黑松露多糖提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性分析

國琦，梁雙敏，葛長榮，肖智超*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南昆明 650201）（2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）

黑松露（Tuber sinense），中國地區(qū)別名又叫做塊菌、無娘果等，屬子囊菌門，西洋塊菌科，西洋塊菌屬[1-2]。是一種生長在地表下且能與松科、榛科、殼斗科、樺木科等樹木共生的野生食用菌[3]。其子囊果呈不規(guī)則的半球形或塊狀,其表面以黑褐色或暗色為主并呈現(xiàn)出明顯的疣突，成熟的黑松露切面白褐相間，如同大理石紋樣[4]。黑松露的生長條件十分嚴(yán)格，光照、水分、土壤pH、微生物等因素對(duì)其生長有影響[5-6]。黑松露風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)價(jià)值豐富，含有人體所需的多種營養(yǎng)物質(zhì)，如多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、多不飽和脂肪酸、維生素和微量元素等，與魚子醬和鵝肝一起被稱為世界三大美食[7-8]。歐洲和亞洲是黑松露的主要產(chǎn)地[9-10]，根據(jù)DNA 數(shù)據(jù)和地理分布分析，亞洲塊菌物種群包括6 個(gè)物種：中國塊菌（Tuber sinense）、臺(tái)灣塊菌T.formosanum、易貢塊菌T.yigongense、長刺塊菌T.longispinosum、喜馬拉雅塊菌T.himalayense和印度塊菌T.indicum[11-13]。近年來，食用菌多糖的免疫活性、抗氧化、降血糖、抗腫瘤和降血脂等生物活性被逐漸證實(shí)，但目前針對(duì)黑松露的研究主要集中于其化學(xué)成分，提取純化等基礎(chǔ)研究，對(duì)于黑松露多糖的單糖組成、單糖結(jié)構(gòu)、生物活性（抗菌、抗腫瘤等）及其作用機(jī)制的研究較少[14-16]，這成為制約黑松露資源深度開發(fā)利用的瓶頸。

因此，本研究選取云南黑松露，采用超聲波輔助水提醇沉法提取黑松露多糖，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝。并對(duì)純化后黑松露多糖的單糖組成、摩爾比等結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，還通過DPPH、ABTB、金屬螯合力和還原力測(cè)定等方法評(píng)價(jià)黑松露多糖的體外抗氧化活性，為黑松露多糖活性的深入研究及其開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

黑松露購于易門縣山里香食品有限公司；DEAE-Sepharose 快速流動(dòng)柱，美國GE Healthcare 公司；無水乙醇，湖北西隴化工有限公司；葡萄糖、苯酚，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；濃硫酸，開封東大化工公司；氯化鈉，國藥化學(xué)試劑公司；氯仿，天津市元立化工有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-氮聯(lián)-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、抗壞血酸（Vc）、菲啰嗪-鈉鹽、乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-2Na），上海源葉生物科技有限公司；16 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖鹽酸鹽、鹽酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D 氨基葡萄糖、古羅糖醛酸、甘露糖醛酸），上海博睿糖生物技術(shù)有限公司；三氟乙酸，比利時(shí)ACROS公司；50%氫氧化鈉溶液，美國Alfa Aesar公司；醋酸鈉，美國ThermoFisher 公司；其它均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

DFY-400D 搖擺式高速粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；BSA224S 數(shù)顯電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；A360 紫外分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；EU-K1-20TQ 超純水儀，南京歐鎧環(huán)境科技有限公司；LGJ-10N 真空冷凍干燥機(jī)，北京亞星儀科發(fā)展有限公司；H2-16RK 臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；SCQ-9201B 超聲波清洗器，上海聲彥超聲儀器有限公司；ULT1386-3-V41 超低溫冰箱，賽默飛儀器有限公司；HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；RE-57 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；ELX800 酶標(biāo)儀，美國BIO-TEK 公司；ICS5000 離子色譜儀，美國ThermoFisher 公司；101-1BS 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、UGC-24M 氮吹儀，力辰科技。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑松露粗多糖的制備

