脹果甘草多糖GiP-B1通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活巨噬細胞RAW 264.7

叢媛媛，依明·尕哈甫，陳春麗，娜迪熱木·肖克拉提，俞永婷

新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 830011

天然免疫系統(tǒng)是機體抵抗病原體入侵的重要防線，而Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)以及表達TLRs的巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原提呈細胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1,2]。有關TLRs參與巨噬細胞免疫識別、調控信號轉導、啟動免疫應答反應的研究表明，TLRs家族中除了TLR3外的其他成員，都可以通過識別脂多糖(lipopolysacchride，LPS)等配體，結合髓樣分化因子88(mycloid differentiation factor 88，MyD88)，招募相關激酶并激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)抑制物的激酶(inhibitor of NF-κB kinases，IKK)，使結合NF-κB的NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)發(fā)生磷酸化并解離，活化NF-κB進入細胞核，啟動或抑制靶基因的轉錄，進而調控天然免疫應答反應[3-5]。

多糖作為一類有效的生物應答調節(jié)劑，激活巨噬細胞免疫應答的機制也與TLRs/NF-κB信號通路轉導有關。研究發(fā)現，許多植物多糖可與巨噬細胞表面的TLR2/4等受體特異性結合，激活NF-κB信號通路，調控細胞因子的轉錄和吞噬細胞中共刺激分子的表達，并啟動下級級聯，激活先天性免疫與獲得性免疫[6-9]。

脹果甘草(GlycyrrhizainflataBat.)是新疆特色藥用植物資源，其干燥根及根莖作為藥材甘草已被《中國藥典》收錄，其粗多糖GiP及其純化組分已被本課題組證實具有促進巨噬細胞和淋巴細胞增殖作用[10-12]，其中含量較高的純化組分GiP-B1是一個具有聚Rha-GalA主鏈的酸性多糖，相對分子量大于2.0×106Da，糖醛酸含量為16.8%，可顯著促進巨噬細胞RAW 264.7的增殖和吞噬作用，提高巨噬細胞的IL-1β和TNF-α分泌量，促進NO和NOS的生成。課題組進而采用單克隆抗體anti-TLR4干預巨噬細胞后發(fā)現，GiP-B1誘導的TNF-α、IL-1β、1L-6和NO的分泌，以及iNOS、1L-1β、TNF-α、1L-6 mRNA表達，都出現不同程度的抑制，提示GiP-B1激活巨噬細胞可能與TLR4及其相關信號通路有關。為了深入研究脹果甘草多糖GiP-B1激活巨噬細胞與TLR4/NF-κB信號通路有關，本文在體外利用TLR4干擾RNA(TLR4-siRNA)轉染巨噬細胞RAW 264.7，探討GiP-B1干預后是否可通過TLR4介導的NF-κB信號通路激活巨噬細胞，以期闡明GiP-B1激活巨噬細胞的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

RAW 264.7小鼠巨噬細胞株購自中科院上海細胞生物所，培養(yǎng)條件為DMEM(高糖)培養(yǎng)基+10% FBS+1%雙抗(青霉素+鏈霉素)，37 ℃，5% CO2，飽和濕度。

1.1.2 脹果甘草多糖GiP-B1

實驗室自制，用DMEM完全培養(yǎng)液配成20 mg/mL樣品母液，0.22 μm無菌濾器過濾，放于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑

胎牛血清(FBS，批號：16000044)、DMEM培養(yǎng)基(批號：C11965500BT)、胰酶(0.25% Trypsin-EDTA，批號：25200-056)購自美國GIBCO公司;CCK-8試劑盒(批號：FC101-03)、Trans2K DNA Marker(批號：BM101)、TransZol Up(批號：ET111)、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(批號：AT311)購自北京全式金生物，QuantiNava SYBR Green PCR試劑盒(批號：208054)購自德國QIAGEN公司;lipofectamine RNAiMAX(批號：13778-150)、Block-iT Alexa Fluor Red(批號：14750-100)、TLR4 siRNA(批號：MSS211922，MSS211923，MSS211924)、Negative Control(批號：452000)購自美國Life Technologies公司;Anti-IκBα(批號：ab32518)、Anti-NF-κB p65單克隆抗體(批號：ab32536)購自英國Abcam公司;MyD88(批號：4283)、Phospho-IκBα(批號：2859)、Phospho-NF-κB p65(批號：3033)、TLR4兔單克隆抗體(批號：14358)購自美國CST公司。

