平菇天然黑色素的提取優(yōu)化及理化性質(zhì)表征*

劉 芹，胡素娟，崔 筱，宋志波，孔維麗，康源春

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南 鄭州 450002）

黑色素是一種具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的多酚類或吲哚類物質(zhì)，廣泛存在于各種生物體中[1]。黑色素具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗蛇毒素[4]、抗輻射[5]等作用，且生物活性高。近年來，黑色素和黑色素樣分子（melanin-like molecules） 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用得到了廣泛的關(guān)注，如生物成像、光熱治療、藥物釋放系統(tǒng)等[2]，并且由于其優(yōu)異的生物相容性和生物降解性，黑色素作為功能材料也被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域[6]。許多大型真菌都含有黑色素，這使得真菌成為獲取黑色素的重要來源。真菌黑色素的合成途徑有2種：1，8-二羥基萘 （DHN） 合成途徑和多巴（DOPA）合成途徑。在DHN合成途徑中，丙二酰輔酶A在聚酮化合物合成酶的作用下生成的四羥基萘（1，3，6，8-THN），再經(jīng)過一系列反應(yīng)形成DHN，DNH進一步聚合形成黑色素[7]。大多數(shù)真菌黑色素是經(jīng)過DHN合成途徑生成的，只有少數(shù)真菌通過DOPA途徑產(chǎn)生黑色素，這與哺乳動物中黑色素的生物合成途徑相似，是以L-多巴或酪氨酸為起始分子，經(jīng)過一系列的反應(yīng)合成二羥基吲哚，然后進一步聚合形成黑色素[8]。黑色素對真菌的發(fā)育不是必需的，但是據(jù)研究表明，黑色素具有“真菌裝甲”的作用，可以保護微生物免受有害環(huán)境的影響。體外研究表明，黑化真菌對極端溫度、水解酶、重金屬毒性和抗菌藥以及對紫外線誘導(dǎo)和氧化劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的損傷的抵抗力高于非黑化真菌，并且黑色素可以在不利條件下提高真菌的存活率。由于其強大的自由基清除活性，可成為真菌在環(huán)境脅迫下產(chǎn)生活性氧自由基時清除自由基的“海綿”[9]。目前，關(guān)于食用菌的黑色素研究較少[6]，黑色素研究主要集中于動物、植物和細菌類微生物，但是存在植物生長速度慢、動物飼養(yǎng)成本高、微生物安全性較低等缺點。而食用菌子實體的生長速度快，易于工廠化栽培，并且安全性有保障，是一種很有前途的黑色素生產(chǎn)替代品[10]。

平菇（Pleurotus ostreatus） 是世界上栽培最廣泛的食用菌之一[11]，由于其豐富的營養(yǎng)（如膳食纖維、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素）、顯著的抗氧化、抗病毒、提高免疫力等生物活性而受到消費者的青睞[12]。平菇易于栽培，可以在各種農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物（玉米芯、秸稈、麩皮等）上生長，其年產(chǎn)量在世界范圍內(nèi)持續(xù)快速增長[13]。平菇是我國第三大食用菌栽培品種，生長周期短、成本低，工廠化程度高，基本可以實現(xiàn)全年穩(wěn)定供應(yīng)，2019年平菇全國年產(chǎn)量高達686.47萬噸[14]，因此，平菇可作為一種新型天然黑色素來源進行深入研究。

通過響應(yīng)面法優(yōu)化平菇黑色素的提取方法以獲得最佳的提取條件，此外，對平菇黑色素的溶解性、光穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、金屬離子穩(wěn)定性和抗氧化活性進行了檢測，以期為平菇黑色素的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮平菇子實體采摘自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究室原陽二基地。

1.2 試劑與儀器

氯仿、丙酮、乙酸乙酯、氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）和無水乙醇均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）和ABTS[2，2′-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）]，購自美國Sigma公司。

D3024R高速冷凍離心機，美國Scilogex公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；電子天平，瑞士Mettler Toledo有限公司；普析GWB-1純水儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PS-60AL超聲儀，深圳市雷德邦電子有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，龍口市先科儀器公司；UV-2550紫外-可見分光光度儀，美國Lab Tech公司；pH計，美國Sartorius公司。

