菊狀千里光化學(xué)成分及抗真菌活性研究

謝小燕，王睿睿，鄒秋萍，蘇劉艷，李艷平，何紅平

云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，昆明 650500

菊狀千里光(SeneciolaetusEdgew.)為菊科(Compositae)千里光屬多年生草本植物[1]，多生于海拔1 100～3 750m的田邊、路邊和林下，主要分布于重慶、西藏、湖北、云貴等地。因其具有活血，消腫，祛風(fēng)，除濕等功效，長久以來，民間常用菊狀千里光來治療肝炎、跌打損傷、瘀積腫痛、乳癰和瘡癰腫瘍等疾病[2,3]。近年的藥理學(xué)研究也表明[4-9]菊狀千里光具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性。千里光屬植物具有豐富的次生代謝產(chǎn)物，包括生物堿類化合物、黃酮類化合物、萜類化合物、酚酸類化合物和香豆素類化合物等[2]。其主要成分為吡咯里西啶類生物堿(PAs)和倍半萜類化合物，其中大部分的倍半萜類化合物具有抗炎、抗細(xì)菌、抗結(jié)核以及抗真菌感染活性，而吡咯里西啶類生物堿常具有肝毒性[10]。對(duì)菊狀千里光全草進(jìn)行了化學(xué)成分研究[11-13]，從中分離得到27個(gè)化合物，包括3個(gè)生物堿、4個(gè)甾醇類、5個(gè)酚酸類、9個(gè)黃酮類、4個(gè)有機(jī)酸類化合物等。目前對(duì)這類植物的化學(xué)成分研究報(bào)道較少，對(duì)菊狀千里光活性的研究主要集中于揮發(fā)油成分和功能性評(píng)價(jià)，對(duì)其中可能具有肝毒性的生物堿類成分和其他活性成分的研究較少。為進(jìn)一步闡明菊狀千里光的化學(xué)成分，明確其活性和毒性成分，我們對(duì)采自云南省德宏州的菊狀千里光植物進(jìn)行化學(xué)成分研究。此外，我們還評(píng)價(jià)了部分化合物的抗真菌活性和對(duì)肝細(xì)胞毒性，以期為菊狀千里光植物藥用資源的合理安全性開發(fā)利用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

PrecisaXS125A分析天平(瑞士普利賽斯公司)；ZF8三用紫外分析儀(上?？等A生化儀器制造廠)；BUCHIRotavaporR-205 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪有限公司)；AS2005 中壓制備液相儀(江蘇漢邦科技有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；PH050 型干燥箱(上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；BUCHI Heating BachB-490 型電熱恒溫水浴鍋(瑞士步琪有限公司)；Bruker AM-400核磁共振儀(瑞士Bruker公司)。薄層色譜及柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠)；MCI Gel CHP-20P為日本三菱化工；羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20凝膠)為Pharmacia公司進(jìn)口分裝；十八烷基鍵合硅膠(Rp-18)為日本富士硅化工產(chǎn)品。所有試劑均為分析純。氟康唑(南昌弘益藥業(yè)有限公司，50 mg，171128)；DMSO溶劑(MP Biomedicals，LLC，100 mL，Q6949)；沙氏液體培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，250 g，1069251)；念珠菌臨床耐藥株23#(由昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院李玉葉教授贈(zèng)送)按常規(guī)方法復(fù)蘇，劃板培養(yǎng)于4 ℃下保存。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation)；酶標(biāo)儀(M200 PRO 多功能酶標(biāo)儀)；臺(tái)式離心機(jī)(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠)；水處理超濾器(Millipore公司)；熒光倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；正常人肝L-02細(xì)胞(購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所)；胎牛血清(Hyclone)；RPMI-1640(美國Gibco Invitrogen公司)；胰蛋白酶(美國Amresco公司)；沙堡氏液體培養(yǎng)基。所有試劑均為分析純。

植物樣品菊狀千里光全草(曬干)15 kg于2016年9月采于德宏州盈江縣銅壁關(guān)鄉(xiāng)茶山寨。經(jīng)昆明植物研究所劉思德鑒定為菊狀千里光，標(biāo)本(標(biāo)本號(hào)：201609)保存于云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 提取與分離