1.1.4 儀器

Smart Cell HF-90 CO2細胞培養(yǎng)箱(上海力康儀器有限公司)；Eclipse TS100-F熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)；xMarkTM酶標儀(美國Bio-Rad公司)；K5500核酸蛋白定量儀(北京凱奧公司)；2500凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)；MyCycler Thermal Cycler PCR儀(美國Bio-Rad公司)；QuantStudioTM6 Flex Real Time PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度GiP-B1對RAW 264.7細胞活力的影響

取生長狀態(tài)良好匯合率達90%的細胞，完全培養(yǎng)基制備成2×105個/mL單細胞懸液，接種至96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h；加入100 μL不同濃度(0、25、50、100、200、400、800 μg/mL)的GiP-B1溶液，每組5個復孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，每孔加入10%的CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h；用酶標儀測定450 nm處的OD值。

1.2.2 siRNA轉染條件確定和TLR4-siRNA的篩選

取9 μL lipofectamin RNAiMAX試劑，分別與1.5 μL不同濃度Block-iT Alexa Fluor Red試劑(0.01、0.1 μmol/L)混勻，室溫孵育5 min，靜置20 min。將細胞接種至24孔板培養(yǎng)孔中，使轉染時細胞密度達70%，在每孔細胞中加入100 μL轉染液，37 ℃培養(yǎng)24 h和48 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光情況，根據紅色熒光數確定轉染效率較好的轉染條件。

4) 母艦減速制動不影響其所拖曳的多分枝線列陣的線陣聲學段的安全保障性能及工作穩(wěn)定性，但若減速度過大或減速沖時過少，會導致陣列自身的擺動加劇從而使得分支陣列難以保持平衡，無法精確預報拖曳線列陣聲納的位置和構型姿態(tài)，出現陣型畸變后探測性能下降、甚至無法工作的狀態(tài)。

3條TLR4 siRNA和Negative Control siRNA(與人類基因無同源性)的序列見表1。用無血清培養(yǎng)基稀釋各siRNA至濃度50 nmol/L，取7.5 μL與45 μL lipofectamin RNAiMAX試劑混勻，室溫孵育5 min，靜置20 min。將細胞接種至24孔板培養(yǎng)孔中，使轉染時細胞密度達70%，在每孔細胞中加入100 μL轉染液，37 ℃培養(yǎng)，用RT-PCR法分別檢測細胞各TLR4 siRNA表達量，篩選出干擾效率最高的siRNA進行后續(xù)實驗[13-16]。

表1 TLR4-siRNA序列

1.2.3 實驗分組

將生長狀態(tài)良好的RAW 264.7細胞接種至培養(yǎng)瓶中，貼壁生長24 h后使其匯合率達70%，分為空白對照組(不轉染，blank control)、陰性對照組(RAW 264.7細胞與人類基因無同源性的siRNA轉染，negative control，NC)、TLR4小干擾RNA轉染組(TLR4-siRNA組，si)、100 μg/mL GiP-B1組(樣品組)、100 μg/mL GiP-B1+TLR4-siRNA組(樣品+si組)。

1.2.4 TLR4-siRNA轉染后GiP-B1對RAW 264.7細胞增殖的影響

按“1.2.2”項下方法培養(yǎng)細胞24 h后，分組給藥：100 μL用完全培養(yǎng)基配制的Negative Control(與人類基因無同源性的siRNA)溶液、TLR4-siRNA溶液、100 μg/mL GiP-B1溶液，100 μg/mL GiP-B1+TLR4-siRNA溶液以及空白對照組，每組5個復孔，轉染24 h；放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，每孔加入培養(yǎng)基總體積10%的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定450 nm處的OD值。

1.2.5 TLR4-siRNA轉染后GiP-B1對RAW 264.7細胞炎癥因子產生的影響

按“1.2.2”項下方法培養(yǎng)細胞24 h后，分組給藥：500 μL用完全培養(yǎng)基配制的Negative Control溶液、TLR4-siRNA溶液、GiP-B1溶液，GiP-B1+TLR4-siRNA溶液以及空白對照組，每組5個復孔，轉染24 h；分別吸取各組培養(yǎng)上清液ELISA法進行檢測。

