二化螟CsCncC和CsKeap1基因的克隆與mRNA表達(dá)分析

季彩宏，張 楠，孟祥坤，王建軍*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2. 揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

在哺乳動(dòng)物中，Nrf2-Keap1通路主要調(diào)控細(xì)胞氧化還原平衡，參與細(xì)胞抗氧化和Ⅱ相解毒反應(yīng)(Kensleretal.，2007；Lobodaetal.，2016)。在該信號(hào)通路中，屬于Cnc-bZIP (cap ‘n’ collar/basic region leucine zipper)家族的Nrf2(核因子E2相關(guān)因子2，nuclear factor erythroid 2-related factor 2)，含有6個(gè)環(huán)氧氯丙烷(EHC，epichlorohydrin)相關(guān)蛋白同源結(jié)構(gòu)域(Neh，Nrf2-EHC homology)(Neh1-Neh6)，其中，氨基端Neh2功能結(jié)構(gòu)域是Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1，Kelch-like ECH-associated protein 1)的結(jié)合區(qū)，后者在正常的生理?xiàng)l件下與Nrf2結(jié)合并將其隔離、錨定在胞漿，促進(jìn)Nrf2的泛素化和蛋白酶體降解(Kobayashietal.，2006; Tianetal.，2018)。

害蟲(chóng)抗藥性問(wèn)題是害蟲(chóng)綜合治理中最重要的問(wèn)題之一，明確抗藥性機(jī)制是害蟲(chóng)抗藥性治理的基礎(chǔ)。昆蟲(chóng)中第一個(gè)鑒定的Nrf2同源基因是黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的CncC基因(Mohleretal.，1991；Sykiotis and Bohmann，2008)，可調(diào)控36種細(xì)胞色素P450、17種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6種尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)和55種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)(Misraetal.，2011)。進(jìn)一步對(duì)DDT抗性品系91R和RDDTR的研究發(fā)現(xiàn)，敲減CncC或者過(guò)表達(dá)Keap1都可導(dǎo)致與DDT抗性相關(guān)的細(xì)胞色素P450基因Cyp6a8和Cyp6a2的表達(dá)下調(diào)(Misraetal.，2013)。對(duì)赤擬谷盜Triboliumcastaneum的研究發(fā)現(xiàn)，CncC可調(diào)控與溴氰菊酯抗性相關(guān)的8個(gè)CYP6BQ基因的表達(dá)(Kalsi and Palli, 2015)。對(duì)棉蚜Aphisgossypii的研究發(fā)現(xiàn)，CncC可調(diào)控與棉酚耐性相關(guān)的CYP6DA2基因表達(dá)(Pengetal.， 2016)。對(duì)朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus的研究發(fā)現(xiàn)，CncC可調(diào)控CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28等與甲氰菊酯抗性相關(guān)基因的表達(dá)(Shietal.，2017)。最近對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)Leptinotarsadecemlineata的研究發(fā)現(xiàn)，CncC可調(diào)控CYP9Z25、CYP9Z29、CYP6BJa/b和CYP6BJ1v1等4個(gè)與馬鈴薯次生物質(zhì)解毒代謝和吡蟲(chóng)啉抗性相關(guān)P450基因的表達(dá)(Kalsi and Palli, 2017)。這些研究表明，昆蟲(chóng)Nrf2-Keap1信號(hào)通路可調(diào)控I相、II相和III解毒代謝基因的表達(dá)，在昆蟲(chóng)抗藥性進(jìn)化過(guò)程中具有重要作用。

二化螟Chilosuppressalis(Lepidoptera: Pyralidae)是水稻作物上一種主要的害蟲(chóng)，目前，對(duì)二化螟的防治主要依賴(lài)于化學(xué)農(nóng)藥，但隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，二化螟先后對(duì)殺蟲(chóng)單、三唑磷、毒死蜱、氟蟲(chóng)腈和氯蟲(chóng)苯甲酰胺等殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性(Suetal.，2014；常菊花，2016；Luetal.，2017；Yaoetal.，2017)。本文克隆了二化螟CsCncC和CsKeap1基因，測(cè)定了CsCncC和CsKeap1基因在二化螟不同發(fā)育階段和不同組織的mRNA表達(dá)水平，并研究了CsCncC和CsKeap1基因?qū)⑾x(chóng)劑氯蟲(chóng)苯甲酰胺的誘導(dǎo)響應(yīng)，為進(jìn)一步研究二化螟對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺等殺蟲(chóng)劑的代謝抗性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)與試劑