菊狀千里光干燥全草15 kg，粉碎(80目)后用80%乙醇室溫下浸提4次，每次24 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏4.3 kg。用2.5% HCl調(diào)pH=2，得濾液和沉淀(A)836 g。濾液經(jīng)氯仿萃取，得氯仿部分(B)80 g。水相用NaOH調(diào)pH=10后，分別用氯仿和正丁醇萃取得到氯仿部分(C)33 g和正丁醇部分(D)2.0 kg。A部分(836 g)經(jīng)MCI色譜，用甲醇-水(3∶7→9∶1)梯度洗脫，得到A1～A4部分。A1(5.8 g)用硅膠柱層析(氯仿-甲醇，20∶1→1∶1)分離，然后用Sephadex LH-20柱層析(氯仿-甲醇，1∶1)純化，得到9(10.0 mg)和11(14.2 mg)。通過對(duì)組分A2(3g)經(jīng)硅膠(氯仿-丙酮，40∶1→1∶1)和Sephadex LH-20柱層析(氯仿-甲醇，1∶1)得到化合物10(4.9 mg)。A3(5.8 g)采用硅膠柱以石油醚-丙酮(15∶1、10∶1、5∶1、1∶1)洗脫，通過薄層色譜點(diǎn)板合并得到A3-1～A3-3。A3-2以制備型高效液相進(jìn)行分離純化，選擇較適合A3-2的HPLC分離條件是：色譜柱Zorbax SB-C18(250 mm×9.4 mm，5 μm)；檢測(cè)波長：210 nm；流動(dòng)相：甲醇-水(40∶60，V/V)；流速：3 mL/min等度洗脫，得到4(6.8 mg，tR=16.8 min)和5(5.1 mg，tR= 21.6 min)。B部分先采用硅膠柱層析以氯仿-甲醇(25∶1→1∶1)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，從氯仿-甲醇(15∶1)洗脫部位得到化合物6(6.0 mg)。C部分(30 g)用硅膠柱以氯仿-丙酮(35∶1、25∶1、15∶1、8∶1、3∶1)進(jìn)行梯度洗脫，得到C1～C5部分?；衔?(11.8 mg)和8(9.7 mg)從C3-1中通過重復(fù)硅膠柱色譜氯仿-甲醇(40∶1→10∶1)獲得。D部分用D101以水和30%、60%、90%和100%的甲醇進(jìn)行洗脫得到D1～D4，其中D2(5.7 g)經(jīng)RP-18色譜，用甲醇-水(20%→90%)洗脫，然后用Sephadex LH-20色譜(氯仿-甲醇，1∶1)純化，得到1(4.5 mg)和2(7.1 mg)。組分D3在硅膠上用石油醚-丙酮(10∶1)和甲醇(45%→70%，3 mL/min)進(jìn)行色譜分析后得到化合物3(11.5 mg)，其中液相分析制備條件：色譜柱Zorbax SB-C18(250 mm×9.4 mm，5 μm)；檢測(cè)波長：210 nm；流動(dòng)相：甲醇-水(45∶55，V/V)；流速：3 mL/min等度洗脫。

1.3 抑菌實(shí)驗(yàn)方法

取96孔板，將陽性藥物氟康唑稀釋為初濃度1 mg/mL，待測(cè)化合物樣品用沙氏液體培養(yǎng)基稀釋為1 mg/mL的加載液，檢測(cè)聯(lián)合用藥時(shí)，濃度加倍，體積減半，然后進(jìn)行5倍倍比稀釋，共設(shè)置6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各孔加入測(cè)試真菌懸液，其中白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株濃度為1×105CFU/mL，白色念珠菌耐藥株濃度為1× 105CFU/mL，于37 ℃培養(yǎng)24 h。酶標(biāo)儀測(cè)定625 nm下的OD值。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置培養(yǎng)基對(duì)空白對(duì)照、菌液對(duì)照以及氟康唑陽性藥物對(duì)照。

真菌活性抑制率=(1-樣品OD值/

實(shí)驗(yàn)對(duì)照孔OD值)×100%

(1)

聯(lián)合指數(shù)(FICI)=ECA/A+ECB/B

(2)

