Alamandine通過結(jié)合MrgD受體促進(jìn)大鼠皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化

吳曉光，楊傳熙，張 晶，趙 錕，孫 偉，孔祥清*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 南京210029；2同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海200090

肥胖是全球范圍內(nèi)的一種健康問題，能引起多種疾病，如代謝綜合征（高血脂、高三酰甘油血癥和2型糖尿病等）、心血管疾病、慢性炎性反應(yīng)和腫瘤等，嚴(yán)重威脅人類健康［1］。大鼠脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cell，ADSC）具有很強(qiáng)的增殖潛能，同時(shí)能夠定向分化為成骨細(xì)胞、肌源性細(xì)胞和脂肪細(xì)胞［2］。成熟脂肪細(xì)胞的形成有兩個(gè)關(guān)鍵步驟，即成熟期和終末分化期。ADSC在成熟期中被誘導(dǎo)成前脂肪細(xì)胞，在終末分化期定向分化為脂肪細(xì)胞［3］。脂肪分化過程受到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如過氧化物增殖激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBPα）和脂蛋白脂肪酶等［3］。除此之外，由于成脂分化伴隨脂肪生成，所以負(fù)責(zé)脂肪生成的酶，例如脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）和乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）也被認(rèn)為是脂肪生成的重要標(biāo)志。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）是體內(nèi)非常重要的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定系統(tǒng)。RAS在體內(nèi)分布非常廣泛，不僅存在于循環(huán)系統(tǒng)中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血管壁、腎臟、腎上腺等也有廣泛分布［4］。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是RAS中的主要活性物質(zhì)，是前體物質(zhì)血管緊張素原在腎素作用下轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ（angiotensinⅠ，AngⅠ），再由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin onverting enzyme，ACE）催化生成。AngⅡ可以在胞外血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）作用下轉(zhuǎn)化成血管緊張素1-7［angiotensin（1-7），Ang（1-7）］，通過與Mas受體（一種G蛋白偶聯(lián)受體）的相互作用，Ang（1-7）通常拮抗AngⅡ的作用［5］。Ang（1-7）可以脫羧成一種叫Alamandine的肽。有趣的是，Alamandine被發(fā)現(xiàn)是Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體D（mas associated G protein coupled receptor D，MrgD）的內(nèi)源性配體［6］。RAS同樣也是能量代謝的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，在代謝紊亂如肥胖和胰島素抵抗中起作用［7］。脂肪組織是一種高度活躍的代謝和內(nèi)分泌器官，是RAS成分的來源之一。另一方面，AngⅡ受體和Mas受體在脂肪細(xì)胞共表達(dá)，意味著局部RAS系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞功能［8］。

已有研究表明，在人和小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中，Ang（1-7）-Mas信號通過激活PI3K/Akt和抑制MAPK激酶/ERK途徑促進(jìn)脂肪生成，Ang（1-7）-Mas是通過抑制AngⅠ-AT1觸發(fā)的MAPK激酶/ERK途徑拮抗AngⅠ-AT1的抗脂肪生成作用［9］。AngⅠ/AT1-ACE2-Ang（1-7）/Mas軸對脂肪形成的自分泌調(diào)節(jié)也已被揭示，表明了局部調(diào)節(jié)微妙平衡的RAS對脂肪形成的重要性及其作為肥胖癥和相關(guān)代謝紊亂的新治療靶點(diǎn)的潛力［8］。然而Alamandine對于脂肪生成的效應(yīng)尚且未知。因此，闡明Alamandine在ADSC成脂分化過程中的分子機(jī)制可能為肥胖癥等代謝性疾病的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM高糖培養(yǎng)基、間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基（MSCM）（Gibco公司，美國），間充質(zhì)干細(xì)胞-脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基（MADM，Scien Cell公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum FBS）、青霉素、鏈霉素（Biological Industries公司，以色列），膠原酶1型（上海Biosharp公司），油紅O、甘油三酯檢測試劑盒、總膽固醇檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液（上海碧云天），PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司），BSA（ICN生物醫(yī)學(xué)化學(xué)藥品公司，美國），辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋公司），β-actin抗體、ACC抗體、C/EBP-α抗體、PPAR-γ抗體、FAS抗體（Cell Signaling Technology公司，美國），Alamandine（上海Phoenix Pharmaceuticals公司），AngⅡ（Sigma公司，美國），Dpro7（Bachem公司，瑞士）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮下間充質(zhì)脂肪干細(xì)胞提取和培養(yǎng)

