lncRNA LINC01082靶向調(diào)控miR-543抑制膀胱癌惡性進展的實驗研究

翟曉磊 郝朝輝 張楠 李萍 韓前河

膀胱癌發(fā)病率在泌尿生殖系統(tǒng)中占首位，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步，患者生存時間有所延長，但晚期患者的5年生存率僅15%[1]。因此，持續(xù)探索膀胱癌的分子機制，對于開發(fā)有效的診療方案必不可少。大量研究顯示，許多長鏈非編碼RNA(long chain non-coding RNA, lncRNA)在膀胱癌中異常表達，且通過調(diào)控相關(guān)微小RNA(microRNA, miRNA)影響腫瘤細胞生物學(xué)行為進而發(fā)揮致癌或抑癌作用[2-3]。有研究指出，lncRNA LINC01082在結(jié)腸癌組織中低表達并發(fā)揮抑癌作用，有望成為結(jié)腸癌的新型抑制劑或治療靶點[4]；也有報道發(fā)現(xiàn)LINC01082在膀胱癌中表達下調(diào)，且與膀胱癌分級較低、低侵襲性密切相關(guān)[5]；目前關(guān)于LINC01082在膀胱癌中的作用及分子機制尚未見報道。miR-543在包括膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤中異常高表達，發(fā)揮致癌作用[6-8]。且生物信息學(xué)工具顯示LINC01082與miR-543之間有靶向關(guān)系，因此推測，LINC01082是否通過miR-543發(fā)揮抑癌作用。本研究旨在探討LINC01082是否通過靶向miR-543表達參與膀胱癌細胞的生物學(xué)調(diào)控，為膀胱癌的發(fā)病機制及治療提供新線索。

材料與方法

一、主要材料與試劑

膀胱癌和對應(yīng)癌旁組織均來自于鄭州人民醫(yī)院2019年3月至2020年6月收治的40例膀胱癌患者；人膀胱上皮永生化細胞系SV-HUC-1和人膀胱癌細胞系BIU87、5637、J82、UM-UC-3購自上海細胞庫，F(xiàn)12K培養(yǎng)液購自美國Sigma公司，MEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，RPMI-1640培養(yǎng)液、雙熒光素酶報告基因試劑盒和全蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，pcDNA 3.1-LINC01082過表達載體及空載體質(zhì)粒、miR-543模擬物及陰性對照miR-NC及各PCR引物購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。兔抗人Ki-67、MMP-9、Bcl-2、Bax一抗及羊抗兔二抗購自武漢三鷹生物科技有限公司。本研究獲得本院倫理委員會的批準。

二、細胞培養(yǎng)

SV-HUC-1細胞采用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)液培養(yǎng)；BIU87細胞和5637細胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；J82細胞和UM-UC-3細胞采用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；培養(yǎng)條件均為5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱。

三、轉(zhuǎn)染與分組

將處于對數(shù)生長期的J82細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板上，常規(guī)培養(yǎng)至65%～75%匯合度時，參照脂質(zhì)體3000說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染5 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。細胞分為LINC01082組、空載體組、miR-543組、miR-NC組和LINC01082+miR-543組，分別轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-LINC01082質(zhì)粒、pcDNA 3.1空載體、miR-543模擬物、miR-NC以及共轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-LINC01082和miR-543模擬物，同時設(shè)立正常培養(yǎng)的細胞為空白組，每組設(shè)3個復(fù)孔。

四、RT-qPCR檢測膀胱癌組織和細胞中LINC-01082、miR-543的表達水平

按照Trizol試劑說明書提取待測組織或細胞的總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA后，以cDNA為模板，參照RT-qPCR試劑盒說明書上熒光定量PCR儀進行擴增；以GAPDH或U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算LINC01082和miR-543的表達水平。PCR擴增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。PCR引物序列如下：LINC01082上游：5′-CAGTGACAGCCTTAACA-TTTGC-3′，下游：5′-TTCGGTGCTGGGTTGA-TCCT-3′；GAPDH上游：5′-GGAGCGAGATCCC-TCCAAAAT-3′，下游：5′-GGCTGTTGTCATAC-TTCTCATGG-3′；miR-543上游：5′-AAACATTC-GCG-3′，下游：5′-AAGAAGTGCAC-3′；U6上游：5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTG-3′。

五、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CLINC01082與miR-543的靶向作用

將野生的LINC01082片段和定點突變后的LINC01082片段克隆重組至psiCHECK-2載體上，分別構(gòu)建野生型psiCHECK-LINC01082(LINC01082-wt)和突變型psiCHECK-LINC01082(LINC01082-mut)載體質(zhì)粒。參照脂質(zhì)體3000說明書將LINC01082-wt或LINC01082-mut與miR-543模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染至293T細胞中。收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞檢測其熒光素酶活性，具體步驟參照試劑盒說明書。

六、MTT法檢測細胞增殖活性

J82細胞轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng)0、24、48、72、96 h；培養(yǎng)至所需時間后，每孔加入5 g/L MTT試劑20 μl孵育4 h；棄培養(yǎng)液后，每孔再加入150 μl二甲基亞砜；震蕩反應(yīng)至結(jié)晶充分溶解后，使用酶標儀在450 nm處檢測各組細胞吸光度(OD)值。