公式(2)中A和B分別為兩藥單用時(shí)的EC50值，ECA和ECB分別為兩藥聯(lián)合時(shí)的EC50值。當(dāng)EC值高于檢測(cè)最高限時(shí)以做高限濃度的兩倍值用以計(jì)算FICI。本實(shí)驗(yàn)中EC50值的計(jì)算以氟康唑的最小真菌生長50%時(shí)的抑制百分?jǐn)?shù)來計(jì)算。當(dāng)FICI≤0.5時(shí)，表示兩藥的作用方式為協(xié)同；當(dāng)0.54時(shí)，表示兩藥的作用方式為拮抗。

1.4 細(xì)胞存活率測(cè)定

人正常肝細(xì)胞株L-02，于37 ℃水浴復(fù)蘇。用含10% FBS(胎牛血清)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取培養(yǎng)第3代的對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，以2×104/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后給予分離得到的生物堿化合物樣品，培養(yǎng)24 h后用MTT法于570 nm波長測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞的存活率以評(píng)價(jià)生物堿的毒性。

細(xì)胞存活率=(給藥組平均OD值/

正常對(duì)照組平均OD值)×100%

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色無定型粉末;(+)ESI-MS：m/z382 [M+H]+，HR-ESI-MS(m/z382.186 4 [M+H]+，calcd for C19H28NO7，382.186 6)，確定分子式C19H27NO7，不飽和度為7。1H NMR圖譜表明分子中存在4個(gè)甲基信號(hào)[δH2.33(3H，s)，1.36(3H，s)，0.95(3H，s)，1.25(3H，d，J=4 Hz)]和4個(gè)次甲基信號(hào)，其中包括1個(gè)連氧次甲基信號(hào)為[δH3.05(1H，s)]，1個(gè)端基碳的次甲基信號(hào)為[δH6.20(1H，br s)]。13C NMR和DEPT譜圖顯示19個(gè)碳原子，包括4個(gè)甲基(1個(gè)連氮的甲基)，5個(gè)亞甲基，4個(gè)次甲基和6個(gè)季碳。化合物的1H NMR、13C NMR和DEPT譜顯示該化合物有2個(gè)羰基信號(hào)[δC178.3(s)，170.4(s)]，1個(gè)雙鍵碳信號(hào)[δH6.20(1H，br s)；δC136.7，135.2]，1個(gè)連氮的甲基信號(hào)為[δH2.33(3H，s)；δC43.3]和一個(gè)連氧季碳信號(hào)[δC160.1](見表1)。結(jié)合上述數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)化合物1與已知化合物ligularizine[14]的非常相近，最大的不同在于它們的C-12位取代基和C-8位取代基不同，表現(xiàn)在譜圖中化合物1的C-12為羥基取代，而C-8位同時(shí)連接氮原子和氧負(fù)離子，表現(xiàn)為化學(xué)位移值在δC160.1。以上波譜數(shù)據(jù)結(jié)合HSQC、HMBC、1H-1H COSY譜確定化合物1為othosenzhe?；衔?的相對(duì)構(gòu)型通過ROESY 相關(guān)譜及與文獻(xiàn)報(bào)道核磁數(shù)據(jù)比對(duì)來確定。從ROESY譜中H-4與H-18、H-19及H-21的相關(guān)，表明H-4、H-18、H-19、H-21為β構(gòu)型；C19-OH為α構(gòu)型。故化合物1鑒定為othosenine(結(jié)構(gòu)見圖1)。

表1 化合物1在CD3OD中的1H(400 MHz)和13C(100 MHz)NMR數(shù)據(jù)

圖1 化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵相關(guān)Fig.1 Structure and key correlations of compound 1

化合物2白色粉末狀結(jié)晶(甲醇);1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：6.52 (1H，s，H-6′)，6.52(1H，s，H-2′)，4.83(1H，d，J= 7.3 Hz，H-1″)，3.74(6H，s，3′/5′-OCH3)，3.58(1H，m，H-1a)，3.67(1H，m，H-1b)，3.58(1H，m，H-3a)，3.67(1H，m，H-3b)，3.41(1H，dd，J=11.5，5.7 Hz，H-6″a)，3.61(1H，dd，J=11.5，21 Hz，H-6″b)，3.19(1H，m，H-3″)，3.19(1H，m，H-5″)，3.15(1H，m，H-4″)，3.03(1H，m，H-3″)，2.71(1H，m，H-2)；13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：152.2(C-3′)，152.2(C-5′)，137.9

