絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin1對東亞飛蝗酶學免疫的影響

李貝貝，田 野，閆多子，李紅梅，曹廣春，

劉明娜1，張澤華1,2，王廣君1,2*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部錫林郭勒草原有害生物科學觀測實驗站/國家林業(yè)和草原局內(nèi)蒙古草地有害生物監(jiān)測防控國家長期科研基地，內(nèi)蒙古錫林浩特 026000；3. 河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，河北保定 071001；4. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部—CABI生物聯(lián)合實驗室，北京 100193)

與哺乳動物獲得性免疫不同，昆蟲在面對病原菌時，主要依靠自身天然免疫反應來抵抗病原菌的入侵。昆蟲體內(nèi)的酶學相關免疫反應是昆蟲先天性免疫中重要的組成部分，這些酶系變化情況在一定程度上可以反映昆蟲與病原物之間的相互作用，體現(xiàn)病原菌的致病力，同時反映昆蟲對外源物質(zhì)的抗性程度(王正浩, 2016)。昆蟲體內(nèi)免疫相關酶類主要包括保護酶、解毒代謝酶類，其中保護酶系主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)及過氧化氫酶(CAT)等(李周直等, 1994)；代謝解毒酶主要包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、多功能氧化酶(MFO)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、羧酸脂酶(CarEs)及全脂酶(ESTs)等(Bolter and Chefurka, 1990; Lietal., 2007)。

絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitors, Serpins)是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族中最大的一類，在動物、植物、微生物和病毒中廣泛存在(Olson and Gettins, 2011)，主要通過調(diào)控絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應，參與昆蟲的體液免疫反應(Tong and Kanost, 2005)。Serpins通過不可逆的結(jié)合絲氨酸蛋白酶，形成非共價復合物，調(diào)控昆蟲體液免疫反應的Toll通路和黑化反應(Lawetal., 2006)，一方面使免疫反應迅速劇烈的進行，另一方面將免疫反應限定到在一定的程度與范圍內(nèi)，保護宿主自身免受傷害(Hanetal., 2000)。

金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae是一種非常重要的昆蟲病原真菌，研究表明綠僵菌對蝗蟲有較好的防治效果(雷仲仁和問錦曾, 2004)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Serpin1蛋白能降低綠僵菌對飛蝗的毒力(李貝貝等, 2020)。為進一步明確Serpin1的作用機制，本實驗測定了在綠僵菌處理蝗蟲的同時，加入Serpin1蛋白對東亞飛蝗體內(nèi)保護酶、解毒代謝酶共6種酶活力的影響，從酶學水平探索了Serpin1抑制綠僵菌毒力的原因，為進一步明確Serpins的功能提供了參考。

1 材料與方法

1.1 供試真菌

金龜子綠僵菌菌株IMI330189由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所保藏。將IMI330189菌株接種在PDAY固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d，將孢子粉刮下，低溫干燥后采用血球計數(shù)板計算總孢子含量，并通過萌發(fā)培養(yǎng)基檢測萌發(fā)率，計算活孢子含量。其中活孢子量=總孢子含量×萌發(fā)率。4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試蝗蟲及飼養(yǎng)方法

東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis卵購于河北滄州?；嚷言谌斯夂蚺囵B(yǎng)箱中孵化，溫度30℃±2℃，相對濕度為60%±5%，光周期L ∶D=14 h ∶10 h。將孵化后的蝗蝻轉(zhuǎn)移到60 cm×50 cm×70 cm規(guī)格的養(yǎng)蟲籠中飼養(yǎng)至3齡備用，溫度30℃±2℃，光周期L ∶D=14 h ∶10 h。

1.3 Serpin1蛋白的提取

將含有serpin1基因的大腸桿菌EscherichiacoliBL21菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜，2%轉(zhuǎn)接至200 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2 h(OD值0.5～0.6)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，28℃培養(yǎng)10 h。12 000 r/min離心、收集菌體，加入10 mL PBS緩沖液洗兩次，重懸，超聲破碎20 min，離心取上清，采用8M尿素法變性，在采用梯度復性的方法獲得活性的Serpin1蛋白，采用BCA定量法，進行SDS-PAGE電泳，測定Serpin1蛋白的含量，-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 殺蟲活性測定方法