二化螟試蟲(chóng)采集于揚(yáng)州市儀征市水稻田(32.39 N，119.42 E)，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在溫度28℃±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期為16 ∶8(L ∶D)條件下，用人工飼料進(jìn)行飼養(yǎng)(Huangetal.，2016)。SMARTer RACE 5′/3′ Kit、Mighty Amp、PrimeScriptTM1stcDNA Synthesis Kit、Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex TaqTM等酶和試劑盒購(gòu)買(mǎi)于寶生物工程(大連)有限公司(Takara)；pEASY-T1克隆載體、Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。95%氯蟲(chóng)苯甲酰胺原藥購(gòu)自美國(guó)杜邦公司。

1.2 二化螟處理

根據(jù)前期獲得的氯蟲(chóng)苯甲酰胺對(duì)二化螟的毒力回歸線，分別配制含有LC30(0.092 mg/L)和LC70(0.47 mg/L)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的人工飼料(Huangetal.，2016)。使用含有氯蟲(chóng)苯甲酰胺的人工飼料和對(duì)照飼料處理二化螟3齡幼蟲(chóng)，每個(gè)處理接入60頭幼蟲(chóng)，重復(fù)3次，分別在處理12 h、24 h和36 h后收集樣品試蟲(chóng)，每5頭二化螟幼蟲(chóng)為一個(gè)樣品。

1.3 二化螟CsCncC和CsKeap1的基因克隆與序列分析

根據(jù)試劑盒說(shuō)明，使用Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取二化螟總RNA，置于-80℃條件下保存?zhèn)溆?。以提取的總RNA為模板，使用PrimeScriptTM1stcDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈模板。根據(jù)從二化螟轉(zhuǎn)錄組(Mengetal.，2019a)中鑒定到的CsCncC和CsKeap1序列片段，設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，用于RT-PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。25 μL PCR反應(yīng)體系中包含：9 μL ddH2O、12.5 μL Amp Buffer、1 μL上游/下游引物(10 μM)、0.5 μL Amp聚合酶、1 μL cDNA模板。PCR擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸3 min，循環(huán)37次；72℃延伸10 min。使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，并連接到pEASY-T1克隆載體上，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 本文中使用的引物

根據(jù)RT-PCR測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性引物，使用SMARTer RACE 5′/3′ Kit對(duì)二化螟CsCncC和CsKeap1基因的5′和3′端進(jìn)行擴(kuò)增。分別使用CLUSTALW和MEGA 5.0軟件對(duì)二化螟CsCncC和CsKeap1進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生分析。利用ExPASy在線軟件(https: //web.expasy.org/protparam/)對(duì)翻譯蛋白質(zhì)的蛋白分子質(zhì)量和等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)與已發(fā)表的其它昆蟲(chóng)同源基因的比對(duì)，分析CsCncC和CsKeap1的保守結(jié)構(gòu)域和特征性基序。

1.4 定量PCR(qPCR)檢測(cè)

根據(jù)克隆獲得的二化螟CsCncC和CsKeap1序列信息，設(shè)計(jì)特異性引物，使用熒光定量PCR對(duì)兩個(gè)基因在二化螟不同齡期、不同組織部位中的表達(dá)量進(jìn)行分析。分別收集二化螟幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)的不同齡期試蟲(chóng)，并從3齡幼蟲(chóng)中解剖出血淋巴、神經(jīng)索、腦、脂肪體、表皮、前腸、中腸、后腸和馬氏管組織，從24 h雌成蟲(chóng)中解剖出卵巢組織。每個(gè)樣品收集3個(gè)生物重復(fù)。以在二化螟中穩(wěn)定表達(dá)的EF-1a為內(nèi)參基因(Huietal.，2011；Mengetal.，2019b)。熒光定量PCR反應(yīng)體系中含有10 μL 2×TB Green Premix Ex Taq，10 μM的上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，6 μL滅菌ddH2O。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；在擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。利用2ΔΔCt方法計(jì)算計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量，利用one-way ANOVA 進(jìn)行差異顯著性分析與多重比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 二化螟CsCncC基因克隆及序列分析

