GC-MS 法結(jié)合酸酯化預處理測定不同地區(qū)油茶籽油脂肪酸含量

唐旭曉，張應(yīng)中，王靜，張盟雨，徐煲鏵

（廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣東省林業(yè)科學研究院，廣東廣州 510520）

油茶（Camellia oleiferaAbel.）屬山茶科山茶屬，在我國已有兩千多年的栽培和利用歷史[1]，廣泛分布于南方大部分省份的丘陵地區(qū)，與核桃、烏桕和油桐并稱為我國四大木本油料樹種，與油棕、油橄欖和椰子并稱為世界四大木本油料樹種[2]。油茶籽油（C.oleiferaseeds oil），簡稱茶油，是油茶成熟種子中提取的我國特有的木本食用油脂[3]，具有延緩動脈粥樣硬化[4]、預防心血管疾病、保肝涼血、抗氧化、抗腫瘤、降血壓等保健功能[5-9]，有“長壽油”之稱。

脂肪酸的構(gòu)成（種類、含量和比例等）是衡量油脂品質(zhì)的重要指標，很大程度上決定了食用油的營養(yǎng)價值[10]，茶油中的脂肪酸易受產(chǎn)地、品種、加工工藝、貯藏條件等影響，進而影響茶油品質(zhì)和營養(yǎng)。油茶種植因受土壤、氣候、海拔等影響，使得不同產(chǎn)地的茶油營養(yǎng)價值各不相同。近幾年，對不同地區(qū)中茶油營養(yǎng)成分的差異性研究越來越關(guān)注。葉敏倩等[11]對湖北、江西、浙江、湖南等地茶油中甾醇、角鯊烯、生育酚、脂肪酸等主要特征組分進行了分析，結(jié)果表明湖南茶油具有較高的特征組分。王亞萍等[12]對江西、湖南、福建、四川等地油茶籽中脂肪酸進行了差異性分析，在檢測出的10 種脂肪酸中飽和脂肪酸含量差異顯著，不飽和脂肪酸含量差異不顯著。何小三等[13]對江西省36 個地區(qū)茶油進行分析，指出9 種脂肪酸各組分間具有極顯著的相關(guān)性。王召瀅等[14]對江西省內(nèi)30個地區(qū)茶油脂肪酸進行指紋圖譜分析，檢測出9 種共有脂肪酸，繪制了茶油脂肪酸組成譜系圖。楊凱等[15]對浙江、湖南、廣西、江西等地茶油脂肪酸進行分析，共檢測出8 種脂肪酸，指出江西茶油品質(zhì)最高。因此，分析不同地區(qū)茶油的脂肪酸組成及含量差異，有利于更全面地了解各地區(qū)茶油的特色營養(yǎng)。

脂肪酸測定常用的預處理方法有酯化法、三氟化硼法、三甲基氫氧化硫法和三甲基硅重氮甲烷法等[16-19]。在選擇酯化預處理方法中，需根據(jù)測定目標脂肪酸進行選擇，不同方法中脂肪酸甲酯化程度不同，使測得的脂肪酸構(gòu)成各不相同，甚至差異較大[16-18]。范亞葦?shù)萚17]比較了酸酯化、堿酯化和三甲基硅重氮甲烷法，結(jié)果表明三種方法檢測出脂肪酸含量分別為64.13%、72.37%和82.47%?？苄惴f等[18]對酸酯化和堿酯化方法進行了比較，結(jié)果表明這兩種方法檢測出脂肪酸含量分別為63.28%和3.26%。本研究在比較酸酯化和堿酯化方法基礎(chǔ)上，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析湖南、廣東、江西、海南、廣西和云南6 個地區(qū)茶油的脂肪酸含量差異，以期為探討各地區(qū)油茶特征品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

油茶籽分別采集于湖南、廣東、江西、海南、廣西和云南共6 個不同省份，樣品編號和樣品來源見表1。各地區(qū)油茶籽經(jīng)75 ℃烘干、恒重后，使用榨油機180 ℃控溫、螺旋壓榨成油茶籽油。

表1 油茶籽樣品信息表Table 1 Sample information table of Camellia oleifera Abel.

