河南省某一淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中非O1/O139群霍亂弧菌毒力基因及分子分型分析

炊慧霞,陳 磊,吳玲玲,賈松樹,韓志偉

非O1/O139群霍亂弧菌是指除O1群和O139群以外的霍亂弧菌血清群,呈世界性分布,廣泛存在于自然界中,在污水、海水、河水等水體,海產(chǎn)品、動物和人群中均能檢出,已成為一個公共衛(wèi)生問題[1]。近年來國內(nèi)外關(guān)于非O1/O139群霍亂弧菌致病的報道逐漸增多,在國內(nèi)非O1/O139群霍亂弧菌是引起夏、秋季腹瀉和食物中毒的主要病原菌,是重要的食源性致病菌[2-6]。

在河南省境內(nèi),根據(jù)河南省地區(qū)食品安全風(fēng)險監(jiān)測結(jié)果顯示[7],河南省淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)致病性弧菌監(jiān)測的312份樣品(淡水魚、養(yǎng)殖水體和淤泥)中檢出81株霍亂弧菌,其中非O1/O139群73株,占90.12%,檢出率頗高,由其引起的食品安全隱患不容忽視。為進一步了解其毒力基因分布及分子分型情況,為食品安全風(fēng)險評估及防控提供數(shù)據(jù)支持,進行如下研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 選擇2018年河南省淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)監(jiān)測中某一采樣點檢出的所有非O1/O139群霍亂弧菌菌株50株及從腹瀉病人分離出的非O1/O139群霍亂弧菌菌株3株,共計53株。按季度采樣進行檢測,每季度采集1次。

1.2 試劑 哥倫比亞血平板購自貝瑞特生物技術(shù)(鄭州)有限責(zé)任公司,腦心浸液肉湯培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司,細菌全基因組提取試劑盒(Ta KaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0)購自大連寶生物公司,dsDNA HS分析試劑盒(Invitrogen Qubit○RdsDNA HS Assay Kit)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。上述培養(yǎng)基及試劑均在有效期內(nèi)使用,且使用之前均經(jīng)過技術(shù)性驗收。

1.3 儀器 高速冷凍離心機(德國Sigma公司),N60-Touch超微量分光光度計(德國IMPLEN公司),Qubit 4.0熒光定量儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.4 基因組DNA提取及全基因測序 將超低溫冷凍保存的菌株劃線接種于哥倫比亞血平板上,37℃培養(yǎng)18～24 h,分別挑取上述培養(yǎng)物單個菌落接種于腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)18～24 h,分別吸取2 m L于無菌離心管中10 000 r/min離心5 min,棄上清,將沉淀物重新懸浮于無菌超純水中,再次10 000 r/min離心5 min,棄上清,將沉淀物重新懸浮于無菌超純水中,濁度控制在5.0左右,后續(xù)操作按照Ta KaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0操作手冊進行基因組DNA提取。用N60-Touch超微量分光光度計(德國IMPLEN公司)測定基因組DNA純度,用Qubit 4.0 DNA-HS進行定量,基因組DNA濃度75～168 ng/μL,最終體積是60μL。將提取的基因組DNA樣品送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行全基因組測序,實驗流程:對基因組DNA進行質(zhì)控檢測,將檢測合格的DNA樣品用超聲波破碎儀隨機打斷成長度約為350 bp的片段,經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成整個文庫制備。庫檢合格后,用Illumina NovaSeq PE150進行測序。經(jīng)過預(yù)處理后得到clean data,使用SOAP denovo、SPAdes和Abyss組裝軟件進行組裝,然后使用CISA軟件進行整合,采用gapclose軟件對初步組裝結(jié)果進行優(yōu)化和補洞,從而得到最終的組裝結(jié)果,過濾低測序深度(小于平均深度的0.35)的reads去除同lane污染。