實驗共設4個處理。處理1：金龜子綠僵菌IMI330189孢子粉；處理2：Serpin1蛋白；處理3：金龜子綠僵菌IMI330189孢子粉+Serpin1蛋白；處理4：對照(大腸桿菌BL21(pET-21b)經(jīng)ITPG誘導后提取的蛋白)。根據(jù)前期實驗結(jié)果，設置本實驗各處理中綠僵菌孢子粉和Serpin1蛋白含量，詳見表1(李貝貝等, 2020)。

表1 不同處理所用的餌劑組分及濃度

餌劑配制方法：每個處理分別稱取10 g麥麩，加入5%植物油，混勻，按照表1每個處理中孢子和蛋白的含量，依據(jù)綠僵菌孢子粉中的活孢子含量和Serpin1蛋白原始濃度，分別計算、并稱量所需的孢子粉和蛋白，加入麥麩中，混勻，各自均分成5份，分別放入滅菌的培養(yǎng)皿中備用。

殺蟲活性測定方法：將預先饑餓處理12 h的3齡蝗蝻放入無菌的生測筐中，每筐30頭為1個重復，將分好的餌劑分別放入裝有蝗蝻的生測筐中，每個處理5筐(重復5次)。飼喂24 h后將餌劑取出，用新鮮麥苗飼喂至實驗結(jié)束，溫度30℃，光照16 L ∶8 D。每日記錄死亡和存活數(shù)，并計算累計死亡率。

1.5 蝗蟲蛋白酶提取液的制備

實驗處理和蝗蟲飼喂方法同1.4，在東亞飛蝗蝗蝻開始飼喂麥苗的當天開始，在每個處理的 5個重復中各取蝗蟲1頭，每個處理共取5頭，連續(xù)取樣5 d(王正浩, 2016)。將每頭蝗蝻分別置于研缽中，加入液氮研磨成粉，倒至1.5 mL EP管中，加入1 mL trizol冰浴勻漿。將勻漿液在4℃下12 000 rpm離心20 min，取上清液作為酶提取液備用。

1.6 保護酶活性測定

超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)試劑盒購自南京建成生物工程公司，操作步驟按說明書的方法進行。酚氧化酶(PO)活性測定參照羅萬春的方法(羅萬春, 2010)。每個樣本重復測定5次。

1.7 解毒酶活性測定

多功能氧化酶(MFO)活性測定參照Han等的方法(Hanetal., 1998)；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性測定參照Oppenoorth和Welling的方法(Oppenoorth and Welling, 1976)；乙酰膽堿酯酶(AChE)酶活測定參照高希武的方法(高希武, 1991)。每個樣本重復測定5次。

1.8 蟲體提取液總可溶性蛋白含量測定

以牛血清蛋白BSA為標準蛋白，參照Bradford方法測定(Bradford, 1976)，每個樣本重復測定3次。

1.9 數(shù)據(jù)處理

所有酶活測定數(shù)據(jù)采用Softmax Pro 6.1軟件進行記錄。本實驗各酶活數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 東亞飛蝗Serpin1蛋白對綠僵菌致病力的影響

東亞飛蝗的累計死亡率在不同處理組中的變化趨勢見圖1。在金龜子綠僵菌IMI330189處理組，東亞飛蝗蝗蝻從第3天起開始死亡，至第11天時累計死亡率達到80.6%；從第3天到第11天，每天的累計死亡率都顯著高于對照(P<0.05)。在Serpin1蛋白單獨處理組，從第1天至第11天，東亞飛蝗蝗蝻的累計死亡率都很低，且與對照無顯著差異(P>0.05)。將Serpin1蛋白和綠僵菌IMI330189孢子混合處理東亞飛蝗后，第1天和第2天的累計死亡率與其他各組無顯著性差異，第3天和第4天累計死亡率與對照組和Serpin1單獨處理組之間都無顯著差異(P>0.05)，但顯著低于綠僵菌IMI330189單獨處理組(P<0.05)；從第5天至第11天，每天的累計死亡率較對照組和Serpin1單獨處理組都顯著升高(P<0.05)，但仍低于相同時間內(nèi)綠僵菌IMI330189單獨處理組的累計死亡率，且差異顯著(P<0.05)。上述結(jié)果表明Serpin1蛋白能夠顯著降低綠僵菌對東亞飛蝗蝗蝻的致病力，使東亞飛蝗蝗蝻的死亡率降低。

圖1 不同處理后東亞飛蝗蝗蝻的死亡率Fig.1 Mortality of Locusta migratoria manilensis treated from different treatments

