基于高通量測(cè)序的阿爾泰蝠蛾(鱗翅目:蝙蝠蛾科)幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組分析

孫 濤，張示淵，王 巖,陳創(chuàng)夫

(1. 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2. 石河子大學(xué)第三附屬醫(yī)院(石河子市人民醫(yī)院)；3. 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院；4. 石河子大學(xué)畜牧學(xué)博士后流動(dòng)站，新疆維吾爾自治區(qū)石河子市 832000)

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-sequencing)技術(shù)的廣泛運(yùn)用，可以獲得大量的轉(zhuǎn)錄本信息，從中發(fā)掘出有重要功能的基因，尤其適用于基因信息匱乏的物種，很大程度上促進(jìn)了非模式生物的功能基因組分析(Nagalakshmietal., 2008)，也為研究鱗翅目昆蟲(chóng)分類(lèi)、進(jìn)化、發(fā)育、與寄主互作等問(wèn)題提供了技術(shù)支持(楊帆等，2014)。與全基因組相比，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成本低、周期短，具有很高的性?xún)r(jià)比。對(duì)于目前還沒(méi)測(cè)定全基因組的非模式昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，先測(cè)轉(zhuǎn)錄組是深入研究基因發(fā)掘、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和功能鑒定的最佳選擇(張棋麟和袁明龍，2013)。目前，已有甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Pascualetal., 2012)、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(Youetal., 2013)、沙棘蠹木蛾Eogystiahippophaecolus(Cuietal., 2017)等鱗翅目非模式昆蟲(chóng)開(kāi)展了高通量測(cè)序。

阿爾泰蝠蛾HepialusaltaicolaWang屬于鱗翅目Lepidoptera蝙蝠蛾科Hepialidae蝠蛾屬Hepialus，是新疆特有昆蟲(chóng)，僅分布于海拔1 000～3 000 m處的新疆阿爾泰山。其幼蟲(chóng)是新疆蟲(chóng)草菌Ophiocordycepsgracilis的寄主昆蟲(chóng)，受真菌感染后形成的蟲(chóng)菌復(fù)合體即新疆蟲(chóng)草，具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)意義(索菲婭等，2008)。阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)棲居于地下5～20 cm的土壤層中，以采食新疆芍藥Paeoniasinjiangensis和新疆藜蘆Veratrumlobelianum等植物嫩根部分為生，所棲息的土壤微環(huán)境的日平均溫度在-5～15℃，每年還要經(jīng)歷長(zhǎng)達(dá)半年的凍土期。另外，通過(guò)野外觀察和室內(nèi)飼養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，幼蟲(chóng)在0～5℃還能維持取食和運(yùn)動(dòng)能力，具有很強(qiáng)的低溫環(huán)境適應(yīng)性。目前，對(duì)阿爾泰蝠蛾的研究主要集中在生物學(xué)特性方面，主要包括生殖規(guī)律的觀察(趙恒等，1998a)、幼蟲(chóng)的飼養(yǎng)(趙恒等，1998b)、活蛹的無(wú)損鑒別(王巖等，2018)和食性的調(diào)查研究(王巖等，2020)等，而關(guān)于蝠蛾基因方面的研究相對(duì)較少。溫度在決定昆蟲(chóng)的生存、分布和數(shù)量方面起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)也影響昆蟲(chóng)生理生化過(guò)程、代謝活動(dòng)以及生長(zhǎng)發(fā)育狀況(Sinclairetal., 2003)。阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)獨(dú)特的生境(低溫高海拔地區(qū))及低溫下仍能維持取食和運(yùn)動(dòng)的能力，為研究昆蟲(chóng)低溫適應(yīng)性提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。

本研究采用Illumina HiSeqTM2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)獲得的Unigenes進(jìn)行基因功能注釋、分類(lèi)及代謝途徑的分析，以期獲得阿爾泰蝠蛾更多的轉(zhuǎn)錄本信息，從基因組水平上發(fā)掘蝠蛾應(yīng)激代謝相關(guān)的功能基因，為研究蝠蛾低溫適應(yīng)相關(guān)分子和代謝調(diào)節(jié)機(jī)制提供依據(jù)，也為進(jìn)一步相關(guān)基因的克隆與表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)采自新疆阿勒泰地區(qū)布爾津縣的阿爾泰山上(海拔1 260 m)，收集幼蟲(chóng)棲身土壤作為飼養(yǎng)土帶回實(shí)驗(yàn)室。選擇個(gè)體大小相近的健康活蟲(chóng)用于轉(zhuǎn)錄組研究，飼養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中(MGC-250P型，上海一恒)，飼養(yǎng)溫度為12℃±1℃，相對(duì)濕度50%～60%，光周期16 L ∶8 D，飼養(yǎng)一周后用液氮速凍并保存于-80℃冰箱備用。