以黑松露為原料，在45 ℃下對(duì)其子實(shí)體進(jìn)行干燥粉碎，設(shè)計(jì)料液比（10～50，V/m）、提取溫度（55～95 ℃）和提取時(shí)間（0.5～2.5 h）。稱取黑松露固體粉末5 g，按料液比加入超純水，將溶解后的溶液放入超聲波提取儀中超聲20 min，將超聲后的溶液放入90 ℃恒溫水浴鍋中水浴2 h。6500 r/min 離心20 min，保留上清液，重復(fù)提取兩次。抽濾后收集上清液，真空濃縮至約60 mL，按照1:3 的比例加入3 倍體積的無水乙醇，充分?jǐn)嚢?，以致產(chǎn)生沉淀物或絮狀物。置于4 ℃冰箱中靜置24 h，4000 r/min 離心15 min，收集沉淀物。沉淀物加超純水復(fù)溶得到黑松露多糖溶液。將冷凍后的松露多糖置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干成粉末狀后密封儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱，即為黑松露粗多糖提取物。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用苯酚-硫酸法測(cè)定黑松露粗多糖的含量[17]。黑松露粗多糖得率（%）計(jì)算如下：

1.3.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Box-Behnken法優(yōu)化提取工藝。提取溫度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）和多糖提取率是因變量[18]。自變量的因素和水平如表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Responsesurface experimental factor level table

1.3.3 黑松露粗多糖的純化

采用Sevage 法脫去黑松露粗多糖中的蛋白質(zhì)，將脫去蛋白質(zhì)的溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮，濃縮后透析，收集樣品，冷凍干燥，得到除去雜質(zhì)的黑松露粗多糖。將粗多糖溶于去離子水中，40 mL 溶液置于DEAE-Sepharose 快速流動(dòng)柱（4.6 cm×50 cm）上，依次用蒸餾水、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl 溶液洗脫。流速為2 mL/min，自動(dòng)收集洗脫液（10.0 mL/管）。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。依據(jù)洗脫峰型，收集同一峰洗脫液，濃縮，透析，凍干，從而獲得四個(gè)多糖組分[19-20]。

1.3.4 黑松露多糖初步結(jié)構(gòu)分析

取16 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品配成約10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液。取各單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液精密配置0.1、0.5、1、5、10、20、50 mg/L 梯度濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)絕對(duì)定量方法，測(cè)定不同單糖質(zhì)量，根據(jù)單糖摩爾質(zhì)量計(jì)算出摩爾比。

用離子色譜儀（ICS 5000，美國賽默飛世爾公司）分析純化后黑松露多糖三個(gè)組分的單糖組成。5 mg 樣品在120 ℃下用10 mL的2 M TFA在安瓿中分解5 h。用氮?dú)飧稍锼崴庖?，加? mL 水渦旋混勻，吸取100 μL 于900 μL 去離子水中稀釋，12000 r/min 離心5 min，水解樣品溶液與10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物注入色譜系統(tǒng)。色譜柱：DionexCarbopacTMPA20 （3×150）；流動(dòng)相A相為H2O，B相為250 mol/L NaOHC:50 mol/L NaOH 和500 mol/L NaOAC；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為30 ℃[21]。

1.3.5 黑松露多糖的體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 DPPH 自由基清除活性

DPPH 自由基清除活性的測(cè)定方法參照Wang 等[22]進(jìn)行稍加修改。通過乙醇溶解制備0.2 mmol/L DPPH 溶液，并在試驗(yàn)日使用。將2 mL DPPH 溶液與2 mL 樣品溶液（0.25～4 mg/mL）混合并搖勻。然后將混合物在室溫下黑暗中保持30 min。使用抗壞血酸作為對(duì)照。最后用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定了樣品在517 nm 處的吸光度。自由基清除能力由以下公式確定：