(C-1′)，133.2(C-4′)，106.7(C-2′，6′)，103.0(C-1″)，77.1(C-3″)，76.5(C-5″)，74.2(C-2″)，69.9(C-4″)，62.7(C-1，3)，60.9(C-6″)，56.4(3′/5′-OCH3)，50.7(C-2)。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故化合物2鑒定為2-(4-O-β-D-glucopyranosyl) syringylpropane-1,3-diol。

化合物3白色粉末狀結(jié)晶(甲醇);1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：6.65(4H，s，H-2，2′，6，6′)，4.96(2H，d，J= 12.0 Hz，H-1″，1″′)，3.74(12H，s，3，5，3′，5′-OCH3)，3.60(2H，dd，J= 3.4，1.8 Hz，Hb-6″，6″′)，3.53(2H，dd，J= 3.4，0.9 Hz，Ha-6″，6″′)，3.41(2H，m，H-4″，4″′)，3.40(2H，m,H-2″，2″′)，3.37(2H，m，H-3″，3″′)，3.15(2H，m，H-5″，5″′)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：152.9(C-3，3′，5，5′)，137.6(C-1，1′)，133.9(C-4，4′)，104.7(C-2，2′，6，6′)，103.1(C-1″，1″′)，85.5(C-7，7′)，77.7(C-5″，5″′)，77.0(C-3″，3″′)，74.6(C-2″，2″′)，71.8(C-9，9′)，70.2(C-4″，4″′)，61.0(C-6″，6″′)，55.8(3，5，3′,5′-OCH3)，54.1(C-8，8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故化合物3鑒定為刺五加苷E。

化合物4白色無定型粉末;1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：6.72(2H，s，H-3，5)，6.45(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，6.35(1H，dt，J=16.0，5.5 Hz，H-8)，4.10(2H，d，J=5.5 Hz，H-9)，3.77(6H，s，2，6-OCH3)，4.75(1H，s，H-1′)，3.74(1H，dd，J=11.2，1.8 Hz，H-6′a)，3.58(1H，dd，J=11.2，5.0 Hz，H-6′b)，3.42(1H，t，J=8.0 Hz，H-2′)，3.40(2H，m，H-3′,4′)，3.18(1H，m，H-5′)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：153.2(C-2，6)，134.4(C-7)，133.1(C-1)，130.6(C-4)，128.9(C-8)，105.0(C-3，5)，103.8(C-1′)，77.7(C-5′)，77.1(C-3′)，74.6(C-2′)，70.4(C-4′)，61.9 (C-9)，61.5(C-6′)，56.8(OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故化合物4鑒定為紫丁香苷。

化合物5黃色粉末狀結(jié)晶(甲醇);1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：12.62(1H，s，5-OH)，8.03(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，7.50(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-6′)，6.90(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.45(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.21(1H，J=2.0 Hz，H-6)，5.50(1H，d，J=7.7 Hz，galactose-1″)，3.85(3H，s，3′-OCH3)，3.35-3.61(6H，m，galactose)；13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ：177.9(C-4)，164.6(C-7)，161.7(C-5)，156.8(C-2)，156.3(C-9)，149.9(C-3′)，147.5(C-4′)，133.6(C-3)，122.3(C-6′)，121.5(C-1′)，115.6(C-5′)，114.0(C-2′)，104.5(C-10)，102.1(C-1″)， 99.2(C-6)，94.2(C-8)，76.3(C-5″)，73.4(C-3″)，71.1(C-2″)，68.3(C-4″)，60.9 (C-6″)，56.4(OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故化合物5鑒定為異鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷。

化合物6黃色粉末狀結(jié)晶(甲醇);1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：12.64(1H，s，5-OH)，10.86(1H，s，7-OH)，9.70(1H，s，4′-OH)，9.34(1H，s，3′-OH)，7.30(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，7.27(1H，dd，J=8.1，2.0 Hz，H-6′)，6.86(1H，d，J=8.1 Hz，H-5′)，6.37(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.23(1H，d，J= 1.4 Hz，Rha-H″-1)，0.83(3H，d，J=5.8 Hz，Rha-H″-6)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：177.9(C-4)，164.6(C-7)，161.8(C-5)，156.8(C-2)，156.7(C-9)，148.9(C-4′)，145.3(C-3′)，133.6(C-3)，122.4(C-6′)，121.6(C-1′)，116.4(C-5′)， 115.6(C-2′)，104.4(C-10)，102.3(C-1″)，99.1(C-6)，94.0(C-8)，71.7(C-4″)，71.0(C-3″)，70.5(C-5″)，70.2(C- 2″)，17.9(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故化合物6鑒定為槲皮素-3-O-β-D-鼠李糖苷。

