興義維蚋幼蟲扭動攝食方式的神經(jīng)-肌肉結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

張洪衛(wèi)，高 晗，尋 慧，楊 明

(貴州醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，生物學系暨醫(yī)學昆蟲重點實驗室，貴陽 550025)

蚋類(black flies)幼蟲為河流的清潔者，有助于水質(zhì)凈化(Wotton, 2010)，可作為水污染的指標(Kupryianchyketal., 2018)。這與幼蟲在流水中獨特的運動模式及取食方式有關(guān)。蚋類隸屬于雙翅目Diptera蚋科Simuliidae，呈世界性分布，為完全變態(tài)發(fā)育昆蟲，其生活史包括水生期和陸生期，歷經(jīng)卵、幼蟲、蛹及成蟲4個階段(陳漢彬等，2016)。蚋幼蟲在流水中生活發(fā)育，先依靠口器吐出細絲在水生植物或巖石等附著物上形成絲墊，再憑借腹部末端的后環(huán)(posterior circlet)鉤刺掛在附著物上，靠擺動和屈伸體軀進行運動。蚋幼蟲身體屈伸時可形成拱橋形狀，似尺蠖式蠕動爬行(Reidelbach and Kiel, 1990)。身體擺動時可扭動180°進行濾食(陳漢彬等，2016)，能攝取直徑300 μm以內(nèi)的細菌、單細胞藻類和浮游生物等食物顆粒(Wotton, 1976 , 1980)。昆蟲所有的運動、感覺及生理過程都會受到神經(jīng)系統(tǒng)和激素的聯(lián)合控制(Gullan and Cranston, 2014)，研究蚋幼蟲的腹神經(jīng)索及周圍神經(jīng)與肌肉之間的連接結(jié)構(gòu)有利于昆蟲生長發(fā)育和行為學運動方式的研究(Gullan and Cranston, 2014)。

迄今對蚋幼蟲腹神經(jīng)索結(jié)構(gòu)的研究僅見兩例。Puri(1925)在解剖學基礎(chǔ)上闡述了蚋幼蟲神經(jīng)系統(tǒng)的組成及肌肉的分布模式。尋慧等(2013)利用組織學方法研究興義維蚋Simuliumxingyiense幼蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并闡述了幼蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腹神經(jīng)索結(jié)構(gòu)的基本構(gòu)成。尚未見對神經(jīng)節(jié)的精細結(jié)構(gòu)及神經(jīng)索周圍神經(jīng)分支與肌肉間連接結(jié)構(gòu)的研究。因此，本文在前人研究基礎(chǔ)上，通過應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和圖像信息采集技術(shù)研究興義維蚋腹神經(jīng)索組成、神經(jīng)節(jié)內(nèi)部的細微結(jié)構(gòu)、相鄰神經(jīng)節(jié)之間的周圍神經(jīng)連接結(jié)構(gòu)及神經(jīng)分支與肌肉連接的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

抗辣根過氧化物酶(anti-horseradish peroxidase，anti-HRP)抗體可特異性識別和結(jié)合神經(jīng)細胞膜上的巖藻糖蛋白(Jan and Jan, 1982)，對果蠅Drosophilidae神經(jīng)組織特異性染色，通過顯色可定位神經(jīng)組織以探明各路神經(jīng)分支走向(Katzetal., 1988, Wangetal., 1994)。anti-HRP還應(yīng)用于其他昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育研究，包括蝗蟲(Snowetal., 1987)、蚊(Kwonetal., 2016)、蜜蜂(Farooquietal., 2003)等。本文以興義維蚋成熟幼蟲為研究對象，使用anti-HRP抗體和phalloidin對幼蟲進行免疫熒光染色(Brentetal., 2009a , 2009b)，通過激光掃描共聚焦顯微鏡對幼蟲腹神經(jīng)索及周圍神經(jīng)與肌肉連接的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)進行可視化研究。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