2.2 Serpin1蛋白對東亞飛蝗保護酶活性的影響

2.2.1對超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

不同處理組的SOD的活性表明(圖2-A),Serpin1蛋白處理組在第4天和第5天的SOD活性顯著高于對照組，在其它天內(nèi)兩組間無顯著性差異。綠僵菌IMI330189處理組在處理的5 d內(nèi)的SOD活性均高于對照組，且第2天和第4天的差異顯著。綠僵菌IMI330189+Serpin1蛋白混合處理組在前4 d的SOD活性均顯著高于對照組，且高于綠僵菌IMI330189處理組?？傮w上講，Serpin1蛋白處理和綠僵菌處理后東亞飛蝗體內(nèi)的保護酶SOD活性呈上升趨勢；綠僵菌IMI330189與Serpin1蛋白混合后，SOD活性較綠僵菌IMI330189單獨處理組呈升高的趨勢。

2.2.2對過氧化物酶(POD)活性的影響

不同處理組的POD的活性表明(圖2-B),Serpin1蛋白處理組在第4天的POD活性顯著高于對照組，在其它天內(nèi)兩組間無顯著差異。綠僵菌IMI330189處理組除第1天外，在其它天內(nèi)的POD活性均顯著高于對照組。綠僵菌IMI330189+Serpin1蛋白混合處理組在處理的第2、第3和第5天，其POD活性顯著低于綠僵菌IMI330189單獨處理組，在其它天內(nèi)差異不顯著。總體來說，Serpin1蛋白處理和綠僵菌處理后飛蝗體內(nèi)的POD活性呈現(xiàn)上升的趨勢，綠僵菌IMI330189+Serpin1蛋白混合處理組的POD活性較綠僵菌IMI330189單獨處理組呈下降趨勢。

2.2.3對酚氧化物(PO)酶活性的影響

不同處理組的PO的活性表明(圖2-C)，Serpin1蛋白處理組除第4天外，在其它天內(nèi)的PO活性顯著高于對照組。綠僵菌IMI330189處理組在處理的第1、第3和第5天的PO活性顯著高于對照組，在其它天內(nèi)兩組差異不顯著。綠僵菌IMI330189+Serpin1蛋白混合處理組在第1天的PO活性顯著高于對照組和綠僵菌IMI330189處理組；第3天時，綠僵菌IMI330189+Serpin1蛋白混合處理組顯著高于對照組，但與綠僵菌IMI330189處理組無顯著差異，在其它天內(nèi)3組差異不顯著?？傮w來講，Serpin1蛋白處理和綠僵菌處理后飛蝗體內(nèi)的PO活性呈現(xiàn)上升的趨勢，且在第1天上升最為明顯；綠僵菌IMI330189+Serpin1蛋白混合處理組的PO活性較綠僵菌IMI330189單獨處理組在第1天呈現(xiàn)上升的趨勢，后期二者之間無顯著差異。

圖2 不同處理組對東亞飛蝗保護酶活性比較Fig.2 Comparison of protective enzymes activity of Locusta migratoria manilensis in different treatment groups注：A，超氧化物歧化酶活性；B，過氧化物酶活性；C，酚氧化酶活性。各酶活性是處理組酶活與對照組酶活的比值。圖中不同字母代表0.05水平差異顯著性。Note：A, SOD activity; B, POD activity; C, PO activity. The value of enzymes activities of treatment group divided by control group. Different letters in the figure represented the significance of difference at the 0.05 level.

2.3 Serpin1蛋白對東亞飛蝗解毒酶活性的影響

2.3.1對多功能氧化酶(MFO)活性的影響

不同處理組的MFO的活性表明(圖3-A)，Serpin1蛋白處理組除第4天外，在其它天內(nèi)的MFO活性顯著高于對照組。綠僵菌IMI330189處理組在處理的第2、第3和第5天的MFO活性較對照組顯著上升，在其它天內(nèi)差異不顯著。綠僵菌IMI330189+Serpin1蛋白混合處理組除處理的第5天外，其它天數(shù)時其MFO活性顯著高于對照組，且在第2、第3和第4天，其混合處理組的MFO活性顯著高于綠僵菌IMI330189單獨處理組，在第1天和第5天時，其MFO活性顯著低于綠僵菌IMI330189單獨處理組。總體上看，綠僵菌單獨處理組和Serpin1蛋白處理組的MFO活性較對照均呈現(xiàn)上升的趨勢，綠僵菌IMI330189+Serpin1蛋白混合處理組的MFO活性高于綠僵菌單獨處理組。