1.2 試劑

石油醚、二甲苯、氫氧化鉀、乙醇、正己烷、無水硫酸鈉，分析純，天津大茂化學試劑廠；硫酸，分析純，廣州化學試劑廠；甲醇，色譜純，Mreda Technology inc，USA。

1.3 主要儀器設(shè)備

QP2020 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），島津色譜儀器有限公司；SH-Rxi-5Sil MS 毛細管柱，上海安譜實驗科技股份有限公司；AR423CN 型分析天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋，上海洪紀儀器設(shè)備有限公司；BOZY-01G型家用榨油機，樂清市韓皇電器科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 堿酯化法

準確稱取0.1 g 油樣，與2 mL 1:1 二甲苯-石油醚混合溶液充分溶解后，邊搖晃邊加入4 mL 0.4 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，振搖至溶液澄清后用蒸餾水定容至20 mL。再次振蕩混勻，靜置分層，取上清液加入幾滴無水乙醇使其迅速澄清，加入少許無水硫酸鈉后，靜置吸取上清液進行GC-MS 分析。

1.4.2 酸酯化法

準確稱取0.1 g 油樣，加入2 mL 1%硫酸-甲醇溶液，于70 ℃水浴中加熱60 min 后取出。再加入2 mL正己烷，并用蒸餾水定容至10 mL，靜置分層，取上清進行GC-MS 分析。

1.4.3 GC-MS 分析條件

GC 柱箱溫度100 ℃，進樣口溫度250 ℃，進樣方式為分流，進樣量1 μL。流量控制方式為壓力，壓力73.0 kpa，總流量24.0 mL/min，柱流量1.00 mL/min，線速度37.2 cm/sec，吹掃流量3.0 mL/min，分流比20。MS 離子源溫度230 ℃、接口溫度280 ℃、溶劑延遲時間3 min?？偝绦驎r間為45 min，溫度先升至100 ℃，保持2 min，然后以10 ℃/min 的速率升至200 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min 的速率升至250 ℃，保持8 min，最后以10 ℃/min 的速率升至280 ℃，保持7 min。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

檢測結(jié)果采用GC-MS 分析軟件進行分析，脂肪酸甲酯經(jīng)計算機檢索與計算機標準譜圖庫美國國家標準技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST05）檢索對比，結(jié)合各種脂肪酸標樣保留時間的對比確定脂肪酸的組成，根據(jù)面積歸一化法計算脂肪酸的相對含量。每個樣品三平行。使用SPSS Statistics 17.0 進行方差分析及多重比較，并采用 Excel 2019 軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種甲酯化處理方法對比

分別采用堿酯化法和酸酯化法對茶油樣品進行甲酯化處理，經(jīng)檢測分析，獲得各脂肪酸的GC-MS 色譜圖（見圖1）。由圖1 可知，兩種預處理方法獲得的茶油脂肪酸質(zhì)譜圖存在差異。堿法催化效率較高，使得堿甲酯化法檢測的GC-MS 色譜響應(yīng)面積更大，但酸法甲酯化色譜峰重疊較少、脂肪酸檢測效果更好，適合脂肪酸含量高的油脂，與劉華鼐等[19]報道相符。其原因可能是，酸酯化法能夠檢測游離型和甘油三酯型兩種脂肪酸，堿酯化法則不適合游離型脂肪酸甲酯的制備[17-18]。本研究采用的兩種甲酯化預處理方法獲得的茶油脂肪酸含量差異性分析如表2 所示。

表2 兩種甲酯化方法處理茶油獲得的脂肪酸含量及其差異性分析Table 2 Analysis of contents and significant differences in fatty acids by two methyl esterification methods

圖1 兩種甲酯化法預處理茶油獲得的脂肪酸GC-MS 圖Fig.1 GC-MS spectra of fatty acids by two methyl esterification methods

油酸（C18:1）、亞油酸（C18:2）、棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）和亞麻酸（C18:3）為茶油主要脂肪酸，兩種方法處理后GC-MS 檢測到總相對含量均在98%以上。

本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，酸酯化法處理茶油樣品，可檢測出辛酸（C8:0）、十三烷酸（C13:0）、肉豆蔻酸（C14:0）等14 種脂肪酸，堿酯化法則多檢測出二十二碳酸（C22:0）、二十三碳酸（C23:0）和二十四碳酸（C24:0），比氣相色譜法[11-15]檢測更多脂肪酸組分。除油酸（C18:1）、芥酸（C22:1）、二十三碳酸（C23:0）和二十四碳烯酸（C24:1），該兩種方法預處理檢測出的13 種脂肪酸存在顯著差異（p＜0.05）。