1.2 RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建和Illumina測(cè)序

從凍存的蝠蛾幼蟲(chóng)中選取大小相近的3頭，用TRIzol試劑提取RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA降解程度及是否有污染，Nanodrop 2000分光光度計(jì)(IMPLEN, CA, USA)檢測(cè)RNA的純度(OD260/OD280)，并用Qubit RNA Assay Kit對(duì)RNA濃度進(jìn)行定量，Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies, CA, USA)檢測(cè)RNA的完整性。

將檢測(cè)合格的總RNA樣品用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，加入fragmentation buffer使其隨機(jī)打成短片段，再以片段化的mRNA為模板，用6堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成cDNA第一鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA聚合酶I合成cDNA第二鏈，并使用AMPure XP beads對(duì)其進(jìn)行純化。洗脫純化后的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，再用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，最后通過(guò)PCR擴(kuò)增得到cDNA文庫(kù)。采用Illumina HiSeqTM2500(Illumina, San Diego, CA, USA)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為PE125。cDNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序工作由北京百邁克生物科技有限公司協(xié)助完成。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)組裝和拼接

對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行過(guò)濾，去除接頭污染，去除未知堿基N大于10%的reads，去除低質(zhì)量reads(質(zhì)量值Q phred <=20的堿基數(shù)占整個(gè)reads的50%以上的reads)，得到過(guò)濾后的數(shù)據(jù)(clean reads)，再進(jìn)行后續(xù)分析。在高質(zhì)量的clean reads基礎(chǔ)上計(jì)算Q20(Phred>20堿基占總堿基的百分比)、Q30(Phred>30堿基占總體堿基的百分比)、GC(堿基G和C的總和占總的堿基數(shù)的百分比)含量和重復(fù)序列水平。利用Trinity軟件(Grabherretal, 2011)對(duì)clean reads進(jìn)行拼接組裝，使用Tgicl對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)去冗余得到最終的單基因簇Unigenes用于后續(xù)分析，命名為“All-unigene”。

1.4 基因功能注釋和分類(lèi)

為獲得全面的基因功能信息，使用Blast通過(guò)序列相似性將Unigenes與7個(gè)主要功能數(shù)據(jù)庫(kù)(Nr，KOG/COG，Swiss-Prot，Pfam，KEGG和GO)進(jìn)行比對(duì)，得到基因的功能注釋信息。然后用Blast2GO和WEGO進(jìn)行GO(Gene Ontology)條目和功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)(Conesaetal., 2005; Yeetal., 2006)。利用KOBAS 2.0(Xieetal., 2011)獲得KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)中Unigenes的直系同源結(jié)果。用HMMER(Eddy, 1998)將Unigene序列與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(Finnetal., 2014)進(jìn)行比較，獲得Unigenes的注釋信息。

1.5 CDS預(yù)測(cè)

根據(jù)功能注釋結(jié)果，將Unigenes按照Nr、Swissprot、KEGG、COG蛋白庫(kù)的優(yōu)先級(jí)順序進(jìn)行比對(duì)，挑選Unigene的最佳比對(duì)片段作為該Unigene的CDS(按照5′>3′的順序)；沒(méi)有比對(duì)上的序列或比對(duì)上未預(yù)測(cè)出結(jié)果的序列，則采用ESTScan軟件預(yù)測(cè)，得到這部分基因編碼的核酸序列和氨基酸序列。

1.6 與環(huán)境適應(yīng)和抗逆性相關(guān)基因的推測(cè)

根據(jù)獲得的阿爾泰蝠蛾基因功能注釋信息，結(jié)合已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道(Luetal., 2014; Cuietal., 2017; Torsonetal., 2017)，從中推測(cè)出與環(huán)境應(yīng)激相關(guān)的代謝調(diào)節(jié)候選基因。采用FPKM (fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)值表示對(duì)應(yīng)Unigenes的表達(dá)豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿爾泰蝠蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝

轉(zhuǎn)錄組樣本數(shù)據(jù)量為21.31 G，經(jīng)過(guò)分析，共組裝獲得144 329個(gè)轉(zhuǎn)錄本，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行聚類(lèi)和組裝分析得到100 133個(gè)Unigenes，總長(zhǎng)度86 319 112 bp，平均長(zhǎng)度862 bp，N50(覆蓋50%所有核苷酸的最大序列重疊群長(zhǎng)度)長(zhǎng)度為1 628 bp，其中長(zhǎng)度在1 kb以上的有23 747條，占全部Unigenes的23.72%，長(zhǎng)度為200～300 bp的Unigene所占比例最大，占總體的33.6%(表1)，阿爾泰蝠蛾轉(zhuǎn)錄組組裝后得到Unigenes長(zhǎng)度分布(圖1)。序列的質(zhì)量參數(shù)Q20的百分比在97%以上；Q30的百分比在92%以上(表2)，可對(duì)轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表1 阿爾泰蝠蛾轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果

表2 阿爾泰蝠蛾cDNA 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估統(tǒng)計(jì)表Table 2 Summary for raw reads of cDNA samples of Hepialus altaicola

圖1 阿爾泰蝠蛾轉(zhuǎn)錄組組裝后得到Unigenes長(zhǎng)度分布Fig.1 Length distribution of all assembled Unigenes of Hepialus altaicola

2.2 Unigene的功能注釋、分類(lèi)和代謝途徑分析

2.2.1Unigene在各數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)

將獲得的100 133個(gè)Unigenes分別在7個(gè)主要功能數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，取閾值e≤10-10，共有38 198條Unigenes獲得注釋?zhuān)?8.15%；其中占比最高的是Nr數(shù)據(jù)庫(kù)，注釋32 381條Unigenes(32.34%)，與其他生物的已知蛋白具有不同程度的同源性。COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋基因共有11 084條，占11.03%；KOG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋基因共有20 669條，占20.64%；Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)注釋基因共有16 690條，占16.67%；Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)注釋基因共有23 816條，占23.78%；GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋基因共有13 261條，占13.24%；KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋基因共有15 058條，占14.78%；此外，通過(guò)其中5種主要數(shù)據(jù)庫(kù)(COG、NR、GO、Swiss-Prot和Pfam)維恩圖可以更清晰了解各數(shù)據(jù)庫(kù)交叉注釋情況(圖2)。

從所注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的物種分布來(lái)看，有1 634個(gè)(占5.36%)基因與斜紋夜蛾Spodopteralitura相似基因序列最多；其次為臍橙螟蛾Amyeloistransitella，有1 503個(gè)(占4.93%)；有1 376個(gè)(占4.51%)基因與一種名為Pristionchuspacificus的寄生蟲(chóng)線(xiàn)蟲(chóng)同源；其它相似性序列數(shù)量大于2%的物種有小菜蛾(4.13%)，家蠶Bombyxmori(3.89%)，偏瞳蔽眼蝶Bicyclusanynana(3.63%)，棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera(3.59%)，煙芽夜蛾Heliothisvirescens(3.50%)，柑橘鳳蝶Papilioxuthus(2.87%)，其它物種占63.59%(圖3)。

圖2 COG, GO, NR, Pfam及Swissprot功能注釋維恩圖Fig.2 A Venn diagram shows commonality and difference of annotation based on COG, GO, NR, Pfam and Swissprot

圖3 阿爾泰蝠蛾Unigenes在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中的物種分布圖Fig.3 Species distribution of Unigenes of Hepialus altaicola in Nr database

2.2.2Unigene的COG分類(lèi)注釋

經(jīng)過(guò)COG數(shù)據(jù)庫(kù)功能預(yù)測(cè)和分類(lèi)，共有11 084 個(gè)Unigenes被注釋?zhuān)鶕?jù)其功能可分為26類(lèi)(圖4)。其中，一般功能預(yù)測(cè)類(lèi)(General function prediction only，1 432個(gè))基因最多；其次為轉(zhuǎn)錄、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成(Translation, ribosomal structure and biogenesis，1 428個(gè))；翻譯后修飾，蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶(Posttranslational modification, protein turnover, chaperones，1 175個(gè))、碳水化合物運(yùn)輸和代謝(Carbohydrate transport and metabolism，1 059個(gè))，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(Amino acid transport and metabolism，826個(gè))，其他類(lèi)別的基因表達(dá)豐度各不相同。COG分類(lèi)揭示了可能參與調(diào)節(jié)阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)在冷適應(yīng)過(guò)程中基因的特定反應(yīng)和功能。