七、Transwell實驗檢測細胞侵襲、遷移能力

收集轉(zhuǎn)染24 h后的各組J82細胞，以無血清培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2.5×104個/ml。將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)液稀釋后，取100 μl均勻涂抹于上室表面，放置30 min 后凝成基質(zhì)膠。而后向Transwell小室上室中加入細胞懸液200 μl，在下室中加入含血清培養(yǎng)液500 μl；孵育24 h后，以棉簽擦去未侵入的細胞，采用4%多聚甲醛固定小室下室表面細胞后，0.5%結(jié)晶紫染色15 min。采用顯微鏡觀察并統(tǒng)計遷移細胞數(shù)。同時，調(diào)整細胞終濃度約5×104個/ml，不涂抹基質(zhì)膠重復(fù)上述過程，檢測細胞遷移能力。

八、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

收集轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，用磷酸鹽緩沖液(預(yù)冷)漂洗3次后，加入結(jié)合緩沖液調(diào)整細胞濃度為106個/ml。向100 μl細胞液中加入染色液Annexin V-FITC和碘化丙啶各5 μl；充分混勻后，在避光下室溫孵育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

九、Western blot檢測細胞中蛋白表達

參照全總蛋白提取試劑盒說明書提取各組細胞總蛋白后，檢測其蛋白濃度；將蛋白樣品和上樣緩沖液(4∶1)混勻后，置于沸水浴中變性5 min；將蛋白樣品按照每泳道60 μg行12% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯膜。脫脂奶粉封閉2 h后，以特異性一抗Ki-67(1∶800)、MMP-9(1∶500)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)4 ℃下孵育過夜；洗去一抗反應(yīng)液后，再以二抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h。暗室內(nèi)顯影曝光后，以GAPDH作參照,使用Gel Pro 4.0 軟件分析細胞中Ki-67、MMP-9、Bcl-2和Bax蛋白表達水平。

十、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、LINC01082和miR-543在膀胱癌組織中的表達及相關(guān)性

與癌旁組織比較，膀胱癌組織中LINC01082表達水平明顯降低(圖1A)，而miR-543水平明顯升高(圖1B，P<0.001)；且LINC01082與miR-543表達水平呈負相關(guān)(圖1C)。

A：LINC01082在膀胱癌組織中的表達(*P<0.001)；B：miR-543在膀胱癌組織中的表達(*P<0.001)；C：膀胱癌組織中LINC01082和miR-543表達的相關(guān)性

二、LINC01082和miR-543在膀胱癌細胞中的表達

與SV-HUC-1細胞比較，膀胱癌細胞BIU87、5637、J82和UM-UC-3中LINC01082表達水平較低(圖2A)，而在miR-543表達水平較高(圖2B，P<0.001)，且J82細胞中LINC01082表達水平最低，因此以J82細胞作為后續(xù)實驗對象。轉(zhuǎn)染后，J82細胞中LINC01082組LINC01082表達水平明顯升高(圖2C)，miR-543表達水平明顯降低，而miR-543組中miR-543表達水平明顯升高(圖2D，P<0.001)。

A：膀胱癌及膀胱上皮細胞中LINC01082表達水平；B：膀胱癌及膀胱上皮細胞中miR-543表達水平；C：轉(zhuǎn)染后膀胱癌細胞中LINC01082表達水平；D：轉(zhuǎn)染后膀胱癌細胞中miR-543表達水平

三、LINC01082與miR-543的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)軟件LncBase Predicted v.2分析結(jié)果顯示，LINC01082和miR-543之間存在互補的結(jié)合位點(圖3A)；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果顯示，與miR-NC+LINC01082-wt組比較，miR-543+LINC01082-wt組熒光素酶活性明顯較低(圖3B，P<0.001)。

A：LINC01082和miR-543的結(jié)合位點；B：熒光素酶活性(*P<0.001)

四、LINC01082過表達對細胞增殖的影響

與空白組比較，LINC01082組細胞增殖能力明顯減弱(P<0.05)，而miR-543組明顯增強(P<0.001)；與LINC01082組比較，LINC01082+miR-543組細胞增殖能力明顯增強(P<0.01)，見圖4。

圖4 LINC01082過表達對J82細胞增殖的影響(*P<0.01，**P<0.001)

五、LINC01082過表達對細胞侵襲和遷移的影響

與空白組比較，LINC01082組細胞侵襲和遷移細胞數(shù)目明顯降低，而miR-543組明顯增多(P<0.001)；與LINC01082組相比，LINC01082+miR-543組侵襲和遷移細胞數(shù)目明顯增多(P<0.001)，見圖5。

A：Transwell檢測細胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×200)；B：Transwell檢測細胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×200)；C：侵襲細胞數(shù)比較(*P<0.001)；D：遷移細胞數(shù)比較(*P<0.001)