1.5 多位點序列分析及進化樹分析 基于全基因測序結(jié)果,選擇霍亂弧菌adK、gyrB、mdh、metE、pntA、purM、pyrC等7對管家基因[8]作為MLST分析基因,利用Pub MLST-Vc數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/bigsdb?db＝pubmlst_vcholerae_seq def&page＝download Alleles)對53株霍亂弧菌菌株進行序列分型(sequence type,ST)。將7個管家基因序列串聯(lián),用最小生成樹方法進行分子進化分析,,自建perl腳本使用SVG模塊繪制,參數(shù)最大邊長度設(shè)置為50,透明度設(shè)置為0.5。

1.6 毒力基因分析 基于全基因測序結(jié)果,利用VFDB數(shù)據(jù)庫,通過BLASTN軟件進行比對,對53株非O1/O139群霍亂弧菌進行毒力基因進行篩選,設(shè)定核苷酸最小一致性為80%。

2 結(jié) 果

2.1 53株非O1/O139群霍亂弧菌測序結(jié)果描述

53株非O1/O139群霍亂弧菌Contig number(＞500 bp)為5～95個,N50 length為168 505 bp～1 018 069 bp,基因組大小為3.37 MB～4.37 MB,G＋C含量47.24%～47.84%。基因島為3～12個,平均長度8 966～19 544 bp;前噬菌體為1～10個,平均長度為5 951.5～73 574 bp。

使用SignalP(Version 4.1)、TMHMM(Version 2.0c)工具進行預(yù)測,檢測是否含有信號肽及跨膜結(jié)構(gòu),綜合預(yù)測蛋白序列是否是分泌蛋白。預(yù)測為分泌蛋白的個數(shù)為201～270個。

對于TNSS系統(tǒng),通過蛋白序列功能數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果中,提取分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白進行注釋。對于革蘭氏陰性菌,另外采用EffectiveT3軟件(Version 1.0.1)預(yù)測T3SS效應(yīng)蛋白。預(yù)測為Ⅱ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的個數(shù)為12～13個,預(yù)測為Ⅵ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的個數(shù)為0～5個,預(yù)測為Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的數(shù)量均為0個。預(yù)測為T3SS效應(yīng)蛋白的個數(shù)為132～169個。

2.2 53株非O1/O139群霍亂弧菌毒力基因檢測結(jié)果 對53株非O1/O139群霍亂弧菌進行全基因測序,參照VFDB數(shù)據(jù)庫,通過BLASTN軟件進行比對,進行毒力基因篩選。50株來源于淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)非O1/O139群霍亂弧菌菌株40.00%～100.00%具有MSHAⅣ型菌毛和Ⅳ型性菌毛等黏附因子毒力相關(guān)基因,6.00%～100.00%具有莢膜多糖抗吞噬因子毒力相關(guān)基因,100.00%具有鞭毛趨化因子或運動因子毒力相關(guān)基因,20.00%～98.00%具有hap/vvp和nan H等酶類毒力相關(guān)基因,0%～100.00%均具有腸桿菌素受體、血紅素受體、周質(zhì)結(jié)合蛋白依賴的ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、弧菌素生物合成因子和弧菌素利用因子等鐵攝取因子毒力相關(guān)基因,100.00%均具有l(wèi)uxS和cqsA密度感應(yīng)系統(tǒng)毒力基因,0%～100.00%具有EPSⅡ型分泌系統(tǒng)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)及效應(yīng)蛋白、VASⅥ型分泌系統(tǒng)及效應(yīng)蛋白等分泌系統(tǒng)毒力相關(guān)基因。42.00%～100.00%具有RTX、tlh和hlyA等毒素毒力相關(guān)基因。

