“秩邊透水道”針法對子宮內膜異位癥大鼠Beclin-1、LC3調節(jié)作用的研究

劉璇,王海軍,張黎,劉高峰,曹玉霞,司佳弘,李帥帥,孫瑞英

（1.山西中醫(yī)藥大學,太原 030619;2.天津中醫(yī)藥大學,天津 301617;3.山西中醫(yī)學院第三中醫(yī)院,太原 030024;4.臺州市第一人民醫(yī)院,臺州 318082）

子宮內膜異位癥（endometriosis, EMS）指正常脫落的子宮內膜上皮細胞因攜帶活性,而種植在腹壁、卵巢等位置[1],育齡婦女易患,主要臨床表現(xiàn)為下腹痛、不孕、性交痛。該病發(fā)病率逐年上升,達10%～20%[2],不孕婦女中發(fā)病率更高,嚴重危害了患者的正常生活和日常工作,但目前西醫(yī)主要通過激素和外科手術治療,機體副作用大且患者復發(fā)率高[3]。

針灸作為一種安全、有效、快速的純綠色療法,被越來越多的患者認可,吸引了社會關注。山西中醫(yī)藥大學冀來喜教授制定了“秩邊透水道”針法的臨床操作規(guī)范,系統(tǒng)、客觀地評價了此針法臨床使用的安全性和有效性,并總結了此針法的適應證、禁忌證,由最初的治療前列腺相關疾病拓展至泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)[4]的各類疾病,諸如原發(fā)性痛經[5]、外陰瘙癢等婦科及產后尿潴溜[6]等產科疾患,通過解除局部肌肉痙攣來緩解痛經,而且該針法取穴少而精,臨床使用價值高。

有研究證實EMS的發(fā)生發(fā)展中存在自噬的介入[7],而臨床實踐中發(fā)現(xiàn)針刺治療 EMS有著較好的療效,但其作用機制有待進一步研究。為進一步探明其治療EMS的作用機理,本研究擬采用EMS大鼠模型,透射電鏡觀察超微自噬結構,并通過檢測大鼠子宮內膜組織中LC3、Beclin-1基因和蛋白表達水平,以探明“秩邊透水道”針法治療EMS的作用機理?，F(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雌性SD大鼠,50只,8周齡性成熟未交配,體質量（180±20） g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證編號為 SCXK（京）2016-0006,在山西中醫(yī)藥大學科研大樓針灸推拿實驗室動物房飼養(yǎng),房間濕度40%～50%,溫度（24～26） ℃。本實驗已得到山西中醫(yī)藥大學倫理委員會的批準。根據(jù)隨機數(shù)表法,大鼠被分為模型組、假手術組、針刺組、激動劑組和針刺加抑制劑組,每組10只。

1.2 主要儀器和試劑

一次性針灸針 0.25 mm×15 mm,雷帕霉素（美國MCE, HY-10219）,3-甲基腺嘌呤（美國 MCE,HY-19312）,苯甲酸雌二醇,青霉素粉針劑（華北制藥股份有限公司,規(guī)格 0.96 g,160萬單位）,高級熒光顯微鏡 Eclipse Ci-L（日本 Nikon）;全景切片掃描儀 PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000（3DHISTECH, Hungary）,透射電鏡HITACHI HT 7700 120 kv;LeicaRM 2135自動切片機（德國 Leica）;熒光定量PCR儀Stepone plus（ABI）;酶標檢測儀Rt 2100 c（Rayto）;ACTIN抗體（Servicebio, GB12001）;Beclin 1 抗體（Servicebio,GB13228-2）;LC3 抗體,（武漢三鷹,14600-1-ap）。