通過(guò)克隆獲得二化螟CsCncC基因2 845 bp cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào)：MW147281)，其中包含一個(gè)長(zhǎng)度為2 160 bp的開(kāi)放閱讀框，一個(gè)262 bp的5′非翻譯區(qū)為和一個(gè)423 bp的3′非翻譯區(qū)(圖1)。二化螟CsCncC基因編碼719個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為80.59 kDa，等電點(diǎn)為5.87。

圖1 二化螟CsCncC基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of CsCncC in Chilo suppressalis

氨基酸多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，二化螟CsCncC蛋白具有Nrf2家族的典型結(jié)構(gòu)特征，如含有高度保守的CNC類(lèi)型的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(basic leucine zipper，bZIP)和ETGE基序，但DLG基序變?yōu)镈MG(圖2)。對(duì)不同昆蟲(chóng)CncC的系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，二化螟CsCncC與鱗翅目昆蟲(chóng)CncC聚于同一支(圖3)。

圖2 二化螟CsCncC與其它昆蟲(chóng)CncC的氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Multiple alignments of CncC from Chilo suppressalis and other insects

圖3 二化螟CsCncC的系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CsCncC

2.2 二化螟CsKeap1基因克隆及序列分析

通過(guò)克隆獲得二化螟CsKeap1基因2 544 bp cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào)：MW147282)，其中包含一個(gè)長(zhǎng)度為1 923 bp的開(kāi)放閱讀框，一個(gè)321 bp的5′非翻譯區(qū)為和一個(gè)300 bp的3′非翻譯區(qū)(圖4)。二化螟CsKeap1基因編碼640個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為71.15 kDa，等電點(diǎn)為5.87。

圖4 二化螟CsKeap1基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.4 Nucleotide and deduced amino acid sequences of CsKeap1 in Chilo suppressalis

氨基酸多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，二化螟CsKeap1蛋白具有昆蟲(chóng)Keap1家族的典型結(jié)構(gòu)特征，如高度保守的BTB(bric-abrac/tramtrack/broad complex)區(qū)域、干預(yù)區(qū)(IVR，intervening region)/linker domain和雙甘氨酸或Kelch重復(fù)區(qū)(DGR，double glycine or Kelch repeat)(圖5)。對(duì)不同昆蟲(chóng)Keap1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示，二化螟CsKeap1與鱗翅目昆蟲(chóng)Keap1共聚一枝，具有較高的同源性(圖6)。

2.3 CsCncC和CsKeap1的時(shí)空表達(dá)模式分析

2.3.1CsCncC和CsKeap1在二化螟不同發(fā)育階段的表達(dá)模式分析

對(duì)CsCncC和CsKeap1在二化螟不同發(fā)育齡期(幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng))中的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，CsCncC在蛹末期的表達(dá)量最高，在其它齡期的表達(dá)水平變化不大(圖7)。CsKeap1在二化螟預(yù)蛹期表達(dá)量最低，在成蟲(chóng)初期的表達(dá)水平顯著高于其它齡期，羽化24 h后CsKeap1的表達(dá)水平顯著降低并維持在較低水平(圖8)。

2.3.2CsCncC和CsKeap1在二化螟不同組織中的表達(dá)模式分析

分別解剖二化螟神經(jīng)索、腦、前腸、中腸、后腸、馬氏管、血淋巴、脂肪體、表皮和卵巢組織，對(duì)CsCncC和CsKeap1在二化螟不同組織部位的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果顯示，CsCncC在神經(jīng)組織腦和神經(jīng)索中的表達(dá)量較低，在中腸和馬氏管中高表達(dá)，此外在前腸和卵巢中也具有較高的表達(dá)量(圖9)。CsKeap1在二化螟脂肪體中的表達(dá)量最高，在中腸、馬氏管、神經(jīng)索和卵巢中也具有較高的表達(dá)水平(圖10)。