3株來源于病人的非O1/O139群霍亂弧菌菌株0～3株具有MSHAⅣ型菌毛和Ⅳ型性菌毛等黏附因子毒力相關(guān)基因,1～3株具有莢膜多糖抗吞噬因子毒力相關(guān)基因,3株具有鞭毛趨化因子或運動因子毒力相關(guān)基因,2～3株具有hap/vvp和nanH等酶類毒力相關(guān)基因、腸桿菌素受體、血紅素受體、周質(zhì)結(jié)合蛋白依賴的ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、弧菌素生物合成因子和弧菌素利用因子等鐵攝取因子毒力相關(guān)基因,3株均具有l(wèi)uxS和cqsA等密度感應(yīng)系統(tǒng)毒力相關(guān)基因,0～3株具有EPSⅡ型分泌系統(tǒng)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)及效應(yīng)蛋白、VASⅥ型分泌系統(tǒng)及效應(yīng)蛋白等分泌系統(tǒng)毒力相關(guān)基因。3株具有RTX、tlh和hlyA等毒素毒力相關(guān)基因。

毒力相關(guān)因子基因具體檢測結(jié)果見表1。

表1 53株非O1/O139群霍亂弧菌毒力相關(guān)因子基因檢測結(jié)果Tab.1 Virulence related factor genes testing results in 53 strains of non-O1/O139 Vibrio cholerae

2.3 53株非O1/O139群霍亂弧菌ST型分布 53株非O1/O139群霍亂弧菌菌株分屬19個ST型,其中50株來源于淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的非O1/O139群霍亂弧菌菌株分屬17個ST型,依次為ST4(19株,占38.00%),ST5(6株,占12.00%),ST7(3株,占6.00%),ST11(3株,占6.00%),ST16(3株,占6.00%),ST3(2株,占4.00%),ST6(2株,4.00%),ST15(2株,占4.00%),ST17(2株,占4.00%),ST1(1株,2.00%),ST8(1株,2.00%),ST9(1株,2.00%),ST10(1株,2.00%),ST12(1株,2.00%),ST13(1株,2.00%),ST14(1株,2.00%),ST18(1株,2.00%)。3株來源于病人的 非O1/O139群霍亂弧菌菌株分屬2個ST型,分別為ST19和ST20。19個ST型等位基因位點變異差異數(shù)在1～7個,其中來源于淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的非O1/O139群霍亂弧菌菌株17個ST型等位基因位點變異差異數(shù)在1～7個,來源于病人的非O1/O139群霍亂弧菌菌株2個ST型與來源于淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的非O1/O139群霍亂弧菌菌株ST1、ST2、ST6和ST10屬同一簇,與ST1有6個等位基因位點變異差異數(shù),最小生成樹進化關(guān)系圖見圖1。

圖1 53株非O1/O139群霍亂弧菌最小生成樹進化關(guān)系圖Fig.1 Evolution of minimum spanning tree of 53 non O1/O139 Vibrio cholerae strains

