低;③栽培品種植過程中沒有統(tǒng)一的管理方法使得各種疾病蟲害也越發(fā)凸顯[17-18]，因而在栽培過程中農(nóng)藥使用較為普遍。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，梔子的栽培管理較為混亂，農(nóng)藥使用沒有標(biāo)準(zhǔn)化，對梔子的產(chǎn)量和質(zhì)量的提升造成不良影響，藥材的安全性問題不容忽視。本研究發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯、毒死蜱、甲氰菊酯的檢出率高于40.00%，三唑磷、硫丹硫酸酯和氯氟氰菊酯檢出率大于10.00%，敵敵畏、戊菊酯、o,p′-DDT、p,p′-DDD和p,p′-DDT、p,p′-DDE和百菌清在105批樣品中檢出率小于5.00%。使用較為頻繁的氯氰菊酯、甲氰菊酯、毒死蜱、三唑磷、硫丹硫酸酯、氯氟氰菊酯和聯(lián)苯菊酯等被檢出幾率較大，同時農(nóng)藥殘留量也較高，農(nóng)殘超標(biāo)情況較為嚴(yán)重；敵敵畏、氰戊菊酯、o,p′-DDT、p,p′-DDD、p,p′-DDT、p,p′-DDE和百菌清幾乎沒有檢出，殘留量也均在規(guī)定范圍內(nèi)。推測可能為梔子生產(chǎn)種植過程中對檢出率大于10.00%的農(nóng)藥品種使用更加頻繁或用量更大，此類農(nóng)藥品種也是梔子農(nóng)殘檢測中需要著重關(guān)注的部分，尤其對檢出率和殘留超標(biāo)嚴(yán)重的氯氰菊酯、毒死蜱、加氰菊酯更應(yīng)重點關(guān)注。本研究基于GC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)建立的農(nóng)殘快速檢測方法為農(nóng)殘篩查提供了參考，其靈敏度高、專屬性強(qiáng)、同時定性定量和檢測效率高使得農(nóng)殘測定更為迅速、準(zhǔn)確且便捷。本研究對市售的105批梔子樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)所監(jiān)測的57種農(nóng)藥中共檢出14種，部分農(nóng)藥殘留均在國家規(guī)定范圍內(nèi)，小部分批次樣品出現(xiàn)了農(nóng)殘超標(biāo)的情況。在梔子的種植與生產(chǎn)開發(fā)中，農(nóng)藥使用的不規(guī)范，使得個別農(nóng)藥超標(biāo)，如能根據(jù)農(nóng)殘測定結(jié)果定向優(yōu)化農(nóng)藥使用規(guī)范，可以為梔子的種植栽培提供一定的指導(dǎo)，以保證梔子的臨床安全。