圖5 二化螟與其它昆蟲(chóng)Keap1的氨基酸序列比對(duì)Fig.5 Multiple alignments of Keap1 from Chilo suppressalis and other insects

圖6 二化螟Keap1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig.6 Phylogenetic analysis of CsKeap1

圖7 CsCncC基因在二化螟不同發(fā)育齡期中的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of CsCncC gene in different developmental stages of Chilo suppressalis

圖8 CsKeap1基因在二化螟不同發(fā)育齡期中的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression levels of CsKeap1 gene in different developmental stages of Chilo suppressalis

圖9 CsCncC基因在二化螟不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Relative expression levels of CsCncC gene in different tissues of Chilo suppressalis

圖10 CsKeap1基因在二化螟不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.10 Relative expression levels of CsKeap1 gene in different tissues of Chilo suppressalis

2.4 二化螟CsCncC和CsKeap1對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的誘導(dǎo)響應(yīng)

使用LC30和LC70劑量氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理二化螟3齡幼蟲(chóng)，測(cè)定藥劑處理對(duì)二化螟CsCncC和CsKeap1的表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，使用LC30劑量氯蟲(chóng)苯甲酰胺分別處理幼蟲(chóng)12 h、24 h和36 h后，相比于對(duì)照，CsCncC在處理12 h和24 h后下調(diào)表達(dá)，在處理36 h后的表達(dá)量無(wú)顯著變化(圖11-A)；CsKeap1的表達(dá)量均顯著降低(圖11-B)。使用LC70劑量氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理后，CsCncC在處理12 h和24 h后的表達(dá)水平無(wú)顯著變化，在處理36 h后被顯著誘導(dǎo)表達(dá)(圖11-A)；CsKeap1的表達(dá)量在處理12 h后顯著下降，在處理24 h后無(wú)明顯變化，在處理36 h后則顯著上調(diào)表達(dá)(圖11-B)。

圖11 二化螟CsCncC(A)和CsKeap1(B)對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的誘導(dǎo)響應(yīng)Fig.11 Induction responses of CsCncC(A) and CsKeap1(B) to chlorantraniliprole treatment in Chilo suppressalis

3 結(jié)論與討論

Nrf2-Keap1通路調(diào)控細(xì)胞氧化還原平衡以及保護(hù)性細(xì)胞抗氧化和Ⅱ相解毒反應(yīng)，對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有至關(guān)重要的作用。本文對(duì)二化螟CsCncC和CsKeap1進(jìn)行了克隆，結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，與哺乳動(dòng)物Nrf2相似，CsCncC具有負(fù)責(zé)與小Maf蛋白(small Maf proteins)形成異源二聚體并與靶標(biāo)基因的抗氧化反應(yīng)元件(ARE，antioxidant response element)結(jié)合的bZIP結(jié)構(gòu)(Nioietal.，2005)以及對(duì)結(jié)合keap1起關(guān)鍵作用的保守性ETGE基序(Chowdhryetal.，2013)，但與其它鱗翅目昆蟲(chóng)一致，與Nrf2和Keap1識(shí)別結(jié)合相關(guān)的DLG基序變?yōu)镈MG(Huetal.，2018)。Cskeap1蛋白分別含有BTB、linker和Kelch結(jié)構(gòu)域。BTB結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)Keap1形成同源二聚體和招募Cullin-3 (Cul3)過(guò)程中具有重要作用(Tkachevetal.，2011；Pitoniak and Bohmann, 2015)。IVR結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸，對(duì)氧化應(yīng)激信號(hào)敏感(Kimetal.，2014；Yangetal.，2017)。在正常條件下，Keap1會(huì)與Nrf2相互結(jié)合形成異二聚體，多余的Nrf2會(huì)被迅速降解掉，從而維持胞質(zhì)中Nrf2的低水平。當(dāng)機(jī)體受到氧化刺激時(shí)，Keap1的IVR區(qū)域會(huì)被迅速激活，這個(gè)過(guò)程會(huì)抑制Nrf2的降解，從而誘導(dǎo)Nrf2在胞質(zhì)中的積累(Lietal.，2008)。DGR區(qū)也叫Kelch區(qū)，其中含有5個(gè)雙甘氨酸重復(fù)序列，是Keap1與Nrf2的結(jié)合區(qū)。系統(tǒng)發(fā)生分析也表明，CsCncC和CsKeap1與其它鱗翅目昆蟲(chóng)同源蛋白聚為一支。