式中：

A0——對(duì)照試驗(yàn)的吸光度值（無水乙醇代替樣品）；

Ai——樣品試驗(yàn)的吸光度值；

Aj——樣品干擾試驗(yàn)的吸光度值（無水乙醇代替DPPH 溶液）。

1.3.5.2 ABTS 自由基清除活性

ABTS自由基清除黑松露多糖的實(shí)驗(yàn)是根據(jù)Zeng等[23]方法進(jìn)行的，并做了一些修改。通過將5 mL K2S2O8溶液（7mm ABTS+）與5 mL過硫酸鉀溶液（2.45 mm）在黑暗條件下反應(yīng)12 h 制備ABTS+，并在當(dāng)天使用。用蒸餾水將ABTS+溶液稀釋至734 nm 處的吸光度為0.70±0.02。將0.4 mL 不同濃度的樣品溶液（0.25～4 mg/mL）和3 mL ABTS+溶液劇烈混合。以抗壞血酸為對(duì)照。在室溫黑暗條件下反應(yīng)30 min 后，于732 nm 處測(cè)量吸光度。ABTS 自由基陽離子清除活性通過以下方程式計(jì)算：

式中：

A0——對(duì)照試驗(yàn)的吸光度值（用蒸餾水代替樣品）；

Ai——樣品試驗(yàn)的吸光度值；

Aj——樣品干擾試驗(yàn)的吸光度（用蒸餾水代替ABTS 溶液）。

1.3.5.3 金屬螯合能力的測(cè)定

多糖的金屬螯合能力測(cè)定根據(jù)先前報(bào)道的方法進(jìn)行少許修改[24]。將1.0 mL 樣品（0.25～4 mg/mL）與0.1 mL 2.0 mM 氯化亞鐵、0.2 mL 5.0 mM 菲啰嗪溶液和3.7 mL 蒸餾水混合。以EDTA-2Na 為對(duì)照?；旌戏磻?yīng)10 min 后，在560 nm 處測(cè)定吸光度。金屬螯合能力由以下方程式計(jì)算：

式中：

A0——對(duì)照試驗(yàn)（用蒸餾水代替樣品）的吸光度值；

Ai——樣品試驗(yàn)的吸光度值；

Aj——樣品干擾試驗(yàn)（用蒸餾水代替氯化鐵溶液）的吸光度值。

1.3.5.4 還原力的測(cè)定

不同黑松露多糖組分還原力的測(cè)定采用先前研究[17]中所述的方法進(jìn)行少許修改。1 mL 樣品（0.25～4 mg/mL）與2.5 mL 磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL 0.1% K3Fe(CN)6（0.1%，m/V）混合。將混合物在50 ℃下培養(yǎng)20 min，然后添加2.5 mL 三氯乙酸溶液（10%，m/V），2.5 mL FeCl3（0.1%，m/V），在700 nm 處測(cè)量吸光度。還原力測(cè)定通過以下公式計(jì)算：

還原力=Ai-Aj

式中：

Ai——樣品實(shí)驗(yàn)的吸光度值，

Aj——樣品干擾實(shí)驗(yàn)的吸光度（用蒸餾水代替FeCl3溶液）。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有樣品均進(jìn)行 3 次平行測(cè)定。利用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以Excel 2020 進(jìn)行數(shù)據(jù)初步整理，采用OriginPro 8.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)黑松露粗多糖提取率的影響

當(dāng)提取溫度為75 ℃，料液比為1:30 g/mL 時(shí)，研究其不同提取時(shí)間0.5、1、1.5、2、2.5 h 對(duì)黑松露粗多糖提取率的影響。由圖1 可知，黑松露粗多糖在0～1 h時(shí)提取率呈上升趨勢(shì)，在1～2.5 h時(shí)總體呈下降趨勢(shì)。雖然在2 h 粗多糖得率有上升趨勢(shì)，但是與1 h 相比趨勢(shì)不夠明顯。時(shí)菲菲等[25]制備多糖的最適提取時(shí)間為2.3 h，多糖得率在15.66%。提取過程中超出最適提取時(shí)間時(shí)，其他非多糖成分會(huì)隨著提取時(shí)間的延長而溶出，多糖也會(huì)因過度水解而導(dǎo)致得率下降。本文黑松露多糖在2 h 有上升趨勢(shì)的原因可能是隨著提取時(shí)間的延長，非多糖物質(zhì)溶解出來，使得黑松露粗多糖的得率提高[26]。因此，1 h 為黑松露粗多糖最佳提取時(shí)間，提取率達(dá)到最高為10.45%。