取6～8周Sprague-Dawley（SD）大鼠腹股溝皮下脂肪，用含雙抗的PBS緩沖液沖洗3次，去除脂肪組織中可見的血管和結(jié)締組織，將脂肪組織剪成1 mm3碎塊。加入適量膠原酶消化液（1 mg/mLⅠ型膠原酶，1%BSA）。37℃恒溫?fù)u床充分消化30 min，完全培養(yǎng)基（DMEM，10%FBS）終止消化。100目分子篩過濾，1 000 r/min離心10 min，去除懸浮的脂肪細(xì)胞和脂滴。PBS洗滌離心2次，用MSCM（含5%FBS）重懸。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按5×107個(gè)/L的濃度將細(xì)胞接種到60 mm培養(yǎng)皿中，標(biāo)記為F0代。在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，24 h后用預(yù)溫的PBS洗2次，加入3 mL完全MSCM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，以去除懸浮細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長匯合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取F2代細(xì)胞，開始用MADM（5%FBS，5%間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化生長因子，1%青霉素/鏈霉素）培養(yǎng)（定義為day1）。以后每2 d換1次培養(yǎng)基。

1.2.2 ADSC干預(yù)

取F2代ADSC，PBS沖洗，加無血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓12 h。進(jìn)行隨機(jī)分組：Alamandine不同濃度組（0、0.1、1.0、10.0 μmol/L），Western blot檢測ADSC中ACC、FAS、PPAR-γ、CEBP-α蛋白表達(dá)水平，油紅O染色、光鏡觀察脂肪細(xì)胞分化情況和細(xì)胞內(nèi)甘油三酯、總膽固醇測定，根據(jù)得出的Alamandine最適濃度進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：Alamandine不同處理時(shí)間組：向無血清培養(yǎng)基中添加/不添加10 μmol/L Alamandine分別處理ADSCs 1、3、6、10 d；Sham組：無血清培養(yǎng)基；Alamandine組：含10 μmol/L Alamandine的無血清培養(yǎng)基；AngⅡ組：含1 μmol/L AngⅡ的無血清培養(yǎng)基；AngⅡ+Alamandine組：含1 μmol/L AngⅡ和10 μmol/L Alamandine的無血清培養(yǎng)基；Alamandine+D-pro7組：含10 μmol/L Alamandine和10 μmol/L D-pro7的無血清培養(yǎng)基；AngⅡ+Alamandine+Dpro7組：含1 μmol/L AngⅡ和10 μmol/L Alamandine，10 μmol/L D-pro7的無血清培養(yǎng)基。以上實(shí)驗(yàn)各重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot

細(xì)胞用預(yù)冷的PBS清洗2遍，加入適量新制的磷酸酶/蛋白酶抑制劑與RIPA蛋白裂解液的混合物，刮除細(xì)胞置于冰上充分裂解30 min，4℃離心20 min，收集上清，檢測蛋白含量。蛋白定量后加入上樣緩沖液100℃水浴變性。蛋白等量上樣，經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在含5%BSA的TBST封閉2 h后，一抗（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。TBST洗滌條帶3次后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗常溫孵育2 h。再次洗滌3～4次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行蛋白顯影。

1.2.4 油紅O染色

4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS洗滌3次，加入過濾后的油紅O染料（1.8 mg/mL油紅O和60%（V/V）溶于雙蒸水的異丙醇）染色60 min。雙蒸水洗滌3次后，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)甘油三酯、總膽固醇測定

細(xì)胞甘油三酯含量測定采用脂肪細(xì)胞分化檢測試劑盒，在大鼠ADSC分化10～12 d后，細(xì)胞用PBS重復(fù)洗2次，刮除，超聲處理以使懸浮液均勻化，測定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇含量。用蛋白試劑盒測定這些細(xì)胞的總蛋白濃度，作為內(nèi)部對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以均值依標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用軟件Graphpad prism 7繪制圖表。數(shù)據(jù)處理時(shí)，計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Alamandine對大鼠ADSC有促成脂分化效應(yīng)且成劑量依賴性