1.3 大鼠EMS模型的建立

造模方法參考文獻[8],術前 1 d對大鼠禁食,不禁飲,選用苯甲酸雌二醇（0.1 mg/kg）,給50只SD大鼠皮下注射,人為干預使大鼠在同一動情周期進行手術,腹腔注射10%水合氯醛,按0.3 mL/100 g的劑量麻醉。固定大鼠四肢,備皮,棉球蘸 75%的乙醇,對施術部位消毒,在尿道口上方1.5 cm處,沿腹中白線,依次剪開腹壁肌層、腹膜肌層（切口控制在2 cm以內）,找到左側子宮,在上下兩端結扎,剪取長2 cm子宮,清洗子宮體,縱向切開子宮腔,剝去子宮肌層后,將內膜剪成大概5 mm×5 mm,縫于大鼠右側腹部。造模結束后,腹部注射青霉素鈉液[9]。腹部切口用絲線縫合。密切關注各組大鼠術后的精神狀態(tài)以及手術切口的愈合情況,醒后照常喂養(yǎng)。假手術組大鼠不造模。在建模 15 d后,開腹探查造模是否成功。

1.4 干預方法

針刺組將大鼠的四肢固定于自制鼠板上,根據(jù)《實驗針灸學》[10]并參照大鼠骨骼與體型取兩側“秩邊”穴（臀外下部,股骨大轉子與薦椎尾椎結合部連線外1/3與中 1/3交點處[11]）,穴位處消毒,選 0.25 mm×15 mm的不銹鋼毫針針刺,從秩邊穴進針,順著同側的水道穴逐漸深入,進針深度 13 mm左右,針下落空后,普通提插捻轉,不行補瀉,手法輕微,留針20 min;激動劑組予以大鼠自噬激動劑雷帕霉素（50 μmoL/L）,2 mg/（kg·d）,腹腔注射;針刺加抑制劑組大鼠在針刺治療的基礎上予以自噬抑制劑 3-MA（3-甲基腺嘌呤400 nmoL/μL）,1.5 mg/（kg·d）,腹腔注射。模型組及假手術組只進行固定。各組 1周干預 6次,共干預 3周。

1.5 指標檢測

1.5.1 異位病灶觀察及測量

造模15 d后開腹,肉眼觀察異位種植膜生長情況,卡尺測量其長（A）、寬（B）、高（C）,根據(jù)橢球體積公式V（mm3）＝0.52×A×B×C 計算體積,以 V＞25 mm3為建模成功。

1.5.2 子宮內膜組織病理學觀察

取大鼠子宮內膜組織固定切片,脫蠟,染色后光鏡觀察其病理變化。根據(jù)文獻中病理診斷標準[12],造模成功的標準為子宮內膜上皮細胞可在種植膜囊壁內層結構中發(fā)現(xiàn),呈整齊柱狀排列,局部還有豐富的新鮮微血管形成。

1.5.3 大鼠超微結構電鏡觀察

確定大鼠子宮內膜新鮮組織的取材部位,體積不超過1 mm×1 mm×1 mm,置于電鏡固定液中,磷酸緩沖液漂洗后鋨酸磷酸緩沖液室溫固定,磷酸緩沖液再次漂洗后組織依次脫水;滲透過夜;烤箱聚合;超薄切片機切片60～80 nm;鈾鉛雙染色;電鏡下觀察切片,采集圖像,進行分析。

1.5.4 RT-qPCR法檢測大鼠Beclin 1 mRNA、LC3 mRNA表達

從﹣80 ℃冰箱中取出大鼠子宮內膜組織。采用Trizol法提取RNA,Nanodrop 2000酶標儀測定RNA的純度及質量濃度,進行逆轉錄,按照試劑盒操作步驟,利用 RocheqPCR儀檢測,該基因相對表達量的計算方法是2﹣△△Ct法（p）。引物由武漢塞維爾生物科技有限公司提供合成,片段長度為 138 bp,退火溫度 60 ℃,用qPCR法檢測提取大鼠子宮在位、異位內膜的總 RNA,用RT-qPCR法檢測LC3、Beclin-1。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.5.5 Western blot法檢測大鼠Beclin 1、LC3蛋白表達