圖1 提取時(shí)間對(duì)黑松露粗多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the yield ofcrude polysaccharide fromTuber sinense

2.1.2 提取溫度對(duì)黑松露粗多糖得率的影響

溫度是影響提取率的一個(gè)重要因素，因此在提取時(shí)間為1 h，料液比為1:30 g/mL 時(shí)，分別研究了55、65、75、85 和95 ℃對(duì)黑松露粗多糖提取率的影響。由圖2 可知，粗多糖提取率隨著溫度的升高而增大，當(dāng)溫度達(dá)到75 ℃時(shí)，得率達(dá)到最高為11.5%，而后隨著溫度的升高而下降。閆舒雅等[27]提取雞腿菇菌絲體多糖最適提取溫度為80 ℃，其提取率為7.80%。與本文研究的提取溫度相近，提取過程中溫度不宜過高，溫度過高會(huì)導(dǎo)致多糖部分水解，使粗多糖得率下降[28]。因此，本文的最佳提取溫度為75 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)黑松露粗多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of crude polysaccharide from Tuber sinense

2.1.3 料液比對(duì)黑松露粗多糖提取率的影響

不同料液比也會(huì)影響黑松露粗多糖提取率。設(shè)定料液比為：1:10、1:20、1:30、1:40 和1:50 g/mL），提取時(shí)間和溫度為1 h 和75 ℃。不同料液比對(duì)黑松露粗多糖提取率的影響如圖3 所示，當(dāng)料液比從10 g/mL增加到30 g/mL 時(shí)，提取率明顯提高到10.88%，當(dāng)料液比達(dá)到1:30 g/mL 時(shí)，最大值為10.88%。然而，當(dāng)料液比持續(xù)增加到30 g/mL 和50 g/mL 時(shí)，曲線開始緩慢下降。葛俊宏等[29]提取人參多糖，最佳的料液比為1:30 g/mL，最高得率為9.87%。人參多糖料液比超過1:30 g/mL 時(shí)，多糖得率卻出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，與本文多糖得率趨勢(shì)相近。當(dāng)料液比過大時(shí)，溶劑體積越大，提取后在高溫下濃縮需要很長的時(shí)間，導(dǎo)致黑松露粗多糖的分子結(jié)構(gòu)被破壞[30]。因此，本文最佳料液比為1:30 g/mL。

圖3 料液比對(duì)黑松露粗多糖提取率的影響Fig.3 Effect of material liquid ratio on the yield of crude polysaccharide from Tuber sinense

2.2 黑松露粗多糖提取條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取時(shí)間、提取溫度和料液比3 個(gè)因素為自變量，以黑松露粗多糖得率為響應(yīng)值，建立試驗(yàn)?zāi)Ｐ停_定17 組試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)多元回歸分析的結(jié)果，黑松露多糖的得率（R ）由以下二次函數(shù)求得型號(hào)：Y=11.64+0.14A+0.44B+0.075C-0.56AB+0.21AC-0.035 BC-1.02A2-1.59B2-0.85C2。響應(yīng)面二次模型的方差分析（ANOVA）如表3 所示。

表3 二次回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the developed quadratic regression model

回歸模型的統(tǒng)計(jì)顯著性用F檢驗(yàn)和p值檢驗(yàn)，如方差分析表3 所示，高F值（12.21）和低p值（p=0.0017＜0.01）表明該模型具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。缺乏擬合的F值和p值分別為5.01 和0.08。p值＞0.05 表明，與純誤差相比，擬合不足不顯著，這意味模型方程足以預(yù)測(cè)這些變化[31]。同時(shí)，測(cè)定系數(shù)（R2）、校正決定系數(shù)（R2adj）和變異系數(shù)（C.V）分別為94.01%、86.31%和4.59%。這表明該模型在試驗(yàn)誤差方面存在可接受范圍，是預(yù)測(cè)黑松露得率的可靠模型[32]。根據(jù)該模型，影響黑松露粗多糖提取率的因素為B（料液比）＞A（提取溫度）＞C（提取時(shí)間）。