1.3 平菇原料前處理

平菇子實體采用蒸餾水清洗干凈，50℃熱風(fēng)干燥至恒重。干制平菇樣品粉碎過250 μm標準篩，干燥器中保存待用。

1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化平菇黑色素的提取

1.4.1 黑色素的提取

稱取平菇樣品粉末，按照一定料液比加入NaOH溶液，超聲水浴抽提。離心（9 500 r·min-1，15 min），收集上清液并調(diào)節(jié)pH至1.5，80℃再次水浴12 h。將提取液離心 （8 000 r·min-1，10 min），收集沉淀即為黑色素粗品。將得到的黑色素粗品反復(fù)酸沉堿溶3次～4次，最后將獲得的黑色素采用蒸餾水漂洗至pH 7.0，干燥后保存。

1.4.2 單因素試驗

分別對NaOH濃度（0.25 mol·L-1～1.50 mol·L-1）、料液比 （1∶10～1∶60）、超聲時間 （10 min～60 min）、超聲功率（200 W～400 W） 和超聲溫度（20℃～70℃）進行單因素試驗，研究5個因素對黑色素獲得率的影響。黑色素獲得率（Y，%）的計算公式為：

式中：m為平菇黑色素的質(zhì)量（g）；M為平菇子實體粉末質(zhì)量（g）。

1.4.3 響應(yīng)面法試驗的設(shè)計

優(yōu)化試驗的設(shè)計采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法，應(yīng)用軟件Design-Expert 8.0對影響黑色素提取的主要因素進行研究分析，以獲得最佳提取條件。

1.5 平菇黑色素理化性質(zhì)

1.5.1 平菇黑色素溶解性

稱取0.01 g平菇黑色素干品分別與5 mL的1.0 mol·L-1NaOH、1.0 mol·L-1HCl溶液、無水乙醇、75%乙醇水溶液、氯仿、去離子水、丙酮、乙酸乙酯混合均勻，室溫靜置0.5 h，觀察黑色素的溶解性。

1.5.2 平菇黑色素?zé)岱€(wěn)定性

稱取0.01 g平菇黑色素干品溶于10 mL的0.1 mol·L-1NaOH溶液中，分別置于20℃、40℃、60℃、80℃和100℃水浴中。每隔1 h取1次樣，共取6次。冷卻至室溫后，8 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液用紫外可見分光光度計在波長210 nm處測定吸光值。

1.5.3 平菇黑色素光穩(wěn)定性

稱取0.01 g平菇黑色素干品溶于10 mL的0.1 mol·L-1NaOH溶液中，分別置于黑暗、自然光和強光下，每隔12 h取樣一次，共72 h，在210 nm處測定吸光度值。

1.5.4 平菇黑色素金屬離子穩(wěn)定性

稱取0.01 g平菇黑色素干品溶于10 mL的0.1 mol·L-1NaOH溶液中，溶液中各含有 0.01 mol·L-1的金屬離子 （Ca2+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Al3+、K+、Na+和Mg2+），未加金屬離子的NaOH溶液為空白對照。每隔12 h取樣一次，共72 h，在210 nm處測定吸光度值。

1.5.5 平菇黑色素氧化還原特性

向0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL還原劑（30% Na2SO3）和氧化劑（30% H2O2）中添加1.0 mg·mL-1平菇黑色素溶液使總體積為5 mL。后用蒸餾水稀釋至10 mL，搖勻試管，靜置30 min，測定210 nm處的吸光度值。另外，將1.0 mg·mL-1的KMnO4溶液與1.0 mg·mL-1平菇黑色素溶液等體積混勻，靜置30 min，觀察顏色變化。

1.5.6 平菇黑色素的抗氧化活性

1） DPPH自由基清除率

分別取 2 mL不同濃度 （0.25 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1、1.00 mg·mL-1、2.00 mg·mL-1和 4.00 mg·mL-1）的平菇黑色素溶液與2 mL的0.2 mmol·L-1DPPH溶液混勻，黑暗反應(yīng)30 min后取出，測定517 nm處吸光度值（A1），用等體積的無水乙醇代替DPPH溶液，測定吸光度（A2），用等量去離子水代替黑色素溶液，測定吸光度（A0）。DPPH自由基清除率（C1，%）的計算公式為：