1.2.6 TLR4-siRNA轉染后GiP-B1對RAW 264.7細胞NF-κB信號通路相關基因表達的影響

按“1.2.2”項下方法培養(yǎng)細胞24 h后，分組給藥，每組5個復孔，轉染24 h后，棄上清液，按Trizol試劑說明書方法提取各組細胞總RNA，按TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書方法逆轉錄成cDNA。熒光定量PCR檢測按QuantiNava SYBR Green PCR Kit說明書進行。反應條件：94 ℃預變性30 s，95 ℃、60 ℃、72 ℃ 30 s，72 ℃延伸7 min，40個循環(huán)。引物序列見表2。

表2 引物序列表

1.2.7 TLR4-siRNA沉默TLR4基因后，脹果甘草多糖對巨噬細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

按“1.2.2”項下方法培養(yǎng)細胞24 h后，分組給藥，每組5個復孔，轉染24 h后，棄上清液，加入1 mL胰酶消化細胞，參照文獻提取細胞總蛋白和線粒體蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。每個樣本上樣總量為50 μg，蛋白質預染Marker上樣量為9 μL，用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉至PVDF膜。用5%脫脂奶粉溶液(Tert)室溫振搖封閉1 h，然后加入TLR4一抗(1∶1 000)、MyD88一抗(1∶1 000)、NF-κB p65一抗(1∶500)、P-NF-κB p65一抗(1∶500)、IκB一抗(1∶500)、P-IκBα一抗(1∶500)、β-actin一抗(1∶2 500)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入相應二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次。加入化學發(fā)光試劑，經顯影、定影后，ChemiScope mini化學發(fā)光儀檢測、拍照。

1.2.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同濃度脹果甘草多糖(GiP-B1)對RAW 264.7細胞活力的作用

由圖1可知，GiP-B1干預細胞24 h后，50～200 μg/mL組的OD值都明顯高于對照組(P<0.05)，其中100 μg/mL組的OD值最高，表明該濃度范圍內GiP-B1無細胞毒性，可促進巨噬細胞增殖；隨著濃度增加，各組的OD值反而降低。因此后續(xù)實驗GiP-B1干預濃度選擇100 μg/mL。

圖1 不同濃度GiP-B1對RAW 264.7細胞株干預24 h后的結果Fig.1 Results of different concentrations of GiP-B1 on RAW 264.7 cell line after 24 h of intervention 注：與空白對照組比較，*P<0.05。Note:Compared with the blank control group,*P<0.05.

2.2 siRNA轉染條件確定和TLR4-siRNA的篩選

不同濃度siRNA轉染RAW 264.7細胞不同時間的熒光照片(見圖2)顯示，只有轉染成功的細胞才能在熒光顯微鏡下看到Block-iT Alexa Fluor指示劑的紅色熒光，當0.01 μmol/L siRNA轉染細胞24 h時，紅色熒光亮度及具有熒光細胞數較多，轉染效率較好，故選擇siRNA濃度為0.01 μmol/L，轉染時間24 h為正式實驗的轉染條件，用于以下目的基因的轉染實驗。

圖2 RAW 264.7細胞轉染熒光圖片(×100)Fig.2 Fluorescence image of RAW 264.7 cell transfection (×100)注：A：0.01 μmol/L；B：0.1 μmol/L

3對TLR4-siRNA轉染RAW 264.7細胞24 h后，TLR4 mRNA表達水平由RT-PCR法檢測，結果顯示(見圖3)，3組TLR4-siRNA都能有效沉默相應mRNA的表達(P<0.05)，其中TLR4-siRNA1組與空白對照組相比，TLR4的mRNA表達水平下調了68.4%，沉默效果最為明顯，因此后續(xù)實驗選用TLR4-siRNA1進行轉染。

圖3 不同TLR4-siRNA轉染細胞后TLR4的mRNA相對表達量Fig.3 Relative expression of TLR4 mRNA in cells transfected 注：與空白對照組相比，*P<0.05；與陰性對照組相比，#P<0.05。Note:Compared with the blank control group, *P<0.05;Compared with the negative control group,#P<0.05.