2.2.2 黑松露粗多糖響應(yīng)面交互作用影響結(jié)果

通過對(duì)響應(yīng)面圖和等高線圖的分析，進(jìn)一步探討了三者之間的相互作用對(duì)黑松露粗多糖提取率的影響[33]。由料液比與提取溫度等高線圖的疏密程度可以看出，表明料液比對(duì)云南黑松露提取率的影響要大于提取溫度，二者交互作用顯著（圖4a）。而料液比與提取時(shí)間和提取時(shí)間與提取溫度的等高線圖呈現(xiàn)圓形，表明二者交互不顯著（圖4c、4e），與方差分析結(jié)果一致。如圖4b、4d 和4f 所示，它們的響應(yīng)面上的峰值也同時(shí)存在于它們的最小橢圓中，表明在所選范圍內(nèi)存在極值。三維響應(yīng)面圖和等高線圖如圖4a～4f 所示，最佳提取條件為：提取時(shí)間1.02 h，提取溫度75.36 ℃，料液比1:31.33 g/mL，多糖得率最高為11.86%。與其它食用菌多糖提取率相比，采用超聲輔助提取的塊菌多糖提取率為7.17%[34]，采用水浴提取杏鮑菇和長根菇多糖，得率分別為5.4%和5.85%[35-36]。因此，本研究所采用的方法能顯著提高多糖的提取率。

圖4 料液比和提取溫度（a,b）、提取時(shí)間和料液比（c,d）、提取時(shí)間和提取溫度（e,f）對(duì)多糖得率的響應(yīng)面圖和等值線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot of material liquid ratio and extraction temperature (a,b),extraction time and material liquid ratio (c,d),extraction time and extraction temperature (e,f) on the yield of polysaccharides

2.2.3 云南黑松露粗多糖提取試驗(yàn)的驗(yàn)證

根據(jù)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)以及得到模型的整理分析，得出最大響應(yīng)值為11.86%，通過軟件對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析，得出黑松露粗多糖提取的最佳條件為：水浴溫度為75.36 ℃，料液比為1:31.32 g/mL，提取時(shí)間為1.02 h。為了驗(yàn)證該條件的可靠性，需完成三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，將水浴溫度修改為75 ℃，提取時(shí)間修改為1 h，料液比修改為1:31 g/mL，三次試驗(yàn)得到的平均得率為11.79%，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.07%。通過驗(yàn)證試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)與響應(yīng)面設(shè)計(jì)的預(yù)測(cè)值相差不大，說明該模型可靠，可信度較高，適用于黑松露粗多糖提取工藝的優(yōu)化。

2.3 黑松露粗多糖的純化

采用Sevag 法脫去黑松露粗多糖中的蛋白質(zhì)，濃縮后透析，得到除去雜質(zhì)的黑松露粗多糖，最后測(cè)定多糖的蛋白含量為2.23%，說明黑松露粗多糖經(jīng)過前處理，蛋白質(zhì)基本上已經(jīng)除去。黑松露粗多糖多酚含量為0.49%，表明黑松露粗多糖幾乎不含多酚不會(huì)對(duì)后續(xù)抗氧化實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾。如圖5 所示，根據(jù)DEAE-Sepharose快速流動(dòng)柱的洗脫曲線，得到四個(gè)峰（TSP-1、TSP-2、TSP-3 和TSP-4）。對(duì)四個(gè)組分收集、濃縮、透析、凍干后，進(jìn)行多糖活性試驗(yàn)（TSP-4 含量最低的組分除外）。

圖5 黑松露粗多糖經(jīng)DEAE-Sepharose 快速流動(dòng)柱的梯度洗脫曲線Fig.5 Stepwise elution curve of crude TSP on DEAE sepharose fast flow column