2.2.3Unigene的GO分類(lèi)注釋

共有13 261個(gè)Unigenes在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中3大類(lèi)57個(gè)功能組中找到對(duì)應(yīng)，分別是分子功能(Molecular function)分為15個(gè)亞類(lèi)，細(xì)胞成分(Cellular component)的19個(gè)亞類(lèi)，生物學(xué)過(guò)程(Biological process)23個(gè)亞類(lèi)。分子功能類(lèi)注釋到15 023條，其中催化活性(Catalytic activity)和結(jié)合活性(Binging)的Unigenes數(shù)量較多，分別是6 871和5 786條，其余均在1 000條以下。細(xì)胞成分類(lèi)注釋到22 008條，其中細(xì)胞(Cell)和細(xì)胞部分(Cell part)的Unigenes數(shù)量較多，分別是4 529和4 519條；生物學(xué)過(guò)程類(lèi)注釋到23 963條，排在前三位的是代謝過(guò)程(Metabolic process)、細(xì)胞過(guò)程(Cellular process)和單一有機(jī)體過(guò)程(Single-organism process)，分別是6 257、6 217和3 581條，其余的均在2 000條以下(圖5)。

2.2.4Unigene的KEGG分類(lèi)注釋

使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Unigenes代謝途徑分析。結(jié)果顯示，共有15 058個(gè)Unigenes參與了環(huán)境信息處理(Environmental information processing)、遺傳信息處理(Genetic information processing)、細(xì)胞過(guò)程(Cellular processes)、代謝(Metabolism)和有機(jī)體系統(tǒng)(Organismal systems)5類(lèi)代謝分支，歸屬于305條通路。其中注釋最多的5個(gè)代謝通路依次為核糖體(678)、碳代謝(431)、剪接體(414)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(395)、嘌呤代謝(371)(表3)。

圖4 阿爾泰蝠蛾Unigenes的COG分類(lèi)圖Fig.4 COG functional categories of Hepialus altaicola Unigenes注：圖中括號(hào)內(nèi)數(shù)字代表Unigenes的數(shù)量，百分?jǐn)?shù)代表其所占比例。Note:The numbers in brackets in the figure represent the number of unigenes, and the percentage represents its propotion.

圖5 Unigenes的GO分類(lèi)圖Fig.5 GO functional categories of Unigenes

表3 阿爾泰蝠蛾的KEGG通路總結(jié)

2.3 CDS預(yù)測(cè)

編碼序列(CDS)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，共54 002條序列可被編碼，占全部基因的53.93%(54 002/100 133)。長(zhǎng)度在300 nt以上的Unigene為40 237條，占74.51%。其中0～100 nt的最多，有23 591條；其次是100～200 nt(11 072條)及200～300 nt(5 574條)，其余長(zhǎng)度區(qū)間的CDS都在5 000條以下(圖6)。

圖6 編碼序列(CDS)長(zhǎng)度分布圖Fig.6 Coding sequence (CDS) length distribution

2.4 與環(huán)境應(yīng)激相關(guān)的代謝調(diào)節(jié)基因的分析

對(duì)阿爾泰蝠蛾基因表達(dá)量進(jìn)行分析，已有基因功能注釋信息中的大多數(shù)Unigenes與生物過(guò)程中的新陳代謝有關(guān)。結(jié)合已有的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選了311個(gè)可能與冷適應(yīng)相關(guān)的蛋白和酶的代謝調(diào)節(jié)基因，例如昆蟲(chóng)表皮蛋白(Insect cuticle protein, ICP)，熱休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)，海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Trehalose transporter 1, TRET1)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase, GST)和幾丁質(zhì)酶Chitinase(表4)。其中大多數(shù)與HSP相關(guān)的Unigenes被預(yù)測(cè)為編碼HSP70(31條)和HSP90(18條)型，其余還包括HSP40、HSP60及分子量小于30 kDa的小分子熱休克蛋白(small Heat Shock Proteins,sHSPs)。這些注釋信息能夠?yàn)榘柼鸲暧紫x(chóng)環(huán)境適應(yīng)性中發(fā)揮潛在作用的基因功能研究提供新的線(xiàn)索。

表4 阿爾泰蝠蛾抗逆性相關(guān)基因的推測(cè)