從﹣80 ℃冰箱中取出大鼠子宮內膜組織。檢測時取出內膜組織加入RIPA裂解緩沖液,研磨均勻,靜置,取上層清液,離心 10 min,提取內膜組織總蛋白溶液,測定蛋白濃度,充分變性蛋白,電泳,轉膜,漂洗,溫封閉處理,加入抗體,一抗稀釋比均為1:1 000,孵育。洗膜后,加入二抗,二抗稀釋比為 1:3 000,室溫孵育,洗模,采集凝膠圖像,采用Alpha軟件分析目標帶的光密度值,目的蛋白與內參灰度值比值即為各目的蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。若為正態(tài)分布的計量資料,用均數(shù)±標準差表示,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析,進一步采用LSD法進行兩兩比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EMS大鼠異位病灶體積變化

與治療前比較,模型組治療后異位病灶體積增大但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,其余各組大鼠的異位病灶體積均不同程度縮小（P＜0.01）;與模型組比較,針刺組、激動劑組、針刺加抑制劑組大鼠治療后的異位病灶體積均明顯縮?。≒＜0.01）,囊性生長物變扁平,囊內清亮液體也有所減少;與針刺加抑制劑組比較,針刺組病灶體積明顯降低（P＜0.05）,詳見表2。

表2 各組EMS大鼠異位病灶體積的改變 （±s，mm3）

表2 各組EMS大鼠異位病灶體積的改變 （±s，mm3）

注:與同組治療前比較 1）P＜0.01;與模型組比較 2）P＜0.01;與針刺組比較 3）P＜0.05

組別 n 劑量/mg（kg·d） 治療前 治療后假手術組 10 - - -模型組 10 - 90.22±19.15 117.33±38.68針刺組 10 - 91.35±18.97 31.77±15.251）2）激動劑組 10 2 91.66±20.11 33.16±10.621）2）針刺加抑制劑組 10 1.5 90.68±19.92 72.58±18.201）2）3）

2.2 EMS大鼠子宮內膜病理學變化

造模15 d后,開腹觀察大鼠異位灶種植情況,發(fā)現(xiàn)移植在腹壁的子宮內膜生長非常良好,種植物呈囊狀,體積已超出原種植范圍,有豐富的新鮮毛細血管流通,囊泡內有清亮液體。假手術組的大鼠子宮內膜上皮細胞呈高柱狀,排列緊湊,結構完整,未見明顯異常;模型組大鼠子宮內膜中有囊腫,血供豐富,肌纖維排列順序不規(guī)則;針刺組的大鼠子宮內膜上皮有萎縮、脫落的矮立方狀細胞,周圍毛細血管較少,出現(xiàn)纖維化。激動劑組的大鼠子宮內膜上皮細胞較完整,少量壞死,血供減少。針刺加抑制劑組的大鼠子宮內膜上皮細胞大量壞死,肌纖維排列不規(guī)則,詳見圖2。

圖2 各組大鼠內膜組織病理學的變化（HE染色，×100）

2.3 各組大鼠子宮內膜自噬小體及其超微結構分析

假手術組大鼠子宮內膜細胞中線粒體豐富,存在一定數(shù)量的自噬小體,核膜完整、胞核規(guī)則、核內染色質分布均勻,雙層結構清晰;模型組大鼠子宮內膜細胞內自噬泡極少,核膜短缺,核不規(guī)則,染色質不均勻,雙層結構不清晰,上皮細胞呈重度水腫,線粒體數(shù)量少;針刺組大鼠子宮內膜細胞含有較多自噬小體,有豐富的細胞器,完整的核膜;激動劑組大鼠子宮內膜細胞中自噬泡較多,核膜較完整,粗面內質網數(shù)量較多;針刺加抑制劑組大鼠子宮內膜細胞中有少量自噬泡,胞質內有不少細胞器發(fā)生變形、萎縮,核膜欠缺,核不規(guī)則。詳見圖3。