基因表達(dá)模式通常與其生理功能相關(guān)。對(duì)家蠶BombyxmoriLinnaeus的研究發(fā)現(xiàn)，BmCncC在5齡幼蟲(chóng)表皮、馬氏管、頭部和脂肪體表達(dá)水平較高，Bmkeap1在5齡幼蟲(chóng)脂肪體、頭部、生殖腺和表皮表達(dá)水平較高(Wangetal.，2020)。對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)的研究發(fā)現(xiàn)，LdCncC在幼蟲(chóng)中腸、前胸腺和雌成蟲(chóng)卵巢中高水平表達(dá)，LdKeap1在腦-心側(cè)體-咽側(cè)體復(fù)合體中表達(dá)水平最高，在幼蟲(chóng)前腸、前胸腺和雌成蟲(chóng)卵巢中表達(dá)水平也較高(Sunetal.，2017)。本文研究發(fā)現(xiàn)，CsCncC在二化螟中腸和馬氏管中的表達(dá)水平最高，在前腸和卵巢中也具有較高的表達(dá)水平；CsKeap1在二化螟脂肪體中的表達(dá)水平最高，在中腸、馬氏管、神經(jīng)索和卵巢中也具有較高的表達(dá)水平。消化道是昆蟲(chóng)攝入外源化合物后的第一道防線，馬氏管和脂肪體是昆蟲(chóng)對(duì)外源化合物進(jìn)行降解和解毒代謝的重要組織，因此CsCncC和CsKeap1在二化螟不同組織中的表達(dá)模式表明這2個(gè)基因在二化螟的解毒代謝過(guò)程中具有重要作用。值得注意的是，與家蠶相似，CsCncC和CsKeap1在卵巢中也具有一定的表達(dá)水平，表明昆蟲(chóng)CncC和Keap1除了在抗化學(xué)和氧化脅迫中具有重要作用外，還可能具有其它生理功能。

氯蟲(chóng)苯甲酰胺是美國(guó)杜邦公司開(kāi)發(fā)的高效、安全的二酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑。研究發(fā)現(xiàn)，二化螟對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的抗性與細(xì)胞色素P450基因CYP6CV5，CYP9A68，CYP321F3和CYP324A12以及UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶CsUGT40AL1和CsUGT33AG3的過(guò)表達(dá)相關(guān)(Xuetal.，2019；Zhaoetal.，2019)。本文使用LC30和LC70濃度氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理二化螟3齡幼蟲(chóng)，發(fā)現(xiàn)LC30濃度處理并不能誘導(dǎo)CsCncC和CsKeap1的表達(dá)，而用LC70濃度處理36 h后這兩個(gè)基因表達(dá)水平都顯著上調(diào)。對(duì)家蠶的研究也發(fā)現(xiàn)，0.01 mg/L氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理家蠶5齡幼蟲(chóng)后，脂肪體中BmCncC和Bmkeap1的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)(Maoetal.，2019)，但4 mg/L辛硫磷處理家蠶5齡幼蟲(chóng)后24 h后，BmCncC的表達(dá)顯著上調(diào)，而B(niǎo)mkeap1的表達(dá)水平顯著下調(diào)(Huetal.，2018)，表明農(nóng)藥對(duì)昆蟲(chóng)CncC和Keap1的誘導(dǎo)效應(yīng)可能具有劑量依賴(lài)性，并且這種誘導(dǎo)效應(yīng)也因殺蟲(chóng)劑而異。今后有必要進(jìn)一步研究氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理對(duì)CsCncC亞細(xì)胞定位的影響以及CncC-keap1通路在二化螟對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺抗性中的作用。