2） ABTS自由基清除率

將ABTS溶液（7 mmol·L-1）與過硫酸鉀溶液（2.45 mmol·L-1）混合，黑暗中孵育16 h，制備ABTS·+。用乙醇稀釋ABTS溶液，使其在734 nm處吸光度值為0.70±0.02。取0.2 mL不同濃度的黑色素樣品與3 mL的ABTS溶液混勻，室溫下黑暗中反應(yīng)60 min，在734 nm處測定吸光度（A3）。將ABTS溶液替換為等體積的蒸餾水，測定吸光度（A4）。用等量去離子水代替黑色素溶液，測定吸光度（A0）。ABTS·+清除率（C2，%）的計算公式為：

1.5.7 平菇黑色素紫外-可見光譜掃描

稱取0.01 g平菇黑色素干品溶于10 mL的0.1 mol·L-1NaOH 溶液中，離心 （8 000 r·min-1，5 min），在200 nm～400 nm的波長范圍內(nèi)對收集的上清液進行光譜掃描。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有的試驗重復(fù)測量3次，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中的ANOVA法進行顯著性差異分析，差異顯著性為P<0.05。采用Design-Expert 8.0軟件，對響應(yīng)面進行多元二次回歸分析，建立黑色素得率的二階響應(yīng)回歸模型，并對回歸模型進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

NaOH濃度、料液比、超聲時間、超聲功率和超聲溫度5個因素對黑色素獲得率的影響，詳見圖1。

圖1a為NaOH濃度對平菇黑色素得率的影響。如圖所示，黑色素得率隨NaOH濃度的升高而不斷增加，并當NaOH濃度為0.75 mol·L-1時達到最大值，此后，黑色素得率不斷下降。這是因為NaOH溶液濃度過高時，堿性較大，破壞了黑色素的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致黑色素得率降低[15]。因此，最終選取NaOH溶液濃度為 0.75 mol·L-1。

圖1b為料液比對平菇黑色素得率的影響。如圖所示，在料液比為1∶10～1∶60時，黑色素的得率隨著溶劑用量的增加而升高。這是因為增加溶劑體積有助于增加溶劑與提取物的接觸面積，平菇黑色素可以更好的溶解。但是考慮到試驗過程中料液比太大會增加試驗成本，不利于實驗室資源的節(jié)約，因此最終選取的料液比為1∶40。

圖1c為超聲功率對平菇黑色素得率的影響。如圖所示，平菇黑色素的得率隨超聲功率的增加而不斷增加，并在超聲功率為280 W時達到最高值，隨后逐漸下降。這是因為隨著超聲功率的增加，空化作用增強，從而黑色素得率增加；但隨著超聲功率的進一步增加，抽提液的流動速度加快，導(dǎo)致材料在超聲場中停留時間減少，從而削弱了破壁效果[5]。因此，最終選取的超聲功率為280 W。

圖1d為超聲溫度對平菇黑色素得率的影響。如圖所示，平菇黑色素的得率隨提取溫度的升高而不斷增加，并在60℃后基本保持不變。過高的提取溫度將導(dǎo)致黑色素的生物活性下降和能量消耗的增加。因此，最終選取的超聲溫度為60℃。

圖1e為超聲時間對平菇黑色素得率的影響。如圖所示，黑色素得率在提取時間為40 min時達到最大值。抽提時間過短，黑色素與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)解離不充分，黑色素得率不高。當抽提時間大于40 min后，黑色素的得率隨抽提時間的增加而減少。這可能是由于提取過程在高溫水浴下進行，抽提時間過長，溶劑水的過度蒸發(fā)造成提取液濃度升高、料液比下降（圖1b），從而導(dǎo)致黑色素得率下降[15]。因此，最終選取的超聲時間為40 min。

圖1 5個因素分別對平菇黑色素獲得率的影響Fig.1 The effects of five factors on the yield of melanin in Pleurotus ostreatus

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

單因素試驗表明，NaOH濃度、超聲時間、超聲功率3個因素對平菇黑色素的產(chǎn)率影響較大。因此，在料液比為1∶40，超聲溫度為60℃的前提下，根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定上述3因素的水平范圍，見表1。

利用Design-expert軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計并以平菇黑色素獲得率作為響應(yīng)值，對Box-Benhnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 Box-Benhnken試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.2 Box-Behnken experimental design and experimental results