圖3 各組大鼠子宮內膜細胞的自噬體超微結構

2.4 各組大鼠子宮在位、異位內膜中 LC3、Beclin-1 mRNA表達水平的觀察

與假手術組比較,模型組在位、異位內膜的LC3、Beclin-1 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）;與模型組比較,各干預組異位內膜的LC3 mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）;針刺組與激動劑組大鼠異位內膜的LC3、Beclin-1 mRNA 表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）;針刺組、激動劑組大鼠異位內膜的LC3、Beclin-1 mRNA表達均明顯高于針刺加抑制劑組（P＜0.05）。表明EMS大鼠在位、異位內膜中LC3及Beclin-1 mRNA表達水平下降,“秩邊透水道”針法、雷帕霉素激動劑均可提高EMS模型大鼠異位內膜中LC3及Beclin-1的表達水平,詳見表3。

表3 各組大鼠LC3、Beclin-1mRNA表達水平比較 （±s）

表3 各組大鼠LC3、Beclin-1mRNA表達水平比較 （±s）

注:與假手術組比較 1）P＜0.05;與模型組比較 2）P＜0.05;與針刺組比較 3）P＜0.05;與激動劑組比較 4）P＜0.05

組別 n LC3 Beclin-1在位內膜 異位內膜 在位內膜 異位內膜假手術組 10 16.81±3.72 - 14.03±2.12 -模型組 10 5.33±0.881） 2.34±0.621） 4.12±1.041） 2.13±0.711）針刺組 10 12.09±2.172） 10.33±2.012） 11.58±3.412） 9.25±2.012）激動劑組 10 10.13±2.192） 8.66±1.822） 10.06±2.932） 7.87±1.592）針刺加抑制劑組 10 7.17±2.462）3）4） 5.69±1.742）3）4） 6.44±1.532）3）4） 3.98±1.132）3）4）

2.5 各組大鼠子宮在位、異位內膜中LC3、Beclin-1蛋白表達水平的觀察

與假手術組比較,模型組在位、異位內膜 LC 3、Beclin-1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）;與模型組比較,各干預組異位內膜 LC3蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）;針刺組與激動劑組大鼠 LC3、Beclin-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;針刺組、激動劑組大鼠LC3、Beclin-1蛋白表達均明顯高于針刺加抑制劑組（均P＜0.05）。表明EMS大鼠異位內膜中LC3及Beclin-1蛋白表達水平下降,“秩邊透水道”針法、雷帕霉素激動劑均可提高EMS模型大鼠異位內膜中LC3及Beclin-1的表達水平,詳見表4、圖4。

圖4 各組大鼠Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達條帶圖

表4 各組大鼠Beclin-1、LC 3的灰度值分析 （±s）

表4 各組大鼠Beclin-1、LC 3的灰度值分析 （±s）

注:與假手術組比較 1）P＜0.05;與模型組比較 2）P＜0.05;與針刺組比較 3）P＜0.05;與激動劑組比較 4）P＜0.05

組別 n LC-3Ⅰ LC-3Ⅱ Beclin-1在位內膜 異位內膜 在位內膜 異位內膜 在位內膜 異位內膜假手術組 10 3.54±0.23 - 3.54±0.17 - 3.46±0.19 -模型組 10 1.21±0.111） 0.13±0.041） 0.59±0.411） 0.17±0.021） 0.99±0.021） 0.13±0.051）針刺組 10 2.78±0.172） 0.35±0.082） 3.10±0.372） 0.37±0.032） 2.78±0.242） 0.35±0.122）激動劑組 10 2.02±0.112） 0.32±0.102） 2.55±0.322） 0.28±0.122） 2.16±0.072） 0.33±0.012）針刺加抑制劑組 10 1.24±0.122）3）4） 0.16±0.022）3）4） 1.88±0.042）3）4） 0.18±0.112）3）4） 1.49±0.052）3）4） 0.19±0.012）3）4）

