針灸實驗中非麻醉狀態(tài)下鼠科動物固定方法應用國內外進展

姜珊,蔣廣威,尹磊淼,2,徐玉東,2,陳艷焦,2,楊永清,2,王宇,2

（1.上海中醫(yī)藥大學,上海 201203;2.上海市針灸經(jīng)絡研究所,上海 200030）

針灸實驗研究多以鼠科動物為實驗對象,為便于針灸操作,多采用在非麻醉狀態(tài)下固定實驗動物。目前針灸研究中采用的動物固定方法包括束縛固定[1]、置高臺固定[2]、懸吊固定[3]。以上固定方法分別與束縛應激（捆綁）、恐高應激（置高臺）和失重應激（懸吊）相關。因不同固定方法均會產(chǎn)生不同程度的應激反應,影響實驗動物生理、病理指標,從而影響針灸療效的準確評估。筆者通過分析國內外針灸實驗中不同固定方法對針灸效應的干預,為選擇恰當?shù)膭游锕潭ǚ椒ㄌ峁┙ㄗh,以達到對針灸效應最小干預的目的,現(xiàn)報道如下。

1 固定應激及其對動物生理、病理的影響

1.1 應激

應激是機體在受到各種強烈刺激時所產(chǎn)生的全身性的非特異適應性綜合反應,表現(xiàn)為交感神經(jīng)-腎上腺髓質（sympathetic-adrenomedullar, SSA）系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸（hypothalamo-pituitaryadrenocortical, HPA）系統(tǒng)的活化,并伴有多系統(tǒng)組織和器官功能紊亂[4]。針刺效應與SSA和HPA系統(tǒng)密切相關,可有效干預中樞和外周HPA的各環(huán)節(jié),可明顯降低 HPA軸相關激素促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone, ACTH）、皮質醇（corticosterone, CORT）、促腎上腺皮質激素釋放激素（corticotropin-releasing hormone, CRH）水平[5-6]。因此,應激效應與針刺效應疊加,將影響對針刺效應的準確評判。

1.2 導致應激的外部因素

應激源作用于機體產(chǎn)生應激[7]。動物固定是針灸實驗研究中誘發(fā)實驗動物應激的主要應激源之一,包括捆綁束縛固定[1]、固定器束縛固定[8-9]、網(wǎng)罩束縛固定[10]、徒手固定[11]、懸吊固定[3]以及置高臺固定[12]等。

其中捆綁束縛固定、固定器束縛固定、網(wǎng)罩束縛固定、徒手固定屬于外力固定,可產(chǎn)生不同程度的束縛應激;置高臺固定產(chǎn)生恐高應激;懸吊固定產(chǎn)生失重應激。

1.3 應激對機體的影響

在應激狀態(tài)下,機體的多種穩(wěn)態(tài)平衡被打破[13]。因應激程度、方式不同,可使機體產(chǎn)生生理性應激反應和病理性應激反應,即良性反應（適度應激）和不良反應（過度應激）。

研究表明束縛應激的實施時間與應激強度相關。單次刺激時間、頻率、強度所致累積刺激量決定應激程度。實驗研究中,慢性應激多見單次刺激0.5～6 h[14-16],反復刺激7～24 d[15-17];制備急性應激模型多見單次刺激 3～6 h,重復 1～5 d[18-20]。提示即使采取強刺激,但時程小,也不會對動物產(chǎn)生較大生理影響。對應激程度的評價指標可分為短效指標、長效指標和疾病指標。

1.3.1 束縛應激對機體的影響

束縛應激對機體產(chǎn)生較大干預。其中捆綁束縛、徒手固定對機體的影響最大,固定器固定、網(wǎng)罩束縛次之。捆綁束縛[21]通過繩索固定四肢、軀干,使動物處于強迫體位,活動度小,反抗激烈,應激反應大;固定器束縛可以調節(jié)肢體活動部位到合適位置,多采用鼠套[22]、布袋[23]等網(wǎng)罩類束縛方法,可使鼠類處于較自然狀態(tài),可減小動物強烈反抗程度,應激相對較小[24]。

目前針灸實驗研究多采用捆綁束縛固定方法。研究提示,捆綁束縛固定應激可誘發(fā)鼠科整體行為認知、內分泌系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)生理指標改變,以及消化系統(tǒng)器質性病變。單次6 h、重復7～21 d慢性捆綁束縛固定應激可使鼠類出現(xiàn)焦慮樣行為、體質量增長減慢;慢性不可預測捆綁束縛性應激則會使鼠類患抑郁癥[15],糖皮質激素及其受體表達增加[25]。單次 2～4 h長期捆綁束縛應激,可激活HPA軸和自主神經(jīng)系統(tǒng)[26]。單次6 h捆綁束縛冷應激可致鼠類患急性胃潰瘍性疾病[20,27]。