ADSC向成熟脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化需要多種轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同調(diào)節(jié)。其中，PPAR-γ被認(rèn)為是最基本的轉(zhuǎn)錄因子。在誘導(dǎo)分化10～12 d后，許多成纖維細(xì)胞樣紡錘形大鼠ADSC分化成為成熟的脂肪細(xì)胞，光鏡下可以看到成熟脂肪細(xì)胞成球形且胞質(zhì)內(nèi)有脂滴積聚（圖1A），且隨著Alamandine劑量的增加，脂肪細(xì)胞的數(shù)量也在增加。脂質(zhì)積聚是脂肪形成程度的一個(gè)指標(biāo)，可通過脂滴的油紅O染色進(jìn)行評估，還可通過直接測量細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇含量進(jìn)行定量評估。在分化過程中外源性施用Alamandine顯著增加了脂肪細(xì)胞的比例（圖1B），以及胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇含量，與Sham組相比，隨著Alamandine濃度的升高，總膽固醇以及甘油三酯水平也在升高，其中10 μmol/L Alamandine處理組的總膽固醇以及甘油三酯水平最高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，P＜0.05，圖1C）。同樣，Alamandine增加了脂肪細(xì)胞生成標(biāo)志物PPAR-γ、CEBP-ɑ、FAS、ACC的表達(dá)（圖1D、E），與Sham組相比，10 μmol/L Alamandine處理組在4種成脂分化相關(guān)蛋白檢測上的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，n=3），故選用10 μmol/L Alamandine作為最適濃度。

圖1 Alamandine對大鼠ADSC有促成脂分化效應(yīng)且成劑量依賴性Figure 1 Alamandine can promote lipid differentiation in a dose-dependent manner in ADSC

2.2 Alamandine促進(jìn)大鼠ADSC成脂分化且成時(shí)間依賴性

選取10 μmol/L濃度的Alamandine作用于大鼠ADSC，與空白對照一起，在第1、3、6、10天測定成脂分化程度。經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照相比，誘導(dǎo)第1、3天的ADSC脂肪細(xì)胞生成標(biāo)志物PPAR-γ、C/EBP-ɑ、FAS、ACC表達(dá)略有升高，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n=3），誘導(dǎo)第6、10天的脂肪細(xì)胞生成標(biāo)志物表達(dá)水平相比空白對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，n=3），且誘導(dǎo)第10天脂肪細(xì)胞生成標(biāo)志物水平最高（圖2A、B）。倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)脂滴含量同樣隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長而增加（圖2C）。

圖2 Alamandine促進(jìn)大鼠ADSC成脂分化且成時(shí)間依賴性Figure 2 Alamandine promoted adipogenic differentiation of ADSCs in a time-dependent manner

2.3 AngⅡ拮抗了Alamandine對大鼠ADSC的成脂分化效應(yīng)

之前有研究表明，AngⅡ?qū)θ说闹鹃g充質(zhì)干細(xì)胞有抑制成脂分化的效應(yīng)，而在大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上則沒得到驗(yàn)證。正如預(yù)期的那樣，在加入AngⅡ后，大鼠ADSC成脂分化效應(yīng)減弱，AngⅡ組相較于Sham組，成脂分化相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇水平同樣降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，n=3，圖3A～C）。光鏡及油紅O染色觀察脂肪細(xì)胞分化情況，（圖3D、E），同樣發(fā)現(xiàn)AngⅡ抑制成脂分化。可以得出AngⅡ是通過作用于ADSC的AT1受體達(dá)到抑制成脂分化的效應(yīng)［5］。有趣的是，在AngⅡ和Alamandine共處理大鼠ADSC后，AngⅡ減弱了Alamandine對大鼠ADSC的促成脂分化效應(yīng)。

圖3 AngⅡ拮抗Alamandine對大鼠ADSC的成脂分化Figure 3 AngⅡantagonism Alamandine for differentiation of ADSC into fat effect in rats

2.4 Alamandine通過作用于大鼠ADSC MrgD受體達(dá)到促成脂分化效應(yīng)

為了驗(yàn)證Alamandine是否通過作用于大鼠ADSC的MrgD受體達(dá)到促成脂分化的效應(yīng)，應(yīng)用了MrgD受體拮抗劑D-pro7。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，Alamandine+D-pro7組相較于Alamandine組，脂肪細(xì)胞生成標(biāo)志物CEBP-α、PPAR-γ、ACC、FAS表達(dá)水平明顯降低（圖4A、B），總膽固醇和甘油三酯含量也明顯降低（圖4C），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，n=3），油紅O染色和光鏡觀察提示脂肪細(xì)胞數(shù)量也顯著減少（圖4D、E）。綜上，Alamandine是通過作用于MrgD來起到促進(jìn)成脂分化的作用。AngⅡ+Alamandine+Dpro7組與AngⅡ+Alamandine相比脂肪細(xì)胞生成標(biāo)志物水平以及甘油三酯，總膽固醇水平均明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0，05，n=3），提示D-pro7與AngⅡ具有協(xié)同效應(yīng)，均能抑制成脂分化。