3 討 論

非O1/O139群霍亂弧菌是重要的食源性致病菌,有研究顯示其致病因子,除個別可產(chǎn)生霍亂毒素或類霍亂毒素外,主要包括外膜蛋白、脂多糖、熱穩(wěn)定毒素、蛋白酶、溶血素/溶細胞素、磷脂酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、RTX外毒素、三型分泌系統(tǒng)和六型分泌系統(tǒng)等[9-11],其中,腸毒素、蛋白酶、溶血素和三型分泌系統(tǒng)是非O1/O139群霍亂弧菌重要的致病因子[12]。對2018年河南省淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中某一監(jiān)測點的淡水養(yǎng)殖池塘檢出的所有非O1/O139群霍亂弧菌50株和來源于2018年病人的非O1/O139群霍亂弧菌3株進行全基因測序,利用VFDB數(shù)據(jù)庫,通過BLASTN軟件進行比對,對53株非O1/O139群霍亂弧菌進行毒力基因篩選,發(fā)現(xiàn)來源于淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)和來源于病人的非O1/O139群霍亂弧菌菌株均具有MSHAⅣ型菌毛和Ⅳ型性菌毛等黏附相關(guān)因子、莢膜多糖抗吞噬因子、鞭毛趨化因子或運動因子、hap/vvp和nanH等蛋白酶類,腸桿菌素受體、血紅素受體、周質(zhì)結(jié)合蛋白依賴的ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、弧菌素生物合成因子及弧菌素利用因子等鐵攝取因子,luxS和cqsA等密度感應(yīng)系統(tǒng),EPSⅡ型分泌系統(tǒng)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)、VASⅥ型分泌系統(tǒng)及效應(yīng)蛋白等分泌系統(tǒng),RTX、tlh及hlyA等20種毒素毒力相關(guān)因子基因,缺失AFC、IVB型菌毛、Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白、ace、CTX、tdh、zot等毒力相關(guān)因子基因,部分毒力相關(guān)因子或部分菌株的毒力相關(guān)因子毒力基因不全。兩種不同來源菌株的毒力因子基因攜帶情況相近,除MSHAⅣ型菌毛毒力因子mshA基因、莢膜多糖wbuB基因、wbfY基因、rmlB基因、血紅素受體hutA基因及Ⅲ型分泌系統(tǒng)vscC2和vcrD2基因外,部分菌株二者攜帶相同的毒力因子基因。兩種不同來源菌株具有蛋白酶、溶血素和Ⅲ型分泌系統(tǒng)等非O1/O139群霍亂弧菌重要的致病因子,均不具有腸毒素致病因子。有文獻報道,霍亂弧菌中主要有兩個毒力基因簇,一個是編碼霍亂毒素基因的CTXΦ絲狀噬菌體,另一個是毒素共調(diào)菌毛TCP,TCP是霍亂弧菌在腸道的重要定植因子,CTXΦ絲狀噬菌體能夠通過TCP受體感染其他具有TCP的非產(chǎn)毒霍亂弧菌,將具有CTXAB基因的CTXΦ進行轉(zhuǎn)移,使非產(chǎn)毒株轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)毒株[13-15]。本次研究中50株淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)和3株病人來源菌株均未發(fā)現(xiàn)CTXAB基因和/或TCP基因,尚未發(fā)現(xiàn)將具有CTXAB基因的CTXΦ進行轉(zhuǎn)移使非產(chǎn)毒株轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)毒株現(xiàn)象。有數(shù)據(jù)顯示,甲魚與霍亂疫情中感染來源與甲魚高度相關(guān)[16-19],研究發(fā)現(xiàn),MSHA、毒素共調(diào)菌毛(toxin-coregulatedpili,TCP)和幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(N-acetylglucosaminebinding protein A,GBP)是霍亂弧菌的3個重要定居因子,其中MSHA是霍亂弧菌定居于浮游生物表面的重要因子,而TCP和GBP在霍亂弧菌定植于哺乳動物小腸時發(fā)揮主要作用[20-22]。本次研究中50株淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)來源菌株中40%具有mshA基因,3株病人來源菌株則缺失mshA基因,兩者均不具有TCP基因,推測非O1/O139群霍亂弧菌菌株具有一定浮游生物表面定植能力,可以在一些水產(chǎn)品表面定植,但因不具有TCP等定植于哺乳動物小腸基因,影響非O1/O139群霍亂弧菌部分致病能力。

本次研究中53株非O1/O139群霍亂弧菌分屬19個ST型,ST4和ST5是優(yōu)勢ST型,養(yǎng)殖環(huán)節(jié)來源的菌株與病人來源的菌株分屬不同的ST型。

河南省淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)非O1/O139群霍亂弧菌菌株MLST分型多樣化,攜帶多種毒力相關(guān)因子,部分菌株與病人菌株攜帶的毒力基因相同,雖然分屬不同的ST型,但還是存在食品安全風(fēng)險,提醒有關(guān)部門采取措施,降低由于淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中非O1/O139群霍亂弧菌污染導(dǎo)致從養(yǎng)殖場到餐桌的污染風(fēng)險,減少非O1/O139群霍亂弧菌感染引發(fā)的食源性疾病的發(fā)生,保障食品安全。

利益沖突:無

引用本文格式:炊慧霞,陳磊,吳玲玲,等.河南省某一淡水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中非O1/O139群霍亂弧菌毒力基因及分子分型分析[J].中國人獸共患病學(xué)報,

2021,37(12):1091-1095.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.154