蚋類幼蟲于2018年10～12月采自貴州省貴陽市青巖古鎮(zhèn)龍井村(26.335787°N，106.672846°E)，投入本實驗室的蚋類飼養(yǎng)系統(tǒng)進行飼養(yǎng)(賈若等，2018)。在NIKON SMZ18體視顯微鏡下，根據(jù)形態(tài)學特征鑒定興義維蚋成熟幼蟲(陳漢彬等，2016)。

1.2 腹神經(jīng)索解剖

興義維蚋幼蟲腹神經(jīng)索的解剖主要參考果蠅的方法(Brentetal., 2009a)。將幼蟲放入硅膠皿中，用磷酸鹽緩沖液(1×PBS，pH7.3)淹沒蟲體，使其背面朝上，以解剖針(0.01 mm，Austerlitz)固定住幼蟲頭尾(圖1-A)。再用眼科剪沿背部中線剪開體壁暴露體腔，用鑷子小心去除體內(nèi)的脂肪、氣管、唾液腺、消化道及馬氏管，并展開幼蟲皮層(圖1-B)。整個解剖過程要求在20 min內(nèi)完成，且操作過程應(yīng)輕微。在NIKON SMZ18體視顯微鏡下進行形態(tài)學觀察和拍照。

圖1 興義維蚋幼蟲解剖圖解Fig.1 Dissection of Simulium xingyiense larvae注：A，固定幼蟲頭部和尾部(箭頭)；B，腹神經(jīng)索。方位：A，前向；D，背向；L，側(cè)向；P，后向； V，腹向。標尺為200 μm。Note: A, Fixed head and tail of larva (arrow); B, Ventral nerve cord. Direction: A, Anterior; D, Dorsal; L, Lateral; P, Posterior; V, Ventral. Scale bars, 200μm.

1.3 免疫染色

興義維蚋腹神經(jīng)索的免疫熒光染色主要參考果蠅的方法(Brentetal., 2009b)。將蟲體解剖后，吸出PBS，加入固定液(4%多聚甲醛，pH7.4)室溫固定30～35 min，移去固定液，用含有0.3%Triton的PBS(PBST)沖洗；快洗2次，慢洗1次(15 min)。用現(xiàn)配的封閉液室溫封閉30 min；[封閉液配方：PBST中加入5%胎牛血清(四季青11011-8611)]。棄封閉液，加入一抗孵育液(1 ∶200 Rabbit anti-HRP，Jackson immunoresearch)于4℃冰箱孵育過夜；棄一抗孵育液，PBST快洗3次，慢洗3次(每次15 min)。再用封閉液室溫封閉30 min。棄封閉液，加入二抗孵育液(1 ∶200 cy5、1 ∶200 phalloidin，Jackson immunoresearch)于4℃冰箱避光孵育過夜；棄二抗孵育液，PBST快洗3次，慢洗2次(每次15 min)。加入Hoechst核染液(1 ∶1000 Hoechst 33342，Thermo Fisher)室溫染色15 min，PBST洗滌15 min。在體視鏡下去除細小雜物，將蟲體轉(zhuǎn)移至滴有GD(2.2% DABCO，Sigma-Aldridge，USA；70%甘油；1×PBS)的載玻片上，蓋上蓋玻片，用指甲油封片，干燥后置4℃冰箱避光保存。

1.4 激光共聚焦顯微成像及圖像處理

用激光掃描共聚焦顯微鏡(日本，Olympus FV1000)觀察，對Cy5型染料采用635 nm的激發(fā)波長進行激發(fā)，顯示白色；FITC型染料采用488 nm的激發(fā)波長進行激發(fā)，顯示綠色；Hoechst型染料采用405 nm的激發(fā)波長進行激發(fā)，顯示藍色。采集圖片，圖像分辨率為1 024×1 024。用Adobe Photoshop CS6處理圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 腹神經(jīng)索結(jié)構(gòu)