對Box-Benhnken設(shè)計試驗結(jié)果進行二次多相回歸擬合，得到黑色素獲得率（Y）對NaOH濃度、超聲時間、超聲功率的多元回歸方程為：

采用方差分析（ANOVA）來評估該擬合模型的有效性，見表3。

表3 響應(yīng)面分析試驗方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variance for the developed regression model

由表3可知，整體模型的P<0.000 1，表明該二次方程模型極顯著。并且，A、B、AB、A2、B2、C2對黑色素的得率影響極顯著。模型失擬項表示的是模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率，該模型失擬項P=0.324 6>0.05，表示水平不顯著，說明該方程對試驗擬合較好[16]。決定系數(shù)值（R2=0.999 1） 和調(diào)整過后的決定系數(shù)值（R2adj=0.998 0） 表明自變量與響應(yīng)值之間具有很好的相關(guān)性[5]。

2.2.2 最佳工藝條件的預(yù)測與檢驗

通過三維響應(yīng)面和二維等高線圖展示了各因素對平菇黑色素獲得率的影響，NaOH濃度與超聲功率對黑色素獲得率的影響見圖2a、2b，NaOH濃度和超聲時間對黑色素獲得率的影響見圖2c、2d，超聲功率和超聲時間對黑色素獲得率的影響見圖2e、2f。

如圖2所示，利用Design-Expert 8.0軟件對試驗?zāi)Ｐ瓦M行預(yù)測，得到平菇黑色素的最佳提取條件為：NaOH濃度0.58 mol·L-1，超聲功率286.04 W，超聲時間39.89 min，此條件下響應(yīng)預(yù)測值為2.204 5%。結(jié)合實際，調(diào)整各因素為：NaOH濃度為0.60 mol·L-1，超聲功率280 W，超聲時間40 min。在此條件下進行3次平行試驗驗證，最后得到的平菇黑色素得率為2.19%，與預(yù)測值相差不大，證明了該模型設(shè)計的可靠性。

圖2 兩兩因素對平菇黑色素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of pairwise factors on the yield of Pleurotus ostreatus melanin

2.3 平菇黑色素溶解性

系統(tǒng)研究了平菇黑色素在1.0 mol·L-1鹽酸溶液、無水乙醇、1.0 mol·L-1NaOH溶液、75%乙醇水溶液、氯仿、蒸餾水、丙酮、乙酸乙酯中的溶解性，結(jié)果見表4。

由表4可知，平菇黑色素在強堿（NaOH） 溶液中的溶解度較高，在其余溶劑中的溶解度較低。平菇黑色素的溶解特性與粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus） 黑色素非常相似[5]。

表4 平菇黑色素的溶解性Tab.4 Solubility of Pleurotus ostreatus melanin

2.4 平菇黑色素穩(wěn)定性能

此外，試驗研究了光照、溫度、金屬離子和脫氧劑等環(huán)境對平菇黑色素穩(wěn)定性的影響。熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性見圖3。

如圖3可知，堿性溶液中的黑色素具有一定的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性，但強光和高溫對其穩(wěn)定性有很大的影響，隨著處理時間的增加，黑色素的吸光值均呈下降的趨勢。在對黑色素進行光激發(fā)試驗中發(fā)現(xiàn)，黑色素能量產(chǎn)生消耗，單體內(nèi)部存在質(zhì)子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。但結(jié)構(gòu)變化并不意味著黑色素的光穩(wěn)定性差，而是黑色素在吸收了有害的紫外輻射后，將光能轉(zhuǎn)化為無害熱量[15]。黑色素這種獨特的能力，使其成為一種優(yōu)良的光保護劑。

圖3 平菇黑色素的穩(wěn)定性統(tǒng)計Fig.3 Statistic of stabilily performance of Plewotus ostreatus melanin

金屬離子對平菇黑色素穩(wěn)定性的影響見圖4。

如圖4所示，在使用的金屬離子中，Cu2+對平菇黑色素的穩(wěn)定性具有最顯著的影響，這可能與金屬離子與黑色素的相鄰酚羥基之間的復(fù)雜反應(yīng)有關(guān)[5]。與對照相比，其余的金屬離子對黑色素的穩(wěn)定性無顯著影響。

圖4 平菇黑色素的金屬離子穩(wěn)定性Fig.4 The metal ion stability of Pleurotus ostreatus melanin

脫氧劑環(huán)境對平菇黑色素穩(wěn)定性的影響見圖5。

圖5 平菇黑色素在Na2SO3和H2O2中的氧化還原特性以及對KMnO4溶液的褪色作用Fig.5 The redox properties of melanin in Na2SO3and H2O2and melanin discolors KMnO4solution.