2.3.2對谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的影響

不同處理組的GSTs的活性表明(圖3-B)，Serpin1蛋白處理組在第2天和第4天的GSTs活性顯著高于對照組，在第3天時的GSTs活性顯著低于對照組。綠僵菌IMI330189處理組在第1、第3和第4天的GSTs活性顯著低于對照組，在第2天和第5天時，其GSTs活性顯著高于對照組。綠僵菌IMI330189+Serpin1蛋白混合處理組在處理后的第2天和第4天的GSTs活性顯著高于對照組，在第3天顯著低于對照組，且除第5天外，綠僵菌IMI330189+Serpin1蛋白混合處理組的GSTs活性顯著高于綠僵菌IMI330189處理組?？傮w上看，Serpin1蛋白處理后，東亞飛蝗體內(nèi)GSTs活力呈現(xiàn)升高再降低的趨勢；綠僵菌IMI330189處理后，其GSTs活力呈現(xiàn)升高-降低-再升高的趨勢；綠僵菌IMI330189與Serpin1蛋白混合后，比綠僵菌單獨處理時，GSTs活力在前期呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢。

2.3.3對乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的影響

不同處理組的AChE的活性表明(圖3-C)，Serpin1蛋白處理組在第1、第3和第4天的AChE的活性均顯著高于對照組；第5天時，Serpin1蛋白處理組的AChE活性顯著低于對照組。綠僵菌IMI330189處理組在處理后第1、第2和第4天的AChE活性顯著高于處理組；第5天時，綠僵菌IMI330189處理組顯著低于對照組。綠僵菌IMI330189+Serpin1蛋白混合處理組在處理后第2天和第3天時的AChE活性顯著高于對照組和綠僵菌IMI330189單獨處理組；在第1天和第4天時，顯著低于綠僵菌IMI330189單獨處理組?？傮w上看，Serpin1蛋白處理組和綠僵菌處理后飛蝗體內(nèi)的AChE活性呈先上升后降低的趨勢，綠僵菌IMI330189+Serpin1蛋白混合處理組的AChE活性較綠僵菌IMI330189單獨處理組前期呈先升高后降低的趨勢。

圖3 不同處理組對東亞飛蝗解毒酶活性比較Fig.3 Comparison of detoxifying enzymes activity of Locusta migratoria manilensis in different treatments注：A，多功能氧化酶活性；B，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性；C，乙酰膽堿酯酶活性。各酶活性是處理組酶活與對照組酶活的比值。圖中不同字母代表0.05水平差異顯著性。Note：A, MFO activity; B, GSTs activity; C, AChE activity. The value of enzymes activities of treatment group divided by control group. Different letters in the figure represented the significance of difference at the 0.05 level.

綜上所述，將Serpin1蛋白與綠僵菌IMI330189混合處理東亞飛蝗后，與綠僵菌IMI330189單獨處理相比，東亞飛蝗體內(nèi)的MFO、GST、SOD、PO的活力升高，POD的活力降低，AChE的活力呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，在這些酶活性的綜合調(diào)節(jié)下，最終造成混合處理組的死亡率較綠僵菌單獨處理組顯著降低。

3 結(jié)論與討論

昆蟲在病原物侵染時，會誘導自身的免疫反應以抵抗并消除病原菌，其中酶學反應是免疫的重要組成部分(Desneuxetal., 2007)。前期研究發(fā)現(xiàn)飼喂綠僵菌孢子粉后，東亞飛蝗體內(nèi)的保護酶呈現(xiàn)先上升后下調(diào)的趨勢，多功能氧化酶和活性氧呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(郭隆隆, 2019)。Serpins可以通過調(diào)控體內(nèi)絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應，從而調(diào)控昆蟲免疫過程(Olson and Gettins, 2011)。本實驗通過測定Serpin1蛋白與綠僵菌混合處理東亞飛蝗后的死亡率，證明Serpin1能夠有效抑制綠僵菌對東亞飛蝗的侵染，降低東亞飛蝗的致死率。因此，明確serpins對蝗蟲體內(nèi)免疫相關酶的影響，對于揭示Serpins抑制綠僵菌毒力的機制、明確Serpins的功能具有重要意義。