表5 阿爾泰蝠蛾轉(zhuǎn)錄組FPKM統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論與討論

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組分析逐漸成為非模式生物發(fā)掘功能基因的有效手段(Veraetal., 2008)。本研究應(yīng)用Illumina高通量無(wú)參考基因組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了阿爾泰蝠蛾的轉(zhuǎn)錄組信息，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析和基因功能注釋?zhuān)瑥闹邪l(fā)掘與應(yīng)激代謝相關(guān)的抗逆性基因。通過(guò)序列的處理、Trinity拼接、轉(zhuǎn)錄本功能注釋等步驟，得到數(shù)據(jù)量為21.31 G的原始轉(zhuǎn)錄組信息，共144 391個(gè)轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)一步分析得到100 133個(gè)Unigenes，總長(zhǎng)度86 319 112 bp，平均長(zhǎng)度和N50長(zhǎng)度分別為862 bp和1 628 bp。同為蝙蝠蛾科的小金蝠蛾Hepialusxiaojinensis轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到50 164條Unigenes，N50為1 357 nt(Mengetal., 2015)。一般認(rèn)為N50值越大，反映組裝得到的長(zhǎng)片段越多，組裝效果越好。從獲得基因的數(shù)量、平均長(zhǎng)度和N50值等方面均顯示本次阿爾泰蝠蛾轉(zhuǎn)錄組的拼接效果良好；堿基Q30值>92%，說(shuō)明堿基識(shí)別率較高，Q30值在80%以上認(rèn)為測(cè)序質(zhì)量可靠(王興春等，2015)。上述結(jié)果表明本研究測(cè)序和組裝結(jié)果較好，其質(zhì)量和長(zhǎng)度滿(mǎn)足轉(zhuǎn)錄組分析的基本要求。

圖7 阿爾泰蝠蛾轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)豐度較高的50個(gè)基因Fig.7 Top 50 most abundant Unigenes in the antennal transcriptome of Hepialus altaicola

基因數(shù)據(jù)庫(kù)中參考序列的數(shù)量是決定轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋比例的主要因素，例如家蠶(Xiaetal., 2004)、大蠟螟Galleriamellonella(Vogeletal., 2011)等研究鱗翅目昆蟲(chóng)的模式生物，其全基因組測(cè)序?yàn)轺[翅目昆蟲(chóng)生物學(xué)和免疫學(xué)等基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。本研究共計(jì)有38 198條(占38.15%)Unigenes被Nr、Swiss-Prot、Pfam、GO、COG/KOG和KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)杂?1 935條(61.85%)序列無(wú)法成功比對(duì)，這可能與拼接的序列片段過(guò)短而缺乏注釋信息有關(guān)(魏利斌等，2012)，也可能本身是非編碼序列或者是新的某種基因(Houetal., 2011)，而與已報(bào)道其他昆蟲(chóng)缺少同源性。

GO是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的基因功能分類(lèi)體系，能夠全面描述生物體基因和基因產(chǎn)物的屬性，從宏觀上認(rèn)識(shí)某一物種的基因功能分布特征(Botsteinetal., 2000)。阿爾泰蝠蛾轉(zhuǎn)錄組Unigenes在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中共得到的13 261條功能注釋?zhuān)渲袇⑴c代謝、催化與結(jié)合活性的基因功能注釋較多，這與其它昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果相一致(Zhangetal., 2015; 孟翔等, 2016)。不同昆蟲(chóng)的GO二級(jí)功能注釋有所差異，如意大利蝗Calliptamusitalicus二級(jí)功能注釋有52個(gè)(向敏，2017)；大蠟螟有55個(gè)(楊爽，2019)；麥紅吸漿蟲(chóng)Sitodiplosismosellana有50個(gè)(蔣月麗等，2020)；而阿爾泰蝠蛾GO二級(jí)功能注釋有57個(gè)。阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到305條代謝通路，主要涉及核糖體、碳代謝等，其中參與核糖體代謝(ko03010)的基因數(shù)量最多，達(dá)678條，該代謝通路由核糖體蛋白主導(dǎo)，其基因?qū)颂求w蛋白的合成起重要作用，能夠影響生物體的生命活動(dòng)(Uechietal., 2001)。