化合物7白色粉末狀結(jié)晶(氯仿);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：5.34(1H，d，J=5.0 Hz，H-6)，5.16(1H，dd，J=8.6，24 Hz，H-22)，5.01(1H，dd，J= 8.7，24 Hz，H-23)，3.52(1H，m)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：140.8(C-5)，138.3(C-23)，129.3(C-22)，121.7(C-6)，71.8(C-3)，56.9(C-14)，56.0(C-17)，51.2(C-24)，50.1(C-9)，42.3(C-13，4)，40.5(C-20)，39.7(C-12)，37.3(C-1)，36.5(C-10)，31.9(C-2，7，8，25)，28.9(C-16)，25.4(C-28)，24.4(C-15)，21.2(C-21)，21.1(C-11，26)，12.1(C-18，29)，19.4(C-19)，19.0(C-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故化合物7鑒定為Δ5,22-豆甾烯醇。

化合物8白色粉末(氯仿);1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ：6.11(1H，br s，H-2)，5.47(1H，d，J= 11.1 Hz，H-9a)，5.09(1H，br s，H-7)，4.33(1H，d，J=11.1 Hz，H-9b)，3.42(1H，br d，J=18.1 Hz，H-3a)，3.28(1H，br d，J= 18.1 Hz，H-3b)，2.98 (1H，q，J=5.4 Hz，H-20)，2.90(1H，m，H-5a)，2.61(2H，m，H-5b，6a)，2.22(1H，m，H-6b)，2.13(1H，d，J=14.4 Hz，H-14)，2.06(3H，s，N-Me)，1.91(1H，dq，J=6.6，11.0 Hz，H-13)，1.33(3H，s，Me-18)，1.23(3H，d，J=5.4 Hz，Me-21)，1.14(3H，d，J= 6.3 Hz，Me-19)；13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ：191.9(C-8)，177.8(C-11)，167.9(C-16)，137.2(C-2)，134.3(C-1)，78.4(C-7)，77.2(C-12)，64.3 (C-9)，63.7(C-15)，58.8(C-3)，56.0(C-20)，53.0(C-5)，40.0(N-Me)，38.5(C-13)，37.1(C-14)，35.6(C-6)，23.9(C-18)，13.5(C-21)，12.4(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物8為奧索千里光堿。

化合物9黃色粉末;1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：7.76(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2′)，7.69(1H，dd，J=8.5，2.1 Hz，H-6′)，6.94(1H，d，J=8.5 Hz，H-5′)，6.48(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，3.85(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：183.4(C-4)，164.8(C-7)，163.4(C-2)，161.5(C-5)，157.3(C-9)，149.4(C-4′)，146.9(C-3′)，121.9(C-1′)，121.6(C-6′)，115.2(C-5′)，113.2(C-2′)，104.2(C-3)，103.6(C-10)，99.0(C-6)，93.8(C-8)，59.8(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物9為異鼠李素。

化合物10淡黃色粉末;1H NMR((CD3)2CO，400 MHz)δ：12.16(1H，s，5-OH)，7.83(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，7.70(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-6′)，7.00(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5′)，6.53(1H，J=1.6 Hz，H-8)，6.27(1H，J=1.6 Hz，H-6)；13C NMR((CD3)2CO，100 MHz)δ：175.5(C-4)，164.1(C-7)，160.2(C-5)，156.8(C-9)，146.0(C-2)，144.9(C-3′)，122.8(C-1′)，120.5(C-6′)，115.2(C-2′)，147.3(C-4′)，114.8(C-5′)，102.4(C-10)，98.2(C-6)，93.5(C-8)，35.7(C-3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物10為槲皮素。

