蒲公英根多糖硫酸酯化工藝條件優(yōu)化及其對(duì)HepaRG細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

朱永紅，范震宇，韓 勇，吳雯儀，蔡亮亮*

1南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部；2南通大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科；3國(guó)藥控股南通有限公司，南通 226001

多糖的活性通常與糖單元的組成、分子量、糖苷鍵的類型、主鏈構(gòu)型、支鏈、空間構(gòu)型相關(guān)，結(jié)構(gòu)修飾后的多糖與原多糖相比，水溶性會(huì)明顯提高，有利于多糖活性的增強(qiáng)，有些甚至?xí)a(chǎn)生新的生物活性。磷酸化、硫酸酯化、羧甲基化和乙?；浅Ｓ玫亩嗵腔瘜W(xué)修飾方法，其中硫酸酯化多糖因其具有良好的生物活性，如抗凝血、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等[1-5]，引起越來越多研究人員的關(guān)注。多糖的硫酸酯化是指多糖分子鏈上的羥基被硫酸基團(tuán)取代而發(fā)生的反應(yīng)，反應(yīng)所得的產(chǎn)物又稱多糖硫酸酯[6]。多糖硫酸酯化常用的方法主要有氯磺酸-吡啶法、濃硫酸法、Nagasawa法等[7]。其中氯磺酸-吡啶法具有反應(yīng)試劑經(jīng)濟(jì)、反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、產(chǎn)物回收率高等優(yōu)點(diǎn)，因此常作為多糖硫酸酯化的方法。

蒲公英根為菊科植物蒲公英的干燥根，具有抗氧化、降血脂、保肝等多種藥理活性[8-10]。馬紅梅等的研究表明多糖是蒲公英根中含量最高的活性成分，其含量可達(dá)42.75%[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蒲公英根多糖具有較好的體外抗氧化活性，體現(xiàn)在對(duì)DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基均有較好的清除能力，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系[12]。但是我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)蒲公英根多糖水溶性不是很好，限制其發(fā)揮更好的藥效。文獻(xiàn)報(bào)道多糖硫酸酯化可以提高多糖的水溶性，增強(qiáng)其生物活性[13]。因此，作者考慮對(duì)蒲公英根多糖進(jìn)行硫酸酯化修飾。H2O2是一種常見的活性氧分子，可通過破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)，尤其是基因組與線粒體中的DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死[14]。由于H2O2能夠有效提高細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，模擬機(jī)體內(nèi)的氧自由基的損傷情況，因而常被用于建立體外細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的模型物質(zhì)[15]。因此，本研究擬采用H2O2造細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，考察硫酸酯化蒲公英根多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

綜上，本研究采用氯磺酸-吡啶法對(duì)蒲公英根多糖進(jìn)行硫酸酯化修飾，以取代度為指標(biāo)，用響應(yīng)曲面法對(duì)硫酸酯化的工藝進(jìn)行優(yōu)化，初步探討蒲公英根多糖及其硫酸酯對(duì)H2O2誘導(dǎo)致HepaRG細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，以期為蒲公英根多糖的開發(fā)利用提供有價(jià)值的參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HepaRG細(xì)胞(上海冠導(dǎo)生物科技有限公司)；蒲公英根(吉林省鼎祥參業(yè)有限公司)，蒲公英(吉林)。

1.2 試劑

MTT(批號(hào)：73020200812，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；吡啶(批號(hào)：20150416，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；二甲基亞砜(批號(hào)：20150818，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；氯磺酸(批號(hào)：C1276，山東西亞化學(xué)試劑有限公司)；二甲基甲酰胺(批號(hào)：20190424，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；酚酞(批號(hào)：20151222，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈉(批號(hào)：20181221，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；硫酸鉀(批號(hào)：20190507，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氯化鋇(批號(hào)：151015，西隴化工股份有限公司)；鹽酸(批號(hào)：150120044H，南京化學(xué)試劑有限公司)；1640培養(yǎng)基(批號(hào)：8121248，美國(guó)Gibco公司)；胰蛋白酶(批號(hào)：2186974，美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(批號(hào)：2177358，美國(guó)Gibco公司)。

1.3 儀器

H03-A數(shù)顯磁力攪拌器(上海梅穎浦)；HWS-24恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；IX53熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；TENSOR 27傅立葉變換紅外光譜儀(德國(guó)布魯克公司)；MK-3酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司)；Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蒲公英根多糖的制備