2.4 黑松露多糖單糖組成分析

黑松露多糖離子色譜圖如圖6 所示。將多糖樣品的離子色譜圖譜與混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的離子色譜圖譜比對(duì)確定樣品的單糖組成；分別記錄各組成單糖的峰面積，由面積歸一法計(jì)算各單糖組成摩爾比[37]。結(jié)果表明，TSP-1 的單糖組成為鹽酸氨基半乳糖、葡萄糖和甘露糖，比例為2.8:77.1:20（圖6b）；TSP-2 為鼠李糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖，比例為18.7:1.5:2:40.6:37.3（圖6c）；TSP-3 為鼠李糖、鹽酸氨基葡萄糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖的比例為13:3.5:58.4:21.1:2.7:1.2（圖6d）。TSP-1、TSP-2和TSP-3 的主要成分均為葡萄糖。TSP-2 和TSP-3 中含有鹽酸氨基葡萄糖，TSP-3 中只含有葡萄糖醛酸。

圖6 16 種標(biāo)準(zhǔn)單糖(a)和TSP-1(b)、TSP-2(c)、TSP-3(d)組分單糖的離子色譜圖Fig.6 The ion chromatograms of 16 standard monosaccharides(a) and component monosaccharides released from TSP-1 (b),TSP-2 (c) and TSP-3 (d)

2.5 黑松露多糖的體外抗氧化活性

2.5.1 不同組分黑松露多糖對(duì)DPPH 自由基清除活性的影響

研究了不同濃度的Vc、Crude TSP、TSP-1、TSP-2和TSP-3 對(duì)DPPH 自由基的清除活性，結(jié)果如圖7 所示，TSP-3 在0～4 mg/mL 濃度下對(duì)DPPH 自由基有明顯的清除作用，且呈濃度依賴性。與TSP-1 和TSP-3多糖相比，Crude TSP 和TSP-2 具有顯著的清除活性。在4.0 mg/mL 濃度下，Crude TSP、TSP-1、TSP-2、TSP-3 和Vc 對(duì)DPPH 自由基的清除率分別為73.93%、36.67%、73.60%、54.10%和95.07%。對(duì)DPPH 自由基的清除能力依次為Vc＞Crude TSP＞TSP-2＞TSP-3＞ TSP-1。李銀莉等[38]研究表明純化前后馬齒莧多糖對(duì)DPPH 自由基的最大清除率分別為69.73%和64.54%，純化前多糖對(duì)DPPH 自由基的清除率大于純化后的多糖，原因可能是粗多糖中多酚等其他抗氧化物也對(duì)DPPH 自由基起到一定清除作用，所以黑松露多糖粗提物對(duì)DPPH 自由基具有良好的清除能力[39]。

圖7 CrudeTSP,TSP-1,TSP-2 和TSP-3 的DPPH 自由基清除活性Fig.7 Seavenging activity of crudeTSP,TSP-1,TSP-2 and TSP-3 on DPPH radical

2.5.2 不同組分黑松露多糖對(duì)ABTS 自由基清除活性的影響

ABTS 氧化后形成穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS+自由基，在734 nm 處有特征吸收峰[40]。加入黑松露多糖樣品后，藍(lán)綠色逐漸褪色或消失，吸光度值逐漸降低，從而判斷其抗氧化活性。從圖8 可以看出，濃度范圍為0～4 mg/mL，樣品和陽性對(duì)照（Vc）的清除率隨濃度的增加而增加。當(dāng)濃度為4 mg/mL 時(shí)，Crude TSP、TSP-1、TSP-2、TSP-3 和Vc 的清除率分別為60.47%、36.20%、41.87%、52.73%和94.87%。ABTS 的清除能力為Vc＞crudeTSP＞TSP-3＞TSP-2＞TSP-1。王晴等[41]人研究復(fù)合真菌多糖的DPPH與ABTS 自由基清除作用均在70%以上，其它研究表明，多糖對(duì)ABTS 自由基的清除能力與DPPH 自由基的清除能力具有一致性[42]。在本實(shí)驗(yàn)中，Crude TSP、TSP-1 和TSP-3 的ABTS表現(xiàn)出與DPPH 自由基清除能力相似的趨勢(shì)。