3 討論

子宮內膜異位癥（EMS）是近現(xiàn)代出現(xiàn)的病名,但因其痛經、不孕等臨床表現(xiàn)及病程進展,當將此病歸屬于中醫(yī)學“癥瘕”“不孕”范疇[13]。導致EMS最重要的原因就是瘀血的產生,瘀血內停,氣機受阻,不通則痛,即為痛經;積血瘀滯日久,由小到大,逐漸形成有形之物,故見癥瘕;瘀血內停,阻滯胞宮胞脈,使得兩精不得相合成孕,故發(fā)為不孕。目前,EMS發(fā)病機制研究不明,存在多種學說[14],其中“種植學說”是目前廣泛受到認可的理論[15],認為異常脫落的子宮內膜組織具有一定的活性,可隨經血逆流,進入其他組織,種植在腹膜、膀胱、卵巢等位置,浸潤生長,而形成此病。另外婦產科手術及相關診查操作,也可導致子宮內膜細胞異位種植。

近年來EMS與細胞自噬之間的潛在關聯(lián)越來越得到科研人員的重視。在對自噬機制不斷深入的研究中發(fā)現(xiàn),自噬在子宮內膜異位癥的疾病發(fā)生、病程發(fā)展中扮演著不可或缺的重要角色,因此深度挖掘剖析自噬相關基因,或許能成為臨床治療 EMS的一個新的創(chuàng)新點。有研究表明在機體應對刺激時,自噬可為細胞提供能量,維持內環(huán)境穩(wěn)定[16],避免了細胞的凋亡、壞死;另一方面,自噬又可為異位內膜細胞提供幫助,以適應新的異位病灶環(huán)境,提供細胞存活所必須的能量,在異位組織開始新的種植、浸潤生長,而此功能的過度興奮又會促進細胞凋亡、壞死,加重 EMS,因此適度地激活子宮內膜細胞自噬是治療EMS的關鍵[17]。

各組大鼠子宮內膜的超微結構顯示,假手術組大鼠子宮內膜可見完整、光滑的核膜,線粒體等細胞器數(shù)量很多,自噬小體和溶酶體分布較多;模型組大鼠子宮內膜內可見變形、破裂的細胞器,自噬小體分布少,提示自噬途徑存在異常;針刺組及激動劑組大鼠子宮內膜中均可以觀察到較多的自噬小體,提示針刺與自噬激動劑雷帕霉素同樣具有誘導自噬的作用;針刺加抑制劑組大鼠子宮內膜僅可觀察到少量的自噬小體,說明針刺增強自噬的作用被自噬抑制劑3-MA所抑制,提示針刺發(fā)揮作用的機制可能與激活自噬途徑相關。