興義維蚋幼蟲腹神經(jīng)索由11對神經(jīng)節(jié)及連接的神經(jīng)索組成，包括胸神經(jīng)節(jié)3對及腹神經(jīng)節(jié)8對。胸神經(jīng)節(jié)包括前胸神經(jīng)節(jié)(prothoracic ganglion，proTG)、中胸神經(jīng)節(jié)(mesothoracic ganglion，mesoTG)和后胸神經(jīng)節(jié)(metathoracic ganglion，metaTG)，分別位于第1至第3胸節(jié)內(nèi)。1～5腹神經(jīng)節(jié)(abdominal ganglions 1～5, AG 1～AG 5)分別位于第1至第5腹節(jié)內(nèi)，6～8腹神經(jīng)節(jié)(abdominal ganglions 6～8, AG 6～AG 8)幾乎融合，位于第6腹節(jié)內(nèi)。3對胸神經(jīng)節(jié)和AG 6～AG 8呈圓形，AG 1～AG 5呈長橢圓形。從proTG至AG 8，神經(jīng)節(jié)逐漸變小，proTG直徑約為AG 8的4倍。以metaTG的直徑(記為Φ)為基準，從proTG到AG 8，連接神經(jīng)節(jié)之間的神經(jīng)索長度依次約為Φ的0.6、0.6、0.6、2.0、2.3、2.1、1.9、0.7、0、0倍(圖2-A)。

mesoTG后端背側(cè)存在一對橫神經(jīng)(transverse nerve，TN)伸向兩側(cè)腹肌內(nèi)；AG 1后端背側(cè)、AG 2前端背側(cè)、AG 3前端背側(cè)、AG 4后端背側(cè)和AG 5后端背側(cè)都存在類似結(jié)構(gòu)(圖2-C)。相鄰的橫神經(jīng)兩側(cè)由2條縱神經(jīng)(longitudinal nerve，LN)連接(圖2-C)。

2.2 腹神經(jīng)索周圍肌肉結(jié)構(gòu)

幼蟲腹部的肌肉分為橫肌、縱肌及斜肌3類肌群，腹神經(jīng)索的兩側(cè)肌肉幾乎對稱排列，由外層至底層依次可見縱肌、斜肌、縱肌和橫肌(圖2-B)。

2.3 體神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)

每對體神經(jīng)節(jié)的結(jié)構(gòu)相似。幼蟲神經(jīng)節(jié)仍保留兩神經(jīng)管融合形成的特征，并未完全融合成一個神經(jīng)節(jié)(圖3-A)。每對神經(jīng)節(jié)由左右兩團神經(jīng)胞體聚合而成，細胞核主要聚集在兩側(cè)及中線處，呈無頭無尾的Φ形(圖3-A)。中線處排列兩層神經(jīng)細胞核，將神經(jīng)髓分為兩室，也有部分細胞核游離入神經(jīng)髓內(nèi)。神經(jīng)節(jié)與神經(jīng)索連接處的細胞核較少。神經(jīng)節(jié)外圍由單層扁平鞘細胞包裹(圖3-A，箭頭)，其表面存在粗細不等的神經(jīng)分支(圖3-B，三角)。