如圖5A所示，還原劑Na2SO3對平菇黑色素的穩(wěn)定性無顯著影響，但氧化劑H2O2明顯降低了平菇黑色素的穩(wěn)定性。如圖5B所示，平菇黑色素使KMnO4溶液發(fā)生了明顯的褪色，由紫紅色褪色為淺綠色，平菇黑色素的氧化還原性質(zhì)與粗毛纖孔菌黑色素類似[5]。

2.5 平菇黑色素的抗氧化活性

相對穩(wěn)定的有機自由基DPPH被廣泛用于各種化合物的抗氧化活性測定[17-18]。DPPH·有一個單電子，在乙醇中呈紫色并且在517 nm處有很強的吸收?？寡趸瘎┛梢耘cDPPH·的單電子配對，從而逐漸降低溶液的顏色[19]。ABTS·+則是用于測定單一化合物以及其他復(fù)雜混合物的抗氧化活性最常用的有機自由基之一[20]。平菇黑色素對DPPH·和ABTS·+的清除率見圖6。

由圖6可知，平菇黑色素對DPPH自由基的清除率隨著黑色素濃度的增加而增加，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系。當平菇黑色素濃度為0.50 mg·mL-1時，對DPPH自由基清除率達到70.23%。平菇黑色素對DPPH自由基的清除活性明顯高于黑芝麻黑色素 （47.70%）[21]。當濃度為0.50 mg·mL-1時，平菇黑色素對ABTS·+的清除率為40.24%，低于對DPPH自由基的清除作用。

圖6 平菇黑色素的抗氧化活性Fig.6 The antioxidant activity of Pleurotus ostreatus melanin

2.6 平菇黑色素紫外光譜特征

平菇黑色素紫外光譜圖見圖7。

圖7 平菇黑色素的紫外-可見吸收光譜Fig.7 UV-visible absorption spectra of Pleurotus ostreatus melanin

由圖7光譜掃描結(jié)果表明，平菇黑色素在210 nm處有最大吸收，并向可見光區(qū)域降低（圖7a），這一現(xiàn)象是黑色素的關(guān)鍵特征，與毛木耳[5]和粗毛纖孔菌[15]黑色素的研究結(jié)果一致，這是因為黑色素分子中存在復(fù)雜的共軛結(jié)構(gòu)。此外，平菇黑色素的吸光度值隨波長的增加幾乎呈線性降低，其吸光度值的對數(shù)（lg）對波長會產(chǎn)生負斜率為-0.002 8的線性曲線（圖7b），這是黑色素的特征之一[22-23]。在260 nm和280 nm處未發(fā)現(xiàn)明顯的吸收峰，表明核酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)的含量很小[17]，這說明所采取的提取方法效果良好，方法可靠。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設(shè)計以及響應(yīng)面分析法，對平菇黑色素的提取條件進行優(yōu)化，得出最佳提取條件為：料水比為1∶40，提取溫度為60℃，NaOH濃度為0.60 mol·L-1，超聲功率280 W，超聲時間40 min，在此條件下檢測的黑色素得率為2.19%，與理論值相差不大。得到黑色素的得率與各反應(yīng)因素變量的二次回歸方程模型，該模型回歸極顯著，對試驗擬合較好，具有一定的應(yīng)用價值。理化試驗結(jié)果表明，平菇黑色素在堿性條件下具有良好的溶解性，不溶于水、酸溶液和有機溶液；平菇黑色素的最大光吸收波長為210 nm，此外，該黑色素具有一定的熱穩(wěn)定性和耐光性，并且對大多數(shù)金屬離子表現(xiàn)出穩(wěn)定性。平菇黑色素表現(xiàn)出較強的抗氧化性，當濃度為0.50 mg·mL-1時，平菇黑色素對DPPH·和ABTS·+的清除率分別為70.23%和40.24%。本研究為平菇黑色素及其深加工產(chǎn)品的應(yīng)用和開發(fā)提供了新思路。但是，對于平菇黑色素的其他研究如其在平菇體內(nèi)的分布和代謝、在食品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，有待于進一步研究。