圖8 CrudeTSP,TSP-1,TSP-2 和TSP-3 的ABTS 自由基清除活性Fig.8 Scavenging activity of crude TSP,TSP-1,TSP-2 and TSP-3 on ABTS radical

2.5.3 不同組分黑松露多糖對(duì)金屬螯合能力的影響

人體呼吸作用、一系列酶活性、氧轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化還原反應(yīng)都與鐵離子有關(guān)。同時(shí)，鐵離子非常活躍，可以促進(jìn)許多重要分子的氧化[43]。因此，可通過測(cè)量其黑松露多糖里的自由基螯合Fe2+絡(luò)合物，阻止·OH 的產(chǎn)生來反映其抗氧化能力（圖9）。Crude TSP、TSP-1、TSP-2 和TSP-3 的金屬螯合能力與EDTA-2Na 有一定差距，但仍有一定的金屬螯合能力。在4 mg/mL 濃度下，Crude TSP 具有良好的金屬螯合能力（61.63%），其次是TSP-2、TSP-3 和TSP-1（52.50%、43.17%和27.00%）。抗氧化劑的金屬螯合能力與其官能團(tuán)-OH、-SH、-COOH、C=O、-S-、-O-有關(guān)。Crude TSP、TSP-2和TSP-3 可能含有較多的官能團(tuán)，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究[44]。

圖9 CrudeTSP,TSP-1,TSP-2 和TSP-3 的金屬離子鰲合力Fig.9 Metalion chelating ability of crude TSP,TSP-1,TSP-2 and TSP-3

2.5.4 不同組分黑松露多糖對(duì)還原力測(cè)定的影響

天然產(chǎn)物的還原力也是評(píng)價(jià)其抗氧化活性的指標(biāo)之一。不同組分黑松露多糖的還原能力如圖10 所示，吸光度越高，還原能力越強(qiáng)?？偟膩碚f，在確定的濃度范圍內(nèi)，TSP-3 的還原能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，但TSP-3的還原能力明顯高于其他樣品。在4.0 mg/mL濃度下，Crude TSP、TSP-1、TSP-2 和TSP-3 的吸光度分別為0.39、0.34、0.28 和0.56。本文測(cè)定黑松露多糖的還原力與吳金松等人[45]研究信陽毛尖茶末多糖的還原力趨勢(shì)相似，其最大吸光值為0.536。

圖10 CrudeTSP,TSP-1,TSP-2 和TSP-3 的還原能力Fig.10 Reducing power of crude TSP,TSP-1,TSP-2 and TSP-3

3 結(jié)論

采用超聲波輔助水浴醇沉法提取黑松露粗多糖，為確定黑松露粗多糖的最佳提取工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 法設(shè)計(jì)了三因素三水平，以粗多糖的提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。提取率為11.79%。以DEAE-Sepharose 快流動(dòng)柱為基礎(chǔ)，得到了TSP-1、TSP-2 和TSP-3 三種主要組分。離子色譜顯示TSP-1 由鹽酸氨基半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成。TSP-3 中含有鼠李糖、鹽酸氨基葡萄糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖，而TSP-2 中不含葡萄糖醛酸。Crude TSP、TSP-1、TSP-2 和TSP-3 具有較強(qiáng)的清除DPPH 自由基、ABTS 自由基的清除能力，有一定的金屬螯合能力與還原能力。Crude TSP 的抗氧化活性最好，這可能與粗多糖中其它抗氧化劑的含量有關(guān)。其中TSP-3 還原力優(yōu)于粗多糖，推測(cè)純化后含量最高的TSP-3 含有一定量的鹽酸氨基葡萄糖與葡萄糖醛酸，可以與產(chǎn)生·OH 等自由基所必需的金屬離子絡(luò)合，使羥自由基的產(chǎn)生受到抑制，還原力增強(qiáng)。同時(shí)，TSP-2 和TSP-3 的抗氧化活性均優(yōu)于TSP-1。本研究為進(jìn)一步對(duì)黑松露多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、功能活性深入研究奠定了基礎(chǔ)，也為黑松露相關(guān)食品和藥物的開發(fā)與應(yīng)用提供了理論依據(jù)。