取蒲公英根適量，用蒸餾水洗凈，70 ℃下烘干，然后將干燥的蒲公英根磨成粉末。稱取一定量藥材粉末，用95%乙醇回流提取2次，每次2 h，趁熱抽濾，取濾渣，烘干備用；精密稱取濾渣約20 g，加入500 mL蒸餾水，回流提取2次，每次4 h，合并2次的提取液，離心(4 000 rpm)15 min，收集上清液，上清液減壓濃縮至適量體積，然后加入4倍體積的無水乙醇沉淀，4 ℃靜置過夜，Sevag法除蛋白，樣品溶液用透析袋(透析分子量3 500 Da)流水透析48 h，收集透析液并濃酸縮至適量體積，冷凍干燥得蒲公英根多糖。另取2份濾渣約20 g，按照上述提取工藝提取多糖,計(jì)算蒲公英根多糖的得率，多糖得率=(多糖質(zhì)量/藥材質(zhì)量)×100%。

2.2 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定蒲公英根多糖的含量。精密稱取葡萄糖對(duì)照品10 mg，用蒸餾水溶解配制成約100 μg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取不同體積(0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.8 mL)的葡萄糖對(duì)照品溶液分別置于6個(gè)具塞試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1 mL，搖勻。另取1 mL蒸餾水置具塞試管中，作為空白對(duì)照。每支試管中分別加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，充分搖勻，90 ℃下反應(yīng)30 min，室溫冷卻30 min。于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。蒲公英根多糖按照上述方法測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量。

2.3 多糖硫酸酯化工藝研究

2.3.1 硫酸酯化試劑的配制

此反應(yīng)需嚴(yán)格無水，首先用無水硫酸鈉對(duì)吡啶脫水，制得無水吡啶。取適量體積的無水吡啶置于燒瓶中，冰浴下攪拌10 min，另取適量體積的氯磺酸，緩慢加入，并不斷攪拌，室溫下反應(yīng)30 min，制得硫酸酯化試劑，4 ℃保存?zhèn)溆?。參照上述方法制備不同吡?氯磺酸體積比(2、4、6、8、10)的酯化試劑。

2.3.2 硫酸酯化反應(yīng)

取0.2 g蒲公英根多糖置于燒瓶中，加入60 mL無水二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌使其溶解。逐滴加入已經(jīng)制備好的酯化試劑，加完后調(diào)節(jié)至適當(dāng)溫度，反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)完成后，恢復(fù)至室溫，用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性，自來水透析1天，蒸餾水透析2天。透析液濃縮，冷凍干燥得硫酸酯化蒲公英根多糖。

2.3.3 單因素試驗(yàn)

2.3.3.1 反應(yīng)溫度對(duì)蒲公英根多糖硫酸酯化的影響

精密稱取0.2 g蒲公英根多糖，置于燒瓶中，用60 mL無水二甲基甲酰胺攪拌使其溶解，平行配制5份樣品溶液。分別逐滴加入15 mL酯化試劑(吡啶∶氯磺酸=6)，加完后調(diào)節(jié)至不同溫度(50、60、70、80、90 ℃)，反應(yīng)3 h，反應(yīng)完成后，調(diào)pH至中性，透析，冷凍干燥。考察反應(yīng)溫度對(duì)蒲公英根多糖硫酸酯化的影響。

2.3.3.2 吡啶與氯磺酸比對(duì)蒲公英根多糖硫酸酯化的影響

精密稱取0.2 g蒲公英根多糖，置于燒瓶中，用60 mL無水二甲基甲酰胺攪拌使其溶解，平行制備5份樣品。分別逐滴加入吡啶與氯磺酸的不同比例(2、4、6、8、10)制備的酯化試劑15 mL，加完后調(diào)節(jié)溫度至80 ℃，反應(yīng)3 h，反應(yīng)完成后，調(diào)pH至中性，透析，冷凍干燥。考察吡啶與氯磺酸比對(duì)蒲公英根多糖硫酸酯化的影響。

2.3.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蒲公英根多糖硫酸酯化的影響

精密稱取0.2 g蒲公英根多糖，置于燒瓶中，用60 mL無水二甲基甲酰胺攪拌使其溶解，平行配制5 份樣品溶液，分別逐滴加入15 mL酯化試劑(吡啶∶氯磺酸=6)，加完后調(diào)節(jié)溫度至80 ℃，分別反應(yīng)不同時(shí)間(1、2、3、4、5 h)，反應(yīng)完成后，調(diào)pH至中性，透析，冷凍干燥?？疾旆磻?yīng)時(shí)間對(duì)蒲公英根多糖硫酸酯化的影響。