化合物11無色方晶;1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：7.50(1H，d，J= 16.0 Hz，H-7)，7.06(1H，d，J=1.6 Hz，H-2)，7.00(1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6)，6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.30(1H，d，J=16 Hz，H-8)，4.17(2H，q，J=7.0 Hz，H-OCH2CH3)，1.25(3H，t，J=7.0 Hz，H-OCH2CH3)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：167.0(C-9)，148.9(C-3)，146.1(C-4)，145.5(C-7)，126.6(C-6)，121.8(C-1)，116.2(C-2)，115.3(C-5)，114.5(C-4)，60.2(C-10)，14.7(C-11)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物11為咖啡酸乙酯。

2.2 化合物對(duì)白色念珠球菌的抑菌活性

結(jié)果表明，氟康唑?qū)Π咨钪榍蚓拿舾芯暌种苹钚燥@著，但對(duì)耐藥菌株無效。菊狀千里光中化合物單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)白色念珠菌敏感株和耐藥株均無抑制作用，然而，當(dāng)與氟康唑聯(lián)合使用時(shí)，化合物7對(duì)白色念珠菌敏感株有顯著的協(xié)同抑菌作用，其聯(lián)合指數(shù)FICI50分別為0.008 6，化合物1和8對(duì)白色念珠菌耐藥菌株有顯著的協(xié)同抑菌作用，其聯(lián)合指數(shù)FICI50分別為0.004 4和0.012 4，為極好的協(xié)同抑菌作用(見表2)。

表2 菊狀千里光中化合物與陽性對(duì)照對(duì)白色念珠菌的抑制活性表

2.3 菊狀千里光中兩個(gè)生物堿化合物的肝毒性評(píng)價(jià)

兩個(gè)生物堿(化合物1和8)對(duì)L-02細(xì)胞存活率影響的評(píng)價(jià)結(jié)果表明化合物1對(duì)細(xì)胞生長無明顯影響；化合物8有一定的促進(jìn)細(xì)胞生長作用(見表3)。以上結(jié)果表明在細(xì)胞水平兩個(gè)生物堿均無肝細(xì)胞毒性。

表3 菊狀千里光中生物堿對(duì)L-02細(xì)胞存活率影響

3 討論與結(jié)論

近年來，由于癌癥發(fā)病率升高，腫瘤患者的增加，放療、化療、免疫抑制劑等治療手段的應(yīng)用，使得臨床上嚴(yán)重真菌感染的病例不斷增加，在全球的念珠菌感染病例中，白色念珠菌(Candidaalbicans)是最為主要的感染病原菌之一，氟康唑作為抗真菌的一線藥物，對(duì)白色念珠球菌的敏感菌治療效果顯著，然而隨著真菌耐藥性的普遍產(chǎn)生，使得治療越發(fā)困難。因此尋找與現(xiàn)有抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)揮協(xié)同抗真菌作用的藥物是對(duì)抗耐藥真菌感染行之有效的方法之一。我們前期對(duì)云南道地藥材菊狀千里光揮發(fā)油進(jìn)行了抗真菌活性檢測(cè)和GC-MS化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)菊狀千里光揮發(fā)油具有極好地協(xié)同抑菌活性[18]。進(jìn)一步對(duì)菊狀千里光全草的乙醇提取物中得到的部分化合物及其抗真菌活性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)生物堿和兩個(gè)甾體類化合物與氟康唑聯(lián)用時(shí)表現(xiàn)出極好的協(xié)同抑菌作用。

千里光屬中草藥，我國約有160余種，其中藥用品種有10多種，早在一千多年前，《本草拾遺》中就有記載千里光“味苦，平，小毒”[19]，迄今為止，國內(nèi)外的一些文獻(xiàn)記載千里光屬中草藥可能含有不同程度的吡咯里啶生物堿(PAs)，這種生物堿被認(rèn)為對(duì)人及動(dòng)物的器官有一定致?lián)p傷的毒性，特別是對(duì)肝組織有明顯的肝毒性，可能引起肝細(xì)胞出血性壞死，肝巨細(xì)胞癥以及靜脈閉塞癥等。我們的研究從菊狀千里光的全草中分離得到了兩個(gè)吡咯里啶生物堿，但這兩個(gè)化合物對(duì)正常的肝細(xì)胞并未表現(xiàn)出毒性，也未見對(duì)這個(gè)吡咯里啶生物堿肝毒性的報(bào)道，然而作為云南民間常用藥材，菊狀千里光的用藥安全性仍需對(duì)其鮮品、干品以及不同藥用部位和不同給藥方式做進(jìn)一步的毒性評(píng)價(jià)。