2.3 TLR4-siRNA沉默后GiP-B1對RAW 264.7巨噬細胞增殖的影響

選擇沉默效率最高的TLR4-siRNA1轉染24 h后，CCK-8法檢測GiP-B1對巨噬細胞增殖中的作用。結果顯示(見圖4)，與空白組相比，TLR4-siRNA組巨噬細胞增殖率顯著降低(P<0.05)，說明TLR4-siRNA干擾模型成立；100 μg/mL GiP-B1組巨噬細胞增殖率顯著提高(P<0.05)；GiP-B1+ TLR4-siRNA組巨噬細胞的增殖作用則受到抑制，與GiP-B1組差異顯著(P<0.01)，提示GiP-B1可通過TLR4促進巨噬細胞的增殖。

圖4 TLR4沉默后GiP-B1對RAW 264.7細胞增殖活性的影響Fig.4 Effect of GiP-B1 on the proliferative activity of RAW 264.7 cells after TLR4 = 5)注：與空白對照組比較，*P<0.05；與GiP-B1組比較，##P<0.01。Note:Compared with the blank control group,*P<0.05;Compared with GiP-B1 group,##P<0.01.

2.4 TLR4-siRNA沉默后GiP-B1對巨噬細胞RAW 264.7分泌炎癥因子的影響

TLR4-siRNA1轉染24 h后，ELISA法檢測GiP-B1影響巨噬細胞分泌炎癥因子的結果顯示(見圖5)，與空白組相比，100 μg/mL的GiP-B1則可促進巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；GiP-B1+TLR4-siRNA1組巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α的含量均相應減少，與GiP-B1組差異均顯著(P<0.05)，提示GiP-B1可通過TLR4促進巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α。

圖5 TLR4沉默后GiP-B1對巨噬細胞RAW 264.7分泌 IL-1β、IL-6及TNF-α的影響Fig.5 Effects of GiP-B1 on the secretion of IL-1β,IL-6 and TNF-α in macrophage RAW 264.7 cells 注：與空白對照組比較，*P<0.05；與GiP-B1組比較，##P<0.01。Note:Compared with the blank control group,*P<0.05;Compared with GiP-B1 group,##P<0.01.

2.5 TLR4-siRNA干擾下GiP-B1對巨噬細胞NF-κB信號通路相關基因表達的影響

RT-PCR檢測結果見圖6，與空白組相比，GiP-B1干預組的TLR4 mRNA表達顯著上調，表達量增加93.2%，該組經TLR4-siRNA1轉染24 h后，TLR4的mRNA顯著下調，表達量降低44.2%，與未轉染組相比表達量降低71.1%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；在GiP-B1的干預下，MyD88、P65、IκBα的mRNA水平明顯上調，在TLR4-siRNA1轉染后則都顯著下調，表達量分別降低44.2%、54.6%、50.89%，與未轉染組差異均極顯著(P<0.01)。該結果表明，干擾TLR4基因表達后，TLR4/NF-κB信號通路的表達被干擾，100 μg/mL GiP-B1誘導的巨噬細胞TLR4/NF-κB信號通路下游基因MyD88、p65、IκBα的mRNA表達量被顯著抑制，說明TLR4/NF-κB信號通路與GiP-B1激活巨噬細胞有關。

圖6 TLR4沉默后GiP-B1對RAW 264.7細胞mRNA相對表達量的影響Fig.6 Effect of GiP-B1 on the relative expression of mRNA in RAW 264.7 cells after TLR4 =5)注：與空白對照組相比，**P<0.01；與GiP-B1組相比，##P<0.01。Note:Compared with the blank control group,**P<0.01;Compared with GiP-B1 group,##P<0.01.

2.6 TLR4-siRNA干擾下GiP-B1對巨噬細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

Western blot檢測結果見圖7，與空白組相比，GiP-B1干預組的TLR4、MyD88蛋白表達顯著上調，表達量分別增加55.9%和43.2%，該組經TLR4-siRNA1轉染24 h后，TLR4、MyD88的蛋白則顯著下調，與未轉染組相比表達量分別降低33.9%和30.9%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在GiP-B1的干預下，IκBα、NF-κB p65的蛋白表達水平幾乎沒有改變，但p-p65、p-IκBα的蛋白表達水平明顯上調(P<0.05)；而當TLR4-siRNA1轉染后，p-p65、p-IκBα的蛋白則都相應顯著下調，表達量分別降低32.4、30.4%，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明TLR4-siRNA沉默TLR4基因后，GiP-B1激活NF-κB信號通路的作用減弱。該結果提示GiP-B1可通過TLR4上調NF-κB p65磷酸化水平，誘導p-IκBα磷酸化降解，促進NF-κB入核，從而啟動NF-κB信號通路，激活巨噬細胞的免疫應答反應。