六、LINC01082過表達對膀胱癌J82細胞凋亡的影響

與空白組比較，LINC01082組細胞凋亡率明顯升高，而miR-543組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與LINC01082組比較，LINC01082+miR-543組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，見圖6。

圖6 LINC01082過表達對J82細胞凋亡的影響

七、LINC01082過表達對增殖、遷移及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

與空白組比較，LINC01082組細胞Ki-67、MMP-9和Bcl-2表達水平顯著較低且Bax顯著較高，而miR-543組Ki-67、MMP-9和Bcl-2表達水平較高且Bax表達水平較低(P<0.001)；與LINC01082組相比，LINC01082+miR-543組Ki-67、MMP-9和Bcl-2表達水平較高，Bax表達水平較低(P<0.001)，見圖7。

A:Western blot檢測各組Ki-67、MMP-9、Bcl-2和Bax蛋白；B:各組Ki-67、MMP-9、Bcl-2和Bax蛋白表達水平比較(*P<0.001)

討 論

lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的非編碼長鏈RNA，可從轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及表觀遺傳學(xué)等多個層面調(diào)控基因表達，參與機體多種生物學(xué)功能的調(diào)控，與包括膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9]。如lncRNA TP73-AS1過表達可通過減弱上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程抑制膀胱癌細胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡[10]；lncRNA LINC01638可通過上調(diào)ROCK2表達促進膀胱癌細胞的遷移和侵襲，并參與膀胱癌術(shù)后的遠處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[11]。LINC01082是lncRNAs家族成員之一，其在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌作用，可顯著抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[4]；然而，LINC01082在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用未見報道。本研究顯示LINC01082在40例膀胱癌組織和4種膀胱癌細胞系中表達下調(diào)，且在J82細胞中表達最低；過表達J82細胞中的LINC01082可抑制J82細胞的增殖、遷移、侵襲并促進細胞凋亡，同時可以下調(diào)增殖促進蛋白Ki-67、遷移促進蛋白MMP-9和凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，上調(diào)凋亡促進蛋白Bax的表達。因此可以看出，LINC01082可能在膀胱癌中通過抑制細胞增殖、侵襲等行為發(fā)揮抑癌作用，而當(dāng)其由于某些機制被下調(diào)時，可能間接導(dǎo)致膀胱癌的惡性進展。

miRNAs是一類堿基序列長度為18～23個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，可通過結(jié)合下游靶基因的3′非翻譯區(qū)導(dǎo)致基因降解或翻譯受阻來調(diào)控mRNA表達，從而影響細胞增殖、侵襲和凋亡等生物學(xué)過程。已有多種miRNA被報道與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[12]。例如miR-539可通過靶向調(diào)控IGF-1R表達抑制膀胱癌細胞增殖和侵襲[13]；miR-3622a可通過靶向下調(diào)LASS2表達促進膀胱癌細胞增殖和侵襲[14]。miR-543是miRNAs家族成員之一，有研究證實miR-543在前列腺癌中表達水平較高，且可通過靶向RKIP促進癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[15]；miR-543在非小細胞肺癌中也存在異常高表達，且通過靶向MATA1促進腫瘤細胞增殖并抑制細胞凋亡[16]。還有研究證實，miR-543在膀胱癌組織和細胞中也存在表達水平升高，具有促進膀胱癌細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用[6]。本研究進一步證實了上調(diào)miR-543后可促進膀胱癌J82細胞增殖、遷移、侵襲并抑制其凋亡，在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要促進作用，與現(xiàn)有關(guān)于miR-543發(fā)揮促癌作用的研究結(jié)論一致。lncRNA往往通過與miRNA結(jié)合充當(dāng)內(nèi)源性海綿，抑制miRNA表達，參與包括惡性腫瘤在內(nèi)的生理、病理過程[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中LINC01082表達與miR-543表達呈負相關(guān)，上調(diào)LINC01082可使膀胱癌J82細胞中miR-543表達降低；采用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，LINC01082序列上存在著能夠與miR-543結(jié)合的核苷酸序列；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測發(fā)現(xiàn)，miR-543模擬物可使轉(zhuǎn)染野生型LINC01082質(zhì)粒的細胞熒光素酶活性降低，提示miR-543是LINC01082的靶向結(jié)合miRNA。因此推測LINC01082是通過miR-543發(fā)揮抑癌作用。在上調(diào)LINC01082的基礎(chǔ)上，我們轉(zhuǎn)染了miR-543模擬物以進行挽救實驗，結(jié)果顯示，上調(diào)LINC01082對膀胱癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響作用被逆轉(zhuǎn)，提示LINC01082是通過靶向下調(diào)miR-543表達發(fā)揮抑制膀胱癌的作用。

本研究初步揭示了LINC01082在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中的抑癌作用，并可通過調(diào)控miR-543的表達抑制癌細胞的增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)凋亡。該結(jié)果進一步豐富了膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，為膀胱癌的治療提供了新的線索和突破點。但本研究對于miR-543的下游靶向mRNA尚未進行研究，因此在下一步的研究工作中，會持續(xù)探索LINC01082相關(guān)調(diào)控機制軸的分子通路。