固定器束縛應激會造成鼠科整體行為認知、內分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的生理病理改變及心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的器質性病變。研究表明,單次 2.5 h、重復7～14 d固定器束縛應激,可致鼠類認知障礙和海馬神經(jīng)元樹突棘缺失[17]。單次0.5 h、9 d的固定器束縛固定,會造成大鼠體質量增幅、痛閾和應激效應相關激素含量明顯降低,激活HPA軸,產(chǎn)生慢性應激效應[14]。固定器束縛應激可致大鼠肝臟中過氧化物酶體增殖物激活型受體α（PPAR-α）及其靶基因肝型肉堿棕櫚酰轉移酶-I（L-CPT-I）mRNA 表達增加,但研究表明 PPAR α及其 L-CPT-I表達的影響與固定器束縛應激本身有關,與應激時間長短關系不明顯[28]。單次 6 h、1～21 d固定器束縛應激可導致腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 mRNA總量和第四外顯子水平下降[29]。單次6 h、24 d固定器束縛應激,降低乙酰膽堿（acetylcholine, ACh）引起心血管疾病[16,30],發(fā)病率隨應激增加而升高[28]。固定器束縛應激0.2～1 h會增加機體體溫以及CORT水平[31];單次3 h、5 d的固定器束縛應激,使HPA軸激活,胃酸、胃酶分泌增多,產(chǎn)生胃潰瘍疾病[19,32]。

單次6 h分別實施1 d、2 d、3 d網(wǎng)罩束縛,會誘發(fā)鼠科內分泌系統(tǒng)指標改變[18]。未見網(wǎng)罩束縛應激導致鼠科器質性病變的報道。

1.3.2 置高臺應激對機體的影響

實驗研究中,利用鼠科的畏高特性,可制備置高臺應激模型[33-34]。單次30 min置高臺應激時鼠科會表現(xiàn)出勃起、長達10 min的靜止不動、排便、排尿等行為性“凍結”[35]。研究發(fā)現(xiàn),單次30 min的置高臺應激可以損傷鼠科空間參考記憶提取能力[36]。但置高臺應激可降低鼠科糖尿病模型血糖水平[2]。置高臺應激對鼠科的生理、病理有一定影響,但未見器質性病變報道。

1.3.3 懸吊應激對機體的影響

懸吊應激會造成鼠科消化系統(tǒng)器質性病變、整體行為認知、內分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等生理、病理改變。單次6 h懸吊應激狀態(tài)中鼠類體溫逐漸下降,懸吊加束縛應激還可導致胃潰瘍[37]。重復應激使動物逐漸產(chǎn)生對應激的適應能力,減緩體溫下降。懸吊應激使鼠類性行為周期改變、學習記憶能力降低[38]。

不同固定方式對鼠科基礎生理指標、行為學及各系統(tǒng)的影響見表1。

表1 不同固定方式對鼠科基礎生理指標、行為學及各系統(tǒng)的影響

2 固定應激對針灸效應的干預

2.1 束縛固定

針灸實驗研究中,捆綁束縛[21]的松緊度很難控制;固定器和網(wǎng)罩類束縛方法,雖可以使鼠類處于俯臥自然狀態(tài),但鼠類均處于強迫體位。針刺時,動物因疼痛發(fā)生掙扎,導致體位改變,取穴不準,針刺深度也很難把握,甚至掙脫而咬傷實驗人員,如太緊則易導致動物肢體缺血壞死[39]。

研究表明,針灸實驗中采用束縛固定可使鼠類出現(xiàn)毛色暗淡無光,精神緊張狀態(tài)、萎靡、焦躁,食欲減退,甚至出現(xiàn)嘔吐、便溏現(xiàn)象等不良應激反應[40]和降低糖尿病模型血糖水平的良性應激反應[2]。但束縛和針刺均能明顯降低糖尿病模型的血糖水平,束縛應激效應顯著,在此效應疊加基礎上難以準確評估針刺效應[2]。也有研究表明,用特殊束縛裝置對鼠類進行固定30 min不會影響鼠科的體質量和學習記憶能力及視力,束縛本身沒有使被固定的鼠類產(chǎn)生應激反應影響實驗結果[41]。

單次束縛應激0.5～6 h,總時長1～24 d,均產(chǎn)生不同程度的應激反應。在針灸動物實驗中,固定時間多為 30 min,刺激時間短,可使動物產(chǎn)生適應性,減小應激不良反應。

束縛固定應激中超過一定程度可產(chǎn)生強應激,引起生理、病理改變,對針灸效應產(chǎn)生影響。因此在針灸機制研究中,盡量避免采用束縛固定方法。如果采用束縛固定方法,固定時間盡量維持在30 min以內。

2.2 置高臺固定

在針灸實驗研究中,置高臺固定法能有效地減少束縛應激對動物模型與針刺效應的影響。有研究[2]表明,在置高臺情況下,去除置高臺的本底效應,針刺仍然對糖尿病大鼠血糖有明顯下調作用,針刺的效應可得到明顯體現(xiàn)。采取置高臺固定時,動物處于俯臥位的自然體位,因此該方法適用于針灸實驗中動物的頭背部、四肢外部的針灸治療。