圖2 興義維蚋幼蟲腹神經(jīng)索周圍的神經(jīng)和肌肉整體結(jié)構(gòu)Fig.2 Integral structure of nerves and muscles around ventral nerve cord of Simulium xingyiense larvae注：A，腹神經(jīng)索結(jié)構(gòu)組成(Hoechst染色；proTG，前胸神經(jīng)節(jié)；mesoTG，中胸神經(jīng)節(jié)；metaTG，后胸神經(jīng)節(jié)；AG 1～AG 8，第1～8腹神經(jīng)節(jié))。B，腹肌分橫肌、縱肌及斜肌，腹肌由外層至底層依次可見縱肌、斜肌、縱肌及橫肌(phalloidin染色)。C，腹神經(jīng)索背側(cè)神經(jīng)的連接結(jié)構(gòu)(anti-HRP染色；橫神經(jīng)TN；縱神經(jīng)LN)。D，神經(jīng)分支延伸入肌肉層。方位：A，前向；L，側(cè)向；P，后向。圖A、B、C、D均分別為3張激光掃描共聚焦顯微照片拼接而成。標尺為300 μm。Note: A, Structural composition of ventral nerve cord (Hoechst staining; proTG, prothoracic ganglion; mesoTG, mesothoracic ganglion; metaTG, metathoracic ganglion; AG 1 to AG 8, abdominal ganglia 1～8). B, Abdominal muscles were divided into transverse muscles, longitudinal muscles and oblique muscles; There were longitudinal muscles, oblique muscles, longitudinal muscles and transverse muscles from outer to bottom layer (phalloidin staining). C, Structure of nerve onnection on dorsal side of ventral nerve cord (anti-HRP staining; transverse nerve TN; longitudinal nerve LN). D, Nerve branches extended into the abdominal muscle. Figure A, B, C and D were spliced from three laser confocal scanning photoes respectively. Direction: A, Anterior; L, Lateral; P, Posterior. Scale bars, 300 μm.

圖3 興義維蚋幼蟲體神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)分支結(jié)構(gòu)Fig. 3 Structures of somatic ganglia and nerve branches of Simulium xingyiense larvae注：A，神經(jīng)細胞核排列呈無頭無尾的Φ形(Hoechst染色)；B，神經(jīng)節(jié)外圍的扁平鞘細胞和表面的神經(jīng)分支(扁平鞘細胞，箭頭；神經(jīng)分支，三角)。方位：A，前向；L，側(cè)向；P，后向。標尺為50 μm。Note: A, Nerve nucleus were arranged in a headless and tailless Φ shape (Hoechst staining). B, Flat sheath cells surrounding the ganglion and various thicknesses nerve branches on the surface of ganglia (Flat sheath cells, arrows; Nerve branches, triangle). Direction: A, Anterior; L, Lateral; P, Posterior. Scale bars, 50 μm.

2.4 1～6腹節(jié)內(nèi)神經(jīng)分支和肌肉的連接結(jié)構(gòu)

1～5腹節(jié)可見TN與LN相連，呈梯形連接結(jié)構(gòu)(圖4-A)。TN伸入神經(jīng)索兩側(cè)的腹縱肌內(nèi)，由之分出的神經(jīng)末梢呈鏈珠狀膨出的終扣結(jié)構(gòu)(圖4-B)。AG 7和AG 8后端分別發(fā)出2條和4條側(cè)神經(jīng)伸入體腔，AG 8發(fā)出的4條側(cè)神經(jīng)交叉伸出(圖4-C)。

AG 1～AG 5中部發(fā)出兩對側(cè)神經(jīng)(N 1、N 2)分別伸入兩側(cè)腹肌，N 1沿腹肌伸至背縱肌(圖4-D)。N 2伸入腹縱肌，在兩縱肌中間點穿出后，伸出的神經(jīng)末梢呈鏈珠狀終扣結(jié)構(gòu)(圖4-E)，觀察發(fā)現(xiàn)神經(jīng)末梢均通過此結(jié)構(gòu)與肌肉連接。N 1穿過腹肌至背縱肌，又分出兩支神經(jīng)(N 3、N 4)，N 3指向背中縫，N 4沿肌肉層又分出下級神經(jīng)分支(圖4-F)。

1～5腹節(jié)各有一組翼肌牽拉背血管，每側(cè)翼肌分為前后兩支，翼肌從懸著點發(fā)出后形成一個夾角(圖4-G，箭頭)。在該夾角區(qū)靠背血管處可見兩群心周腎細胞(pericardial nephrocyte)(圖4-H)。N 3沿翼肌伸入腎細胞群，神經(jīng)可走行于前側(cè)翼肌，也可走行于后側(cè)翼肌，還可分兩支后沿兩翼肌進入腎細胞群(圖4-C，E)。