2.3.4 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)單因素選擇取代度較高的三個(gè)水平，以反應(yīng)溫度、吡啶與氯磺酸比、反應(yīng)時(shí)間為自變量，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表

2.3.5 取代度測(cè)定

2.3.5.1 溶液配制

明膠溶液：精密稱取明膠2 g，溶于400 mL蒸餾水中，4 ℃保存?zhèn)溆?；氯化鋇-明膠溶液：稱取氯化鋇10 g溶于100 mL明膠溶液中，4 ℃保存?zhèn)溆?；硫酸鉀溶液的配制：精密稱取硫酸鉀0.362 g，置于500 mL量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.4 mg/mL SO42-工作液，備用；0.2 mol/L鹽酸的配制：精密量取9 mL鹽酸置500 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。

2.3.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻(xiàn)[16]的方法作輕微的修改，精密量取標(biāo)準(zhǔn)K2SO4溶液(0.4 mg/mL)0、0.5、1、2、3、5、7、9 mL，分別置于50 mL量瓶中，加水補(bǔ)足至10 mL。然后依次加入0.2 mol/L的鹽酸溶液10 mL，明膠溶液1 mL，充分振蕩混勻，再加入2.0 mL的氯化鋇-明膠溶液，渦旋混勻。室溫下反應(yīng)20 min，用紫外分光光度計(jì)在360 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度值記為A1?？瞻自囈旱奈舛戎涤洖锳2，以硫酸根的濃度為橫坐標(biāo)，(A1-A2)吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.5.3 樣品硫酸酯化取代度測(cè)定

精密稱取硫酸酯化蒲公英根多糖20 mg，加入20 mL鹽酸溶液(1 mol/L)，沸水浴中水解6 h，使硫酸根離子游離。取5 mL樣品溶液同標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法分析，測(cè)量氯化鋇-明膠與明膠的吸光度差值。然后代入以下方程，計(jì)算取代度(degree of substitution，DS)，DS=1.62S/(32-1.02S)，S是樣品中硫元素的百分率。

2.3.6 紅外光譜分析

取硫酸酯化蒲公英根多糖約2 mg，與400 mg溴化鉀研磨壓片，于4 000～400 cm-1進(jìn)行紅外檢測(cè)。

2.4 蒲公英根多糖及其硫酸酯的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepaRG細(xì)胞，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，將HepaRG細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。對(duì)照組更換新鮮培養(yǎng)基，其他組棄去原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度(31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL)的蒲公英根多糖、硫酸酯化蒲公英根多糖。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液(1 mg/mL)100 μL，孵育4 h，吸凈MTT溶液，棄上清，每孔加150 μL DMSO溶液，振蕩 10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測(cè)。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

2.5 蒲公英根多糖及其硫酸酯對(duì)HepaRG細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepaRG細(xì)胞，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，將HepaRG細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。H2O2造模濃度參考文獻(xiàn)[17]，選擇300 μmol/L。細(xì)胞分為對(duì)照組，H2O2模型組、蒲公英根多糖組、硫酸酯化蒲公英根多糖組。對(duì)照組、模型組更換培養(yǎng)液，蒲公英根多糖組、硫酸酯化蒲公英根多糖組更換不同濃度(31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL)的溶液，預(yù)處理24 h。吸去96孔板中的培養(yǎng)液，除對(duì)照組更換培養(yǎng)液，其他各組更換300 μmol/L H2O2溶液預(yù)處理8 h，棄去上清，每孔加入MTT溶液(1 mg/mL)100 μL，實(shí)驗(yàn)設(shè)8個(gè)復(fù)孔，孵育4 h，吸凈MTT溶液，棄上清，每孔加150 μL DMSO溶液，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測(cè)。細(xì)胞存活率計(jì)算同上。

3 結(jié)果與討論

3.1 多糖含量與提取率

以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y= 0.057x+0.035，r= 0.999 2。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出蒲公英根多糖含量為85.2%。蒲公英根多糖的提取率為43.86%±0.65%。

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 反應(yīng)溫度對(duì)蒲公英根多糖硫酸酯化的影響