在GO功能富集中，注釋到與生物學(xué)過(guò)程中的代謝過(guò)程相關(guān)的Unigenes占比最高(占26.11%)。共分析得到311個(gè)與阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)應(yīng)激代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的Unigenes，分屬于11個(gè)不同的類(lèi)群(表4)。這些基因被歸類(lèi)為以下功能：蛋白質(zhì)折疊(GO：0006457)，對(duì)壓力的反應(yīng)(GO：0006950)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)(GO：0015758)，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(GO：0022857)，熱激蛋白結(jié)合(GO：0031072)，ATP代謝過(guò)程(GO：0046034)，超氧化物代謝過(guò)程(GO：0006801)，水解酶活性(GO：0016787)，三羧酸循環(huán)(GO：0006099)等。響應(yīng)冷適應(yīng)調(diào)節(jié)的基因“熱休克蛋白”(90個(gè))，參與催化活性的“ATP合酶”(62個(gè))的基因表達(dá)最多。熱休克蛋白是重要的分子伴侶，它的表達(dá)和調(diào)控是物種響應(yīng)環(huán)境脅迫的物質(zhì)基礎(chǔ)，在昆蟲(chóng)的應(yīng)激響應(yīng)中發(fā)揮重要作用(Wangetal., 2019)，對(duì)耐受低溫環(huán)境得以生存至關(guān)重要(Rinehartetal., 2007)。在所注釋的熱休克蛋白中，HSP70和HSP90基因數(shù)量最多，這與分布于低溫高原地區(qū)的竹蝗Ceracriskiangsu在15℃冷馴化下表達(dá)量類(lèi)似(Lietal., 2019)。而熱休克蛋白的合成，消耗了生物體大量的能量，因此，參與ATP合成的基因在低溫脅迫后大量表達(dá)。在阿爾泰蝠蛾轉(zhuǎn)錄組中有22個(gè)Unigenes被注釋為昆蟲(chóng)表皮蛋白，且表達(dá)量較高，這些表皮蛋白在昆蟲(chóng)表皮形成，它的產(chǎn)生是一種細(xì)胞保護(hù)策略，以應(yīng)對(duì)環(huán)境挑戰(zhàn)(Zhangetal., 2008)。海藻糖酶可以水解昆蟲(chóng)血淋巴中的海藻糖，產(chǎn)生2分子葡萄糖，能夠?yàn)槔ハx(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育、代謝、大分子生物合成等提供所需能量，在昆蟲(chóng)蛻皮過(guò)程中的幾丁質(zhì)合成、耐寒性方面也發(fā)揮重要作用(Shietal., 2016)。有49個(gè)Unigenes被注釋為海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，幫助昆蟲(chóng)脂肪體中合成的海藻糖進(jìn)入胞外，通過(guò)血淋巴運(yùn)送到各組織，為生命活動(dòng)提供能量(Kikawadaetal., 2007)。此外，有14個(gè)Unigenes被注釋為水通道蛋白，參與體內(nèi)滲透壓的調(diào)節(jié)，其表達(dá)量與抗凍能力具有相關(guān)性(Philipetal., 2008)；有14個(gè)Unigenes被注釋為超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)，這與耐寒昆蟲(chóng)準(zhǔn)噶爾小胸鱉甲Microderapunctipennis在環(huán)境脅迫適應(yīng)中SOD基因的表達(dá)相一致(Luetal., 2014)。阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)棲息的低溫高海拔環(huán)境，全年僅6-8月土壤層的日平均溫度可達(dá)到10℃以上，凍土期還限制了幼蟲(chóng)的取食和運(yùn)動(dòng)。因此，這些Unigenes在野外采集的蝠蛾幼蟲(chóng)中表達(dá)，表明低溫下的代謝補(bǔ)償可能是其適應(yīng)寒冷環(huán)境的重要策略。阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)在環(huán)境變化過(guò)程中通過(guò)控制體內(nèi)小分子運(yùn)輸，來(lái)降低應(yīng)激條件下細(xì)胞內(nèi)滲透壓對(duì)刺激的反應(yīng)能力，有助于闡明阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)對(duì)低溫的響應(yīng)與應(yīng)激代謝調(diào)節(jié)之間的相互關(guān)系。

溫度是影響阿爾泰蝠蛾物種分布的重要因子，也是生態(tài)學(xué)研究的關(guān)鍵因素之一。生活于低溫高海拔地區(qū)的阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)，如何適應(yīng)低溫環(huán)境是一個(gè)值得探究的問(wèn)題。本研究獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和分析結(jié)果，有助于快速發(fā)現(xiàn)阿爾泰蝠蛾廣泛多樣的候選基因，為進(jìn)一步研究蝠蛾幼蟲(chóng)所棲居的獨(dú)特生境下，冷適應(yīng)相關(guān)機(jī)制和代謝平衡的調(diào)節(jié)提供分子水平依據(jù)，同時(shí)也豐富了鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)的基因數(shù)據(jù)庫(kù)。另外，不同昆蟲(chóng)參與冷適應(yīng)相關(guān)的代謝調(diào)節(jié)基因的數(shù)目和種類(lèi)也有所不同，被注釋的這些基因的組織表達(dá)特異性和功能還需進(jìn)一步分析驗(yàn)證。