3 結(jié)論與討論

興義維蚋成熟幼蟲的腹神經(jīng)索可見11對神經(jīng)節(jié)，即胸部3對和腹部8對，為完全變態(tài)昆蟲幼蟲的典型特征，與前人在解剖學和組織學上的研究報道結(jié)果相同。不同物種，幼蟲神經(jīng)節(jié)的融合程度不同，興義維蚋與同為雙翅目長角亞目的蚊類相似。幽蚊Chaoborus幼蟲的AG 6分離，AG 7和AG 8發(fā)生融合(Wohlfrom and Melzer, 2001)；搖蚊Chironomidae幼蟲的后胸神經(jīng)節(jié)與第2腹神經(jīng)節(jié)發(fā)生融合，其余未融合(Meyersetal., 2015)；家蠅Muscadomestica幼蟲的胸神經(jīng)節(jié)和腹神經(jīng)節(jié)全部融合成一個胸神經(jīng)節(jié)(Wanninger and Andreas, 2015)。果蠅Drosophliamelanogaster幼蟲的胸神經(jīng)節(jié)和腹神經(jīng)節(jié)均完全融合，整合了腹神經(jīng)索(Wanninger and Andreas, 2015)。興義維蚋幼蟲的最后3個腹神經(jīng)節(jié)發(fā)生融合，而未完全合并。

興義維蚋幼蟲腹神經(jīng)索的神經(jīng)節(jié)分出兩對神經(jīng)分別伸入兩側(cè)肌肉，其背側(cè)存在橫神經(jīng)支配肌肉運動，這與Puri的解剖學結(jié)果一致。但Puri發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)的正中神經(jīng)與橫神經(jīng)連接成三角神經(jīng)叢，本研究未出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)，可能與研究方法不同有關(guān)(Puri, 1925)。本文闡述了在第1～5腹神經(jīng)節(jié)兩側(cè)，兩條縱神經(jīng)連接橫神經(jīng)呈“梯形連接結(jié)構(gòu)”，與前人研究結(jié)果不同，可能是在組織學和解剖學基礎(chǔ)上較難觀察(Puri, 1925；尋慧等，2013)。幼蟲腹部共分8節(jié)，第1至第4腹節(jié)較細，第5腹節(jié)處腹部開始膨大，第6和第7腹節(jié)的周長最大，第8腹節(jié)顯著變小(尋慧等，2013)。在第6腹節(jié)內(nèi)的AG 7和AG 8后端分別發(fā)出兩對側(cè)神經(jīng)伸入體腔內(nèi)，AG 7分出一對神經(jīng)支配第7腹節(jié)；AG 8分出兩對神經(jīng)支配第7和第8腹節(jié)，內(nèi)側(cè)一對神經(jīng)支配第8腹節(jié)的后環(huán)發(fā)揮附著作用(Puri, 1925)。

果蠅幼蟲的所有神經(jīng)節(jié)完全融合，其運動神經(jīng)元通過節(jié)段神經(jīng)、節(jié)間神經(jīng)和橫神經(jīng)3種途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用。節(jié)段神經(jīng)支配外側(cè)肌和腹側(cè)肌，節(jié)間神經(jīng)支配背側(cè)肌和腹側(cè)肌，共同協(xié)調(diào)支配肌肉運動(Menonetal., 2013)。天蠶Lepidopterasaturniidae幼蟲的神經(jīng)節(jié)外周神經(jīng)與興義維蚋具有相似性，都存在橫神經(jīng)，神經(jīng)節(jié)發(fā)出的背神經(jīng)和腹神經(jīng)共同調(diào)控體壁肌肉的運動(Libby, 1959)。