相同的GC-MS 檢測條件下，酸酯化法處理后檢測的亞油酸相對含量（10.36%）明顯高于堿酯化法（4.77%）。原因可能是，油酸、亞油酸結(jié)構(gòu)相似，且其熱不穩(wěn)定[17]，使得堿酯化法的亞油酸甲酯色譜峰（保留時間20.305 min）受油酸甲酯（保留時間20.943 min）影響（圖1），其相對含量誤差較大。酸酯化方法可充分甲酯化各脂肪酸，綜上所述，檢測出的亞油酸色譜峰則相對獨立（保留時間20.426 min）。因此，酸酯化法預處理茶油樣品更有利于脂肪酸的測定。

2.2 不同地區(qū)茶油主要脂肪酸組成及含量分析

比較兩種甲酯化法預處理茶油樣品后，確定采用酸酯化法對6 個種源地區(qū)的茶油樣品進行處理，經(jīng)GC-MS 分析，得出茶油主要脂肪酸的總離子流色譜圖（見圖2），計算各主要脂肪酸的相對含量并進行差異性分析（見表3）。

由圖2 可知，不同產(chǎn)地茶油的脂肪酸組成種類相仿，主要脂肪酸包括肉豆蔻酸（C14:0）、棕櫚酸（C16:0）、棕櫚烯酸（C16:1）、十七酸（C17:0）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）、亞油酸（C18:2）、亞麻酸（C18:3）、花生酸（C20:0）、芥酸（22:1）、二十四碳烯酸（24:1）等。

圖2 六個地區(qū)茶油脂肪酸的GC-MS 代表性總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatograms of volatile components of Camellia oil from different regions

由表3 可知，不同茶油主要脂肪酸相對含量存在差異（p＜0.05）。六個地區(qū)中肉豆蔻酸、十七酸、花生酸、芥酸和二十四碳烯酸相對含量最高的茶油樣品均是湖南1，分別為0.10%、0.11%、0.09%、0.17%和0.07%；云南6 茶油的肉豆蔻酸和棕櫚酸相對含量則最低，分別為0.05%和11.63%。各地區(qū)茶油的十七酸含量差異較小，范圍在0.09%～0.11%之間；廣西5 茶油棕櫚酸含量最高，為12.97%，海南4 茶油的芥酸含量最低，為0.03%；海南4 和廣西5 茶油均未檢出二十四碳烯酸，其棕櫚烯酸含量最低，均為0.08%，海南4 茶油的硬脂酸相對含量最高，為3.74%；廣東2茶油的棕櫚烯酸含量則最高，為0.12%，硬脂酸的含量則最低，為2.43%。

表3 六個地區(qū)茶油主要脂肪酸含量及差異性分析Table 3 Main fatty acids contents and differences analysis of Camellia oil in different regions

海南4 茶油的油酸含量最高，達73.70%，其次為來源于湖南1 的茶油，油酸含量為73.29%±0.10%，江西3 茶油的油酸含量相對最低，為68.67%。廣東2 和江西3 兩地茶油的亞油酸含量最高，分別為15.21%和15.58%，其他四個地區(qū)茶油的亞油酸含量均低于14%，海南4 含量最低，僅為9.29%。除了海南4 地區(qū)，亞麻酸在其他五個產(chǎn)地的茶油中均有檢出，此檢出的亞麻酸為ω-3 不飽和脂肪酸家族中的α-亞麻酸，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為DHA、DPA、EPA 等，是影響大腦和腦神經(jīng)中思維力和記憶力的重要營養(yǎng)成分[20-21]，其中湖南1 茶油亞麻酸含量最高，為0.20%。

由6 個地區(qū)的茶油檢測平均結(jié)果顯示（圖3a），各類脂肪酸含量由多到少順序依次為油酸（71.10%）、亞油酸（12.91%）、棕櫚酸（12.60%）、硬脂酸（2.86%）、亞麻酸（0.10%）、十七酸（0.10%）、棕櫚烯酸（0.09%）、肉豆蔻酸（0.08%）、芥酸（0.08%）、二十四碳烯酸（0.05%）、花生酸（0.04%）和其他脂肪酸（0.03%）。其中油酸作為易被人體吸收的單不飽和脂肪酸，在6 個產(chǎn)地茶油的平均含量高達71.10%，因其具有降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇，且能減少心血管疾病風險的功效，被譽為“安全脂肪酸”[22]。亞油酸作為人體必需脂肪酸，是人體合成花生四烯酸的前體物質(zhì)，在茶油中含量達12.91%。油酸和亞油酸總相對含量達84.01%，是茶油中最主要的兩個脂肪酸，因此高含量的油酸和亞油酸常被視為衡量茶油高品質(zhì)的重要標準。