為了減小動物因置高臺產(chǎn)生的應激反應,正式實驗前可做2～5次適應性訓練。置高臺固定產(chǎn)生較小應激,對生理、病理影響較小,對針刺效應的干預也較小,因此在針灸機制研究中,推薦采用置高臺固定方法。

3 應激評價方法在針灸研究中的應用

不同種類、程度的應激對動物的影響存在差異,并與動物狀態(tài)（疾病模型）密切相關。因此,在針刺研究中,要根據(jù)動物狀態(tài)（疾病模型）、穴位等實驗條件,依據(jù)應激評價,選用合適的固定方法。在針灸實驗研究中,應激的評價方法主要包括行為學評價、基本生理指標檢測、實驗室指標評價等。

行為學評價方法包括動物整體狀態(tài)評價[42]、強迫游泳實驗[42-43]、曠場實驗[43]、水迷宮實驗[44]、蔗糖攝取實驗[45]等。其中動物整體狀態(tài)評價方法更適合于針灸研究領域。應激使大鼠產(chǎn)生明顯的行為變化,如排便、站立不動、尖叫、發(fā)出超聲波、不斷的趟淚,皮毛和面部不潔、毛須樹立、長期不動等[42]。應激大鼠眼周偶爾有粉紅色分泌物。急性應激可導致動物行為活動增加,而慢性應激可導致行為活動減少,動物隨應激時程延長,其行為表現(xiàn)為由興奮狀態(tài)轉變?yōu)橐种茽顟B(tài)。

實驗室指標主要包括腎上腺糖皮質激素、兒茶酚胺和CORT。應激主要激活HPA軸,下丘腦產(chǎn)生CRH,經(jīng)垂體門脈系統(tǒng)進入垂體前葉,刺激 ACTH的釋放,ACTH作用于腎上腺皮質,促進CORT的分泌,而CORT的分泌反過來又抑制ACTH和CRH的釋放,形成負反饋機制。研究表明,束縛應激后小鼠血清中CORT水平較正常明顯升高[46]。除了以上指標外,內分泌軸系統(tǒng)也參與應激反應。因此,可以反應應激的常用指標除去甲腎上腺素、甲狀腺素、CRH、ACTH和CORT外,還有阿片肽、多巴胺、生長抑制素和P物質等。其中,CORT是評價針灸研究中最常見的應激指標之一,可以高度準確地反映動物對急性應激源的反應。相關研究表明,中性粒細胞:淋巴細胞比率（NE:LY）也可以有效評價慢性應激。實驗室指標相對客觀地反映動物整體激素水平的變化[25]。因此,生長代謝、神經(jīng)內分泌和免疫功能相關指標,都可用于應激評價。由于實驗室指標評估并不能區(qū)分困擾或輕度痛苦,因此應綜合參考行為學評價與實驗室指標進行應激的有效評估[47]。

4 討論

在針灸效應評價中,應該充分考慮固定應激對動物機體生理、病理的影響以準確評價針灸療效。應激產(chǎn)生的良性反應,有助于疾病的改善,因此忽略應激良性效應因素可能導致針灸的治療效應加大,或產(chǎn)生假陽性結果;應激產(chǎn)生的損傷性反應,可能導致疾病的進一步加重,忽略應激非良性效應因素可能導致針灸的治療效應減小,或產(chǎn)生假陰性結果。在針灸實驗研究中,因固定導致的應激很難避免,為了實驗的準確性,應盡量減小固定應激對針灸效應的干預,或在實驗中設置固定對照組用于分析應激效應對于針灸效應的影響。為了明確固定方法對針灸效應的干預,在正式開展實驗前,應首先進行應激評估,并在此基礎上選擇合適的動物固定方法。

應激評估過程包括①在正式實驗前進行應激評估預實驗,根據(jù)行為學指標與實驗室指標,對實驗動物因固定而產(chǎn)生的應激進行評估;②正式實驗前動物進行固定適應性鍛煉,通過訓練,使動物產(chǎn)生適應,以達到最小化應激反應,避免對針灸療效產(chǎn)生過大影響[38];③在正式實驗中,對鼠類的單次固定時間盡量控制在30 min以內;④在針灸治療疾病模型療效評估時,應關注固定應激對相關指標的干預。

固定方法的選擇原則具體為①治療取穴位于動物頭背部、四肢外側等部位,建議優(yōu)先選擇置高臺固定法,其次選擇網(wǎng)罩、固定器固定;②治療取穴位于動物腹部、四肢內側等部位,建議選擇網(wǎng)罩或固定器固定;③常規(guī)情況下不建議采用捆綁固定法。如果在特殊實驗條件下,不適合采用置高臺、網(wǎng)罩、固定器固定等方法,最終可考慮采用捆綁固定法。