圖4 Alamandine通過作用于大鼠ADSC MrgD受體促進(jìn)成脂分化Figure 4 Alamandine promotes lipid differentiation by acting on the MrgD receptor of ADSC in rat

3 討論

脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞是一類易于獲得、增殖和分化能力強(qiáng)大的成體間充質(zhì)干細(xì)胞［10］。肥胖是全球發(fā)病率非常高的疾病，會誘發(fā)心血管疾病、高血壓、糖尿病和腫瘤等多種疾?。?1］。目前認(rèn)為，肥胖是白色脂肪細(xì)胞肥大，增生和脂肪形成共同作用的結(jié)果。脂肪組織內(nèi)的ADSC是體內(nèi)新生脂肪細(xì)胞的重要來源。因此，ADSC過度的成脂分化被認(rèn)為是導(dǎo)致肥胖的重要原因［12］。

RAS是控制身體電解質(zhì)和血壓平衡穩(wěn)態(tài)的激素回路［13］。AngⅡ是這個(gè)激素回路中的核心物質(zhì)，在成人組織中，AngⅡ的主要靶點(diǎn)是1型受體（AT1），由多種細(xì)胞表達(dá)，包括內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，AngⅡ以AT1依賴的方式引起炎癥和纖維化［14］。而Ang（1-7）和Alamandine作為一種有益的系統(tǒng)，它們分別與Mas和MrgD受體相互作用，對抗AngⅡ/AT1軸的有害影響［15］。局部組織產(chǎn)生的血管緊張素原和它的加工酶存在于腎臟、大腦、心臟、胰腺和脂肪組織等多個(gè)器官中［16］。實(shí)驗(yàn)研究表明，在脂肪組織中表達(dá)的RAS與脂肪細(xì)胞形成的調(diào)節(jié)有關(guān)，且AngⅡ?qū)χ拘纬善鸬截?fù)性調(diào)節(jié)的作用［17］。

MrgD受體主要表達(dá)于背根神經(jīng)節(jié)和感覺神經(jīng)節(jié)，在小腦、棕色脂肪、白色脂肪和胃腸道中有少量表達(dá)［5］，MrgD受體最初被發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)疼痛有關(guān)，除了與鈣釋放和磷酸激酶A激活有關(guān)外，MrgD信號轉(zhuǎn)導(dǎo)尚不清楚［18］。既往研究發(fā)現(xiàn)，Ang（1-7）對ADSC有促進(jìn)成脂分化的作用［8］。而Alamandine是Ang（1-7）脫羧形成的多肽，盡管二者結(jié)構(gòu)相似，但是卻作用于不同的受體，Ang（1-7）作用于Mas受體，而Alamandine作用于MrgD受體。Alamandine一般與AngⅡ相拮抗，發(fā)揮保護(hù)性作用。例如Alamandine通過MrgD，抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大［19］，以及Alamandine通過MrgD受體保護(hù)心臟免受再灌注損傷［20］。研究表明，Mas敲除小鼠在阻斷AT1受體后引起的抗肥胖效應(yīng)更顯著［21］，但是Alamandine對于ADSC的成脂分化的影響卻尚未給予太多關(guān)注，本文首次闡明Alamandine對大鼠脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，Alamandine這種Ang（1-7）脫羧形成的新型肽，能夠顯著促進(jìn)大鼠皮下ADSC成脂分化，成脂分化相關(guān)蛋白標(biāo)志物水平增加呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性，細(xì)胞內(nèi)脂滴含量、甘油三酯以及膽固醇水平同樣在Alamandine誘導(dǎo)后增加，而AngⅡ抑制了大鼠ADSC的成脂分化。為了繼續(xù)探究Alamandine促進(jìn)大鼠ADSC成脂分化的機(jī)制，在運(yùn)用Alamandine的作用受體——MrgD受體的拮抗劑D-Pro7后，Alamandine促進(jìn)ADSC成脂分化效應(yīng)被顯著減弱，證實(shí)了Alamandine是通過作用于MrgD受體來發(fā)揮成脂分化效應(yīng)的。但尚未在動物水平上繼續(xù)驗(yàn)證Alamandine對成脂分化或是肥胖的影響，需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Alamandine能夠促進(jìn)大鼠ADSC的成脂分化，其機(jī)制與其受體MrgD的相互作用有關(guān)。這項(xiàng)研究結(jié)果的啟示性在于，抑制脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞MrgD受體的表達(dá)可能為肥胖癥的治療提供一些新的思路。