3 討論與結論

巨噬細胞是機體先天性免疫的重要執(zhí)行者，作為專職性組織吞噬細胞，通過其表面表達的TLRs等模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR),可以識別病原微生物表面保守的病原體相關分子模式(pathogen - associated molecular pattern，PAMP)，通過下游的信號途徑，調節(jié)各種免疫反應基因的表達從而清除病原體[17]。研究表明，許多天然植物多糖可作為TLR4的配體，通過MyD88依賴和非依賴兩條途徑進行巨噬細胞內信號傳遞，促進NF-κB進入細胞核并與DNA啟動子上特定識別序列結合，介導細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α等的表達，同時這些細胞因子又作為NF-κB的刺激劑，可進一步活化NF-κB造成持續(xù)的炎癥反應，激活適應性免疫應答[18-22]。

脹果甘草作為中藥甘草的一種基源植物，其主要藥效物質除了具有抗癌活性的查爾酮類外，還包括具有抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性、免疫調節(jié)活性的多糖類[10-12,23-25]。前期本課題組研究發(fā)現，脹果甘草粗多糖GiP及其純化組分具有促進巨噬細胞和淋巴細胞增殖作用，其中含量較高的純化組分GiP-B1對巨噬細胞RAW 264.7的增殖、吞噬、分泌細胞因子的功能具有顯著促進作用。前期課題組利用anti-TLR4處理細胞并加樣干預后發(fā)現，其作用機制與激活TLR4/NF-κB信號通路有關。本文利用siRNA技術，通過TLR4-siRNA沉默TLR4基因，發(fā)現GiP-B1促進巨噬細胞RAW 264.7增殖、分泌細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的作用被抑制，說明TLR4參與了GiP-B1對巨噬細胞RAW 264.7增殖、分泌細胞因子的作用，即GiP-B1激活巨噬細胞與TLR4相關，這與前期抗體封閉實驗的結果是一致的。另外，從GiP-B1通過TLR4激活巨噬細胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子的類型上看，提示GiP-B1激活巨噬細胞后可誘導其向M1型極化，M1型巨噬細胞除了促進炎癥反應外，還具有抗原提呈能力，能夠激活T細胞的適應性免疫反應，誘導Thl細胞免疫反應，對病原體和腫瘤細胞可發(fā)揮宿主免疫清除功能[26,27]。前期研究也發(fā)現，GiP-B1也具有一定的體外抗腫瘤作用，其作用機制是否與GiP-B1促進巨噬細胞極化有關，是否可以通過調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞促進機體的抗腫瘤免疫作用還需要進一步深入研究。

為了進一步證明GiP-B1激活巨噬細胞與TLR4/NF-κB通路有關，本實驗還對TLR4-siRNA干預下GiP-B1對巨噬細胞NF-κB通路上游調控基因TLR4、依賴性分子MyD88、受體下游基因NF-κBp65、IκBα等的mRNA和蛋白表達變化進行了研究。結果發(fā)現由于TLR4基因被沉默，TLR4 mRNA表達量降低，細胞核內游離NF-κBp65含量顯著減少，激活NF-κB通路的作用也隨之降低；而GiP-B1不僅可提高正常狀態(tài)下巨噬細胞中TLR4基因的表達，上調TLR4信號依賴分子MyD88及下游基因NF-κBp65、p-IκBα的mRNA和蛋白表達量，而且還可上調因RNA干擾導致的TLR4及MyD88、NF-κBp65、p-IκBα的mRNA和蛋白的表達下降，進一步證明GiP-B1可作為TLR4配體之一，可活化依賴MyD88的TLR4/NF-κB信號通路，使NF-κB家族中的核轉錄因子p65被活化，導致IκB發(fā)生磷酸化降解而與NF-κB解離，促進NF-κB從細胞質移位到細胞核，與DNA特定序列結合，調節(jié)炎癥細胞因子、細胞增殖(抗凋亡)等基因的轉錄，參與炎癥反應、免疫應答等。GiP-B1通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活巨噬細胞的調控方式，與上述研究中多糖的作用通路幾乎一致[20-22]。

綜上所述，GiP-B1可通過TLR4/NF-κB信號通路調控巨噬細胞RAW 264.7免疫功能，其調控作用主要是通過MyD88依賴途徑實現的。本實驗為脹果甘草多糖激活巨噬細胞的作用研究提供了實驗依據，有助于闡明脹果甘草多糖在炎癥反應、免疫應答等方面的作用機制。