超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)能夠清除超氧化物陰離子自由基O2-和H2O2，在昆蟲抵御病原菌的侵染中起到重要作用。賈苗研究發(fā)現(xiàn)，將吡蟲啉與綠僵菌混合處理東亞飛蝗，可致使東亞飛蝗體內(nèi)的保護酶SOD和POD的活性升高(賈苗, 2017)。表明綠僵菌侵入后可能造成東亞飛蝗體內(nèi)O2-增多，使蟲體的保護酶系統(tǒng)開啟，誘導并增強SOD活性來清除O2-，并進一步誘導體內(nèi)的POD活性升高以清除過多的H2O2(李周直等, 1994)。本研究發(fā)現(xiàn)，Serpin1蛋白處理組和綠僵菌IMI330189與Serpin1蛋白混合組SOD活力較綠僵菌單獨處理組表現(xiàn)為升高的趨勢，表明Serpin1蛋白能夠進一步提高東亞飛蝗體內(nèi)SOD活力，增強蟲體消除機體吞噬或包囊病原體等過程中所產(chǎn)生的過量活性氧的能力，保護昆蟲避免因過多活性氧造成自身損傷。Serpin1蛋白處理組的POD的酶活性顯著升高，而綠僵菌IMI330189與Serpin1蛋白混合組POD的酶活性表現(xiàn)為降低的趨勢，推測可能是因為綠僵菌的侵入菌絲在東亞飛蝗體內(nèi)大量萌發(fā)，致使體內(nèi)的POD活性受到抑制，確切原因需要進一步深入探索。

當病原菌侵入時，昆蟲會催化自身黑化反應以清除外來病原物，其中酚氧化酶(PO)是催化黑化反應的重要因子(Duan and Otvosi, 2001)。在分子氧存在條件下，PO能把酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)，最終再聚合成黑色素參與到免疫防御過程中，與此同時其氧化過程中形成的醌類物質(zhì)可協(xié)助殺死被包被的微生物(Cerenius and Soderhall, 2004)。如當白僵菌Beauveriabassiana侵入岡比亞按蚊Anophelesgambiae時，白僵菌體內(nèi)的分生孢子、菌絲均可以誘導岡比亞蚊產(chǎn)生黑色素并引發(fā)黑化反應，阻礙白僵菌在蟲體內(nèi)的生長發(fā)育(Yassineetal., 2012)。本研究發(fā)現(xiàn)，在綠僵菌侵入的前期，東亞飛蝗的PO活性顯著高于對照組，表明東亞飛蝗黑化反應被激活以抵抗綠僵菌的侵染，并在綠僵菌侵染前期發(fā)揮作用；Serpin1蛋白單獨處理后PO活性表現(xiàn)出升高趨勢，將綠僵菌IMI330189與Serpin1蛋白混合后，東亞飛蝗體內(nèi)PO活性進一步升高，表明Serpin1蛋白能夠有效增強東亞飛蝗的黑化反應，提高東亞飛蝗的免疫力。