蝗蟲的腹神經(jīng)節(jié)參與呼吸、循環(huán)、生殖、后腸蠕動、腹部運動和發(fā)育過程的調(diào)控(Nassel, 1996)。興義維蚋前胸神經(jīng)節(jié)位于前腹足下方且支配前腹足運動，前3個胸節(jié)間存在斜肌，控制胸節(jié)運動。第1至第5腹神經(jīng)節(jié)的腹側(cè)和背側(cè)神經(jīng)控制著體壁肌肉；從胸節(jié)至第8腹神經(jīng)節(jié)，相鄰體節(jié)間存在斜肌，且兩斜肌間的間隙逐漸變大，這可能調(diào)控著幼蟲體軀不同的擺動和屈伸方式。此外，最后3個腹神經(jīng)節(jié)融合，這可能與后腹部的功能簡化有關(guān)；第8腹節(jié)是肛鰓和后環(huán)的所在位置，該神經(jīng)節(jié)發(fā)生融合可能是為了幫助幼蟲的后環(huán)完成附著功能。

圖4 興義維蚋幼蟲神經(jīng)節(jié)分出的神經(jīng)與肌肉連接結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of nerve-muscle connection of Simulium xingyiense larvae注：A，橫神經(jīng)(TN，箭頭)及縱神經(jīng)(LN，三角)的連接結(jié)構(gòu)；B，TN伸入神經(jīng)節(jié)兩側(cè)腹縱肌內(nèi)(箭頭)，分出的下級神經(jīng)分支呈鏈珠狀膨出的終扣結(jié)構(gòu)；C，AG 7和AG 8后端分別分出2條和4條側(cè)神經(jīng)入體腔；D，神經(jīng)節(jié)中部發(fā)出兩對側(cè)神經(jīng)(N 1、N 2)伸入肌肉層，N 1沿腹肌伸至背縱肌處，N 2伸入腹縱??；E，神經(jīng)末梢呈鏈珠狀終扣結(jié)構(gòu)；F，側(cè)神經(jīng)(N 1)穿過腹肌至縱肌分出兩支神經(jīng)(N 3、N 4)；G，翼肌，分前后兩支(箭頭)；H，翼肌牽拉背血管(DV)；在翼肌與背血管連接處排列兩列腎細胞群(箭頭)，N 3神經(jīng)分支沿翼肌伸入腎細胞群。方位：A，前向；L，側(cè)向；P，后向。B標尺為50 μm，其余標尺為200 μm。Note: A,Connection structure of the transverse nerves (TN, arrows) and longitudinal nerves (LN, triangles). B, TN extended into the abdominal longitudinal muscles on both sides of ganglion (arrows), and the small nerve branches showed a chain bead-like bulging terminal button structure in abdominal muscles layer. C, There were two and four lateral nerves respectively extended into the body cavity in AG 7 and AG 8. D, Two lateral nerves (N 1, N 2) extended into the muscles layer at the middle bottom of the ganglion, N 1 extended into the drosal longitudinal muscle along abdominal muscles, and N 2 extended into the abdominal longitudinal muscle. E, Protruding nerve endings showed a chain bead-like terminal boutons structure. F, Lateral nerve (N 1) divided two nerve branches when passed through the abdominal muscles to longitudinal muscles (N 3, N 4). G, Alary muscle, divided anterior and posterior branches (arrows). H, Dorsal vessels (DV) were pulled alary muscle. There were two rows of nephrocytes groups (arrows) at the junction of alary muscle and the dorsal vessel. Direction: A, Anterior; L, Lateral; P, Posterior. B: bar=50 μm； Rest bar=200 μm.

本研究首次發(fā)現(xiàn)了蚋類的腎細胞與神經(jīng)纖維存在連接。以往報道腎細胞分食管周腎細胞(perioesophageal nephrocyte)和心周腎細胞兩類(Psathakietal., 2018)；食管周腎細胞位于頭部，由神經(jīng)纖維連接，而心周腎細胞和神經(jīng)纖維的連接未見報道。本研究表明anti-HRP可特異性識別興義維蚋幼蟲的神經(jīng)組織和腎細胞，并闡述了興義維蚋幼蟲神經(jīng)節(jié)的細微結(jié)構(gòu)及周圍神經(jīng)分支與肌肉連接的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可為后續(xù)進一步研究蚋科昆蟲運動的神經(jīng)機制提供基礎(chǔ)(Yeatesetal., 2002)。