自噬一般發(fā)生在真核細胞當中,細胞通過溶酶體,用吞噬的方式清除并降解自身受損的細胞器,是細胞在面對各種壓力時的自我保護機制,通過包裹和降解受損的細胞器和生物分子,分解更多的蛋白質,為在惡劣條件下存活的細胞提供所需的氨基酸、游離性脂肪酸等能量物質,同時清除受損、衰老的細胞結構,從而調節(jié)細胞的穩(wěn)態(tài)平衡[18]。自噬過程與多種自噬基因有關,其中,自噬過程中最重要的正向調控因子是Beclin-1[19],與 Atg8是同源基因,定位于染色體17q21[20],它可直接調控自噬活性。研究發(fā)現(xiàn)[5]Beclin-l mRNA和蛋白在正常婦女中子宮內膜細胞中的表達明顯不同于EMS患者子宮內膜細胞中的表達,EMS患者的蛋白和基因表達則明顯更低。還有研究表明,Beclinl-1參與了自噬小體雙層膜的形成,對自噬的激活具有關鍵的調控作用,其上調可誘導自噬的發(fā)生[21]。自噬相關基因LC3是一種可溶性蛋白質,其表達高低可反映自噬活性的水平,是觀察自噬是否發(fā)生的一個特異性標志性蛋白[22]。有研究發(fā)現(xiàn)子宮內膜周期不同,則LC3表達水平不同,分泌期早、中、晚三期的LC3表達明顯高于早增殖期,而晚增殖期的LC3蛋白表達明顯高于早增殖期,這表明在不同的子宮內膜周期,子宮內膜細胞表達不同的自噬水平[23]。Choi J等[24]發(fā)現(xiàn),在正常子宮內膜中,分泌期 LC3Ⅱ的水平高于增生期LC3Ⅱ水平,但EMS異位內膜中,LC3Ⅱ沒有觀察到周期性變化,而且自噬和mTOR活性在整個月經周期中也是恒定的,且 EMS異位內膜表達沒有在位內膜高,EMS臨床分期越高,表達越低。Zhan L等[25]發(fā)現(xiàn)EMS患者若處在子宮內膜分泌期,則他們的在位及異位子宮內膜中Beclin1和LC3水平明顯低于健康女士,且異位子宮內膜的這兩個因子水平低于在位內膜。但Allavena G等[26]發(fā)現(xiàn),和正常健康女性的在位子宮內膜相比,EMS患者異位內膜的LC3Ⅱ、Beclin1的表達水平明顯升高,提示EMS患者的異位病灶中自噬增加。通過上述文獻分析,預測可能因不同的臨床分期,得出的數(shù)據(jù)不同,Allavena G等[26]的研究中取得的內膜組織多為增生期,而Zhan L等[25]的研究中取得的內膜組織多為分泌期。本實驗在造模前通過注射苯甲酸雌二醇,是為了在造模時盡可能排除大鼠因自身動情周期不同而對造模產生影響,但在最后取材時,并未明確大鼠處于動情期還是動情間期,是本實驗的不足之處,希望在后續(xù)實驗中考慮到這一因素,并做出改善。

在鎮(zhèn)痛[27]、改善局部血液循環(huán)、調節(jié)機體內分泌及免疫機能方面,針刺扮演著重要角色。秩邊透水道針法經過了長期的臨床探索積累,形成了較成熟且完整的針法系統(tǒng),其治療關鍵在于活血化瘀通絡,此針法通過刺激盆叢內臟神經纖維[3],改善子宮及卵巢供血,調節(jié)血液流變學狀態(tài),治療 EMS。通過實驗發(fā)現(xiàn),模型組大鼠子宮內膜組織中Beclin-1、LC3基因和蛋白表達水平明顯低于假手術組,這說明Beclin-1、LC3可能參與了 EMS疾病發(fā)生過程,可能是由于低水平自噬使細胞逃脫免疫系統(tǒng)的追捕,從而內膜細胞進行黏附、侵襲、血管形成,導致EMS發(fā)生。而EMS大鼠行針刺治療后,EMS模型大鼠的子宮內膜異位病灶縮小,Beclin-1、LC3的基因和蛋白表達水平明顯增加,這說明“秩邊透水道”針法可能是以Beclin-1、LC3等因子為治療靶點,通過激活大鼠子宮異位內膜中Beclin-1、LC3的表達,改變EMS大鼠子宮異位內膜的生物化學特性,進而增加大鼠子宮異位內膜細胞的自噬,促進異位病灶的萎縮,從而達到改善EMS子宮內膜組織的目的。本研究還發(fā)現(xiàn)針刺組與激動劑組效果相近,自噬基因及蛋白的表達趨勢一樣,但在針刺干預的基礎上增加抑制劑3-MA后,Beclin-1、LC3表達則明顯降低,可能是因為“秩邊透水道”針法激活自噬相關基因的作用被自噬抑制劑所抵消,這表明了“秩邊透水道”針法有類似雷帕霉素激活自噬的作用。本實驗僅觀察了EMS大鼠Beclin-1、LC3基因和蛋白表達的變化,尚需進一步研究其上游通路的調控機制。深入研究“秩邊透水道”針法對EMS相關自噬因子的調控機制,對臨床治療EMS及降低復發(fā)率有顯著的作用。