結(jié)果見圖1a，在50～80 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高，硫酸酯化蒲公英根多糖取代度明顯增加。80～90 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，多糖硫酸基取代度反而有稍許降低，這可能是多糖發(fā)生降解，產(chǎn)生副反應(yīng)的緣故。本實(shí)驗(yàn)在80 ℃條件下，多糖的取代度最高。因此選擇80 ℃作為后續(xù)硫酸酯化反應(yīng)的溫度。

3.2.2 氯磺酸與吡啶的比對(duì)蒲公英根多糖硫酸酯化的影響

結(jié)果見圖1b，蒲公英根多糖硫酸基取代度隨吡啶用量的升高先增加后降低。多糖在吡啶溶液中溶解度較低，氯磺酸與吡啶能發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，提高多糖溶解度，使得多糖硫酸根取代度提高。本實(shí)驗(yàn)在吡啶與氯磺酸的比為6條件下，多糖的取代度最高，因此選擇吡啶與氯磺酸的比為6作為后續(xù)硫酸酯化反應(yīng)的吡啶與氯磺酸的比。

3.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蒲公英根多糖硫酸酯化的影響

結(jié)果見圖1c，反應(yīng)時(shí)間1～3 h，取代度由0.43增至1.05，增加趨勢(shì)明顯。這可能是多糖在此時(shí)間范圍內(nèi)，與硫酸酯化試劑不斷充分接觸的緣故。反應(yīng)時(shí)間3～5 h，取代度由1.05降至0.89，這是因?yàn)榱蛩狨セ磻?yīng)是可逆的，當(dāng)達(dá)到反應(yīng)平衡時(shí)，多糖發(fā)生了降解，取代度因而有降低的趨勢(shì)。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The results of single factor tests

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)，以反應(yīng)溫度、吡啶與氯磺酸比、反應(yīng)時(shí)間為自變量，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得二元多項(xiàng)回歸方程：Y=1.06+0.055A+0.18B+0.06C+0.024AB+0.072AC-0.089BC-0.15A2-0.071B2-0.13C2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表3可知，模型的一次項(xiàng)反應(yīng)溫度(P=0.025 5<0.05)具有顯著性；吡啶與氯磺酸比(P<0.000 1)具有極顯著性；反應(yīng)時(shí)間(P=0.018 8<0.05)具有顯著性。交叉項(xiàng)中反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間(P=0.035 7<0.05)，吡啶與氯磺酸比與反應(yīng)時(shí)間(P=0.014 9<0.05)具有顯著性。二次項(xiàng)中反應(yīng)溫度(P=0.000 9<0.001)具有極顯著性；吡啶與氯磺酸比(P=0.033 6<0.05)具有顯著性；反應(yīng)時(shí)間(P=0.002 2<0.01)具有高度顯著性。整體模型的P=0.000 3，表明二次方程模型顯著，模型的失擬項(xiàng)P=0.357 6>0.05，說明模型顯著合適。

表3 回歸分析結(jié)果

續(xù)表3(Continued Tab.3)

響應(yīng)曲面及等高線分析蒲公英根多糖硫酸酯化的響應(yīng)面分析見圖2。等高線圖反映了影響多糖硫酸酯化的各因素的交互作用。橢圓形等高線表示各因素交互作用顯著，曲率半徑與交互作用呈正相關(guān)，半徑最大的橢圓上取值，取代度最小，半徑最小的橢圓上取值，取代度最大，這些等高線可以反映取代度的變化情況。響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等高線最小橢圓的中心點(diǎn)。各因素對(duì)多糖取代度的影響為：吡啶與氯磺酸比與反應(yīng)時(shí)間>反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間>反應(yīng)溫度與吡啶與氯磺酸比。

圖2 等高線圖及響應(yīng)面3D圖Fig.2 Contourplots and response surface 3D plots

由Design-Expert.8.0.6.1軟件分析，多糖硫酸酯化取代度最大為1.17，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度82.56 ℃、吡啶與氯磺酸比為8、反應(yīng)時(shí)間2.96 h。為了試驗(yàn)操作方便，將多糖的硫酸酯化反應(yīng)條件修正為反應(yīng)溫度83 ℃、吡啶與氯磺酸比為8、反應(yīng)時(shí)間3 h。按照此反應(yīng)條件重復(fù)3次，取代度分別為1.12、1.16、1.11，方法穩(wěn)定，平均取代度1.13，此方法可行。

3.4 取代度檢測(cè)