多功能氧化酶(MFO)的成分包括細胞色素和黃素蛋白等，其中起主要作用的是細胞色素P450。病原菌進入昆蟲體內(nèi)，昆蟲體內(nèi)的氧化型P450與之結(jié)合形成復合物，后被NADPH還原，最后結(jié)合并激活氧，裂解成產(chǎn)物并合成水，最終降解病原菌的毒性(Zhouetal., 2010)。賈苗研究發(fā)現(xiàn)，用綠僵菌與環(huán)氧蟲啶聯(lián)合處理東亞飛蝗時，致使東亞飛蝗體內(nèi)的解毒酶MFO活性顯著升高(賈苗, 2017)。羅林珍采用不同殺蟲劑處理韭菜遲眼蕈蚊BradysiaOdriphaga幼蟲時，發(fā)現(xiàn)不同殺蟲劑均可使韭菜遲眼蕈蚊體內(nèi)的MFO活性呈現(xiàn)出升高的趨勢(羅林珍, 2017)。這些研究都進一步明確了MFO的解毒功能。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂綠僵菌后東亞飛蝗體內(nèi)的MFO活性升高，表明蟲體在積極分解綠僵菌的毒性；Serpin1蛋白單獨處理后PO活性表現(xiàn)出升高趨勢，將綠僵菌IMI330189與Serpin1蛋白混合后，東亞飛蝗體內(nèi)的MFO活性較綠僵菌單獨處理組呈現(xiàn)增高趨勢，表明Serpin1蛋白能增強東亞飛蝗體內(nèi)多功能氧化酶活性，提高東亞飛蝗降解綠僵菌毒素的能力。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的解毒作用主要體現(xiàn)在能夠催化還原谷胱甘肽，使其通過與各種有害化學物質(zhì)的親電子基團相結(jié)合，最終形成硫醚氨酸促使各種毒性物質(zhì)排出體外。當昆蟲受到有毒物質(zhì)的脅迫時，通過增加GSTs的表達量來增加其本身的解毒能力，達到緩解毒害的目的(周先碗, 1999)。蔣興川等研究發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda幼蟲在受到甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽刺激時，其體內(nèi)的GSTs活力會呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢(蔣興川等, 2019)。麥扁盾蝽Eurygasterintegriceps經(jīng)球孢白僵菌及次生代謝產(chǎn)物侵入的中期，體內(nèi)的GSTs活力顯著升高(Zibaeeetal., 2009)。本研究發(fā)現(xiàn)，東亞飛蝗經(jīng)綠僵菌侵染后，GSTs表現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，表明綠僵菌的侵入引起東亞飛蝗分泌GSTs來抵抗綠僵菌的入侵，后期綠僵菌菌絲在東亞飛蝗體內(nèi)大量增殖，使體內(nèi)的免疫系統(tǒng)紊亂，造成GSTs活力降低。經(jīng)Serpin1蛋白單獨處理，GSTs也表現(xiàn)出升高的趨勢，且將綠僵菌IMI330189與Serpin1蛋白混合后，GSTs的活力較綠僵菌單獨處理組呈現(xiàn)增高的趨勢，表明Serpin1蛋白能夠增強GSTs的活性，提高東亞飛蝗的解毒能力，以抵抗病原菌的侵染。

乙酰膽堿酯酶(AchE)是昆蟲體內(nèi)重要的神經(jīng)系統(tǒng)酶，在昆蟲神經(jīng)化學傳遞中起著至關重要的作用。它主要是通過迅速分解蟲體的乙酰膽堿，防止因乙酰膽堿積累造成的神經(jīng)傳遞阻斷，將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)，從而降低病原物對昆蟲的毒害作用(Fournier and Mutero, 1994; 唐培安等, 2007)。當使用有機磷殺蟲劑侵染處理果蠅Drosophilia和麥二叉蚜Schizaphisgraminum時，它們體內(nèi)的AchE活性顯著升高，從而降低了對殺蟲劑的敏感性(Zhu and Gao, 1999)。王龍江等研究發(fā)現(xiàn)，紅火蟻SolenopsisinvictaBuren感染白僵菌后，其體內(nèi)乙酰膽堿酯酶也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，表明病原物侵染可以誘導昆蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶上調(diào)，從而增強對病原物的抵抗力(王龍江等, 2010)。本研究中，經(jīng)過綠僵菌侵染后，東亞飛蝗體內(nèi)的AChE活性也呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，推測東亞飛蝗通過提高分解乙酰膽堿酯的能力從而抵抗綠僵菌的侵入，后隨著綠僵菌大量增殖，體內(nèi)乙酰膽堿含量升高，導致神經(jīng)阻斷而酶活力下降。經(jīng)Serpin1蛋白處理，AChE活性表現(xiàn)出升高的趨勢，且綠僵菌IMI330189+ Serpin1蛋白混合組的AChE活性較綠僵菌單獨處理組先升高再降低，推測前期Serpin1蛋白的增加導致蝗蟲分解乙酰膽堿的能力增強，從而迅速降低綠僵菌的毒力，后期AChE活性降低可能是Serpin1蛋白為防止體內(nèi)過多的AChE破壞東亞飛蝗自身的神經(jīng)系統(tǒng)，導致蟲體因過度免疫而死亡。

本實驗通過測定Serpin1蛋白與綠僵菌IMI330189混合后對東亞飛蝗體內(nèi)保護酶和解毒酶等6種免疫相關酶的影響，證明Serpin1蛋白能夠有效調(diào)控東亞飛蝗的體內(nèi)相關酶的活力，提高東亞飛蝗的免疫力，從而降低綠僵菌對東亞飛蝗的致死率，為進一步明確Serpins的功能提供了參考。