圖3 六個地區(qū)茶油各脂肪酸平均含量Fig.3 Average content of each fatty acid of Camellia oil in six regions

由圖3b 可知，茶油中84.33%的脂肪酸為不飽和脂肪酸。飽和脂肪酸主要由棕櫚酸（12.60%）、硬脂酸（2.86%）、十七酸（0.10%）、肉豆蔻酸（0.08%）、花生酸（0.04%）等組成，相對含量為15.67%，因此棕櫚酸是飽和脂肪酸的主要成分。單不飽和脂肪酸主要由油酸（71.10%）、棕櫚烯酸（0.09%）、芥酸（0.08%）、二十四碳烯酸（0.05%）等組成，相對含量為71.32%，因此油酸是單不飽和脂肪酸的主要成分。多不飽和脂肪酸主要由亞油酸（12.91%）、亞麻酸（0.10%）組成，相對含量為13.01%，因此亞油酸是多不飽和脂肪酸的主要成分。

2.3 不同地區(qū)茶油飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量對比

比較不同地區(qū)茶油主要脂肪酸相對含量差異性分析基礎(chǔ)上，進一步對比分析不同地區(qū)茶油飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和總不飽和脂肪酸的相對含量，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 六個地區(qū)茶油飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸含量比較Fig.4 Comparison of saturated fatty acids and unsaturated fatty acids of Camellia oil in six regions

由圖4 可知，6 個地區(qū)茶油中，飽和脂肪酸相對含量最高的地區(qū)是海南4 和廣西5，分別為16.87%和16.78%，含量最低的地區(qū)是云南6，為14.26%。多不飽和脂肪酸相對含量均高于9.00%，范圍是9.29%～ 15.67%，最高來自于廣東2 和江西3 的茶油樣品，最低源自海南4 的茶油樣品，符合世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的保健型營養(yǎng)油脂中人體必需脂肪酸亞油酸等多不飽和脂肪酸含量高于8.0%的要求[23]。單不飽和脂肪酸相對含量最高地區(qū)是湖南1 和海南4，分別為73.62%和73.81%，江西3 的茶油樣品相對含量最低，為68.91%。總不飽和脂肪酸是茶油脂肪酸的主要成分，相對含量均在83%以上，其中云南6 茶油的脂肪酸不飽和程度最高，達85.74%。

植物油中單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的比值越高越有利于油脂的穩(wěn)定[24]，本研究中6 個地區(qū)的茶油單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸的比值分別為7:1（湖南1）、5:1（廣東2）、4:1（江西3）、8:1（海南4）、5:1（廣西5）、5:1（云南6），其中湖南1 和海南4 最高，說明這兩個地區(qū)的茶油穩(wěn)定性較好，易于保存。

4 結(jié)論

酸酯化和堿酯化預處理油茶籽油樣品后，經(jīng)GC-MS 分析，存在顯著性差異，且酸酯化處理更利于茶油脂肪酸的分離檢測，本色譜技術(shù)結(jié)合酯化條件可檢測出更多脂肪酸組分。湖南、廣東、江西、海南、廣西、云南6 個地區(qū)茶油不飽和脂肪酸含量均在83%以上，普遍具有優(yōu)良的品質(zhì)和較高的營養(yǎng)價值，各脂肪酸含量由高到低依次為油酸＞亞油酸＞棕櫚酸＞硬脂酸＞亞麻酸＞十七酸＞棕櫚烯酸＞肉豆蔻酸＞芥酸＞二十四碳烯酸＞花生酸，油酸和亞油酸總平均含量高達84.01%。但受地理氣候環(huán)境等影響，脂肪酸相對含量各有特點和優(yōu)勢。云南茶油的脂肪酸在6 個地區(qū)中不飽和程度最高，廣東和江西茶油的多不飽和脂肪酸含量較高，湖南和海南茶油穩(wěn)定性較好。

致謝

本研究誠摯感謝廣西壯族自治區(qū)林科院油茶所陳國臣所長、云南省林業(yè)和草原科學院油茶研究所陳福所長、海南省海口市東山金茂苗木有限公司陳有師董事長、廣東省韶關(guān)市曲江區(qū)國有小坑林場梁瑞友副場長、江西省宜春市袁州區(qū)林業(yè)（油茶）局李鐵明副局長、湖南省攸縣卓聯(lián)種養(yǎng)專業(yè)合作社法人代表榮軍等提供的油茶樣品和大力支持。