3.5 硫酸酯化蒲公英根多糖紅外光譜分析

硫酸酯化蒲公英根多糖的紅外光譜分析見圖3，在波長(zhǎng)為3 530 cm-1有一個(gè)比較寬的振動(dòng)吸收峰即-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰；2 967.1 cm-1吸收峰是-CH的伸縮振動(dòng)吸收峰；在1 656.1 cm-1存在較強(qiáng)的吸收峰是羰基不對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的；1 490、1 379.2 cm-1是-CH面內(nèi)彎曲振動(dòng)引起的；1 261.5、1 242.3 cm-1由S=O不對(duì)稱振動(dòng)引起；1 067.4、1 024.6、1 000.5 cm-1由C-O伸縮振動(dòng)引起的；815.3 cm-1由對(duì)稱的C-O-S振動(dòng)引起，說明多糖硫酸酯化修飾成功。

圖3 硫酸酯化多糖的紅外光譜圖Fig.3 Infraredspectrumof sulfated polysaccharide

3.6 蒲公英根多糖及硫酸酯的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

在評(píng)估蒲公英根多糖及硫酸酯對(duì)HepaRG細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用之前，采用MTT法考察多糖及硫酸酯對(duì)HepaRG細(xì)胞活力的影響，以確保其無細(xì)胞毒性。試驗(yàn)結(jié)果見圖4a、4b。HepaRG細(xì)胞在含不同濃度(31.25～1 000 μg/mL)蒲公英根多糖及硫酸酯溶液中孵育24 h的細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在濃度為2 000 μg/mL時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是各組的細(xì)胞存活率均大于90%，這表明蒲公英根多糖及硫酸酯具有良好的生物學(xué)活性，對(duì)HepaRG細(xì)胞無顯著的細(xì)胞毒性。

圖4 蒲公英根多糖及其硫酸酯對(duì)H2O2致HepaRG細(xì)胞損傷活力的影響Fig.4 Effects of dandelion root polysaccharide and its sulfate on H2O2 induced HepaRG cell injury注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note: Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with model group,#P<0.05,##P<0.01.

3.7 蒲公英根多糖及硫酸酯對(duì)HepaRG細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

MTT測(cè)定結(jié)果見圖4c。模型組細(xì)胞存活率為(51.38±3.92)%。與模型組比較，蒲公英根多糖及其硫酸酯在濃度(31.25～250 μg/mL)范圍內(nèi)，HepaRG細(xì)胞存活率與濃度成劑量依賴性，在250 μg/mL時(shí)，HepaRG細(xì)胞存活率最高。濃度(500～2 000 μg/mL)范圍內(nèi)，HepaRG細(xì)胞存活率隨著濃度的增加，有降低的趨勢(shì)，這可能是較高濃度的多糖影響細(xì)胞膜內(nèi)滲透性。濃度31.25 μg/mL時(shí)，蒲公英根多糖及硫酸酯對(duì)H2O2損傷的HepaRG細(xì)胞保護(hù)無明顯差異。62.5～2 000 μg/mL濃度范圍內(nèi)，硫酸酯化蒲公英根多糖的活性優(yōu)于蒲公英根多糖。

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學(xué)衍生物而引起的細(xì)胞損傷，在代謝綜合征中起著重要作用，它是肥胖、糖尿病、脂質(zhì)沉積、慢性炎癥等發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

H2O2作為活性氧在體內(nèi)的主要存在形式，其極易透過細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞造成損傷。在H2O2刺激下，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，細(xì)胞DNA繼而受到損傷，相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的損傷，最終可以造成細(xì)胞死亡。蒲公英根多糖及其硫酸酯對(duì)H2O2致HepaRG細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，可能與其具有較好的抗氧化活性有關(guān)，這項(xiàng)研究可為蒲公英根多糖及其修飾物的開發(fā)應(yīng)用提供有價(jià)值的參考。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用氯磺酸-吡啶法對(duì)蒲公英根多糖進(jìn)行硫酸酯化修飾，并用響應(yīng)曲面法對(duì)硫酸酯化的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到硫酸酯化反應(yīng)的最優(yōu)條件為反應(yīng)溫度83 ℃、吡啶與氯磺酸比為8、反應(yīng)時(shí)間3 h，在此條件下，硫酸酯化蒲公英根多糖的取代度為1.13。經(jīng)過硫酸酯化修飾后的蒲公英根多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用。本研究表明，硫酸酯化修飾有助于提高蒲公英根多糖的抗氧化能力，為蒲公英根多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供新的思路與方向。