基于GEO數(shù)據(jù)集篩選良性前列腺增生的關(guān)鍵基因及信號通路

危鵬宇 林東旭 羅長城 張夢陽 陳亮 張加橋 袁慧星 陳忠

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia, BPH)是一種常見的老年男性疾病，表現(xiàn)為前列腺組織學(xué)增生和體積增大，以及繼發(fā)的下尿路癥狀(lower urinary tract symptoms, LUST)。其患病率高，且隨年齡增長，約有50%的男性在60歲時出現(xiàn)BPH引起的癥狀，到80歲時可增加到80%左右[1]。LUST包括尿頻、尿急、夜尿、尿失禁和尿潴留等，給患者的生活質(zhì)量造成極大影響，同時也給社會帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。

BPH的病理、生理機(jī)制仍不完全清楚，目前的觀點認(rèn)為性激素比例失調(diào)、慢性炎癥狀態(tài)、前列腺干細(xì)胞分化、前列腺胚胎再喚醒等可能與BPH的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]；高血壓、糖尿病等慢性疾病常被認(rèn)為是BPH的風(fēng)險因素[4]，但具體涉及到該疾病發(fā)生、發(fā)展的基因與信號通路仍有許多未知。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，生物信息學(xué)技術(shù)被越來越多的研究人員用于探究各類疾病在基因等層面的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。然而，針對BPH發(fā)病機(jī)制的生物信息學(xué)研究仍比較缺乏。目前以BPH和Bioinformatics為關(guān)鍵詞在美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)中檢索，僅能檢索到一篇關(guān)于BPH的生物信息學(xué)文章，且該研究選取的樣本只包含2例BPH及2例正常對照樣本，該研究樣本量過少，代表性較差[5]。本研究收集了基因表達(dá)匯編(Gene Expression Omnibus, GEO)數(shù)據(jù)庫中比較BPH與正常前列腺樣本的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE7307(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE7307)與GSE119195[6]；其中，GSE7307包含7個BPH樣本和6個正常對照樣本，GSE119195包含5個BPH樣本和3個正常對照樣本，且GSE119195是目前GEO數(shù)據(jù)庫中唯一一個只研究BPH與正常對照的數(shù)據(jù)集，具有較好的代表性。我們試圖通過生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)與BPH發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因及通路，以期更好地了解BPH的病因，并為改善BPH診斷和治療提供新的思路和靶點。

對象與方法

一、資料來源

本研究中使用的數(shù)據(jù)集均來自NCBI公共數(shù)據(jù)平臺的 GEO 數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。以Benign Prostatic Hyperplasia、BPH、Normal為關(guān)鍵詞，物種限定在智人，數(shù)據(jù)類型為基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，共檢索到16個數(shù)據(jù)集。在排除了研究前列腺癌與BPH、藥物作用前后、BPH不同細(xì)胞間后，最終納入數(shù)據(jù)集GSE7307與GSE119195[6]進(jìn)行分析。

二、數(shù)據(jù)預(yù)處理和差異基因(differential expression genes, DEGs)分析

在GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE7307、GSE119195數(shù)據(jù)集。利用RStudio 1.2.5033(https：//rstudio.com/)處理數(shù)據(jù)。將表達(dá)值進(jìn)行l(wèi)og2變換后，根據(jù)相應(yīng)芯片平臺進(jìn)行基因備注，其中無備注的探針刪除，多個探針對應(yīng)一個基因時，只保留平均值最大的探針。然后利用Limma 3.46.0(http：//bioinf.wehi.edu.au/limma)分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，利用Hclust、PCA分析觀察樣本是否符合分組，最后用Limma 3.46.0以|log2FC|>1和P<0.05為篩選條件分別進(jìn)行DEGs篩選[7]，隨后用在線韋恩圖工具(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取兩個數(shù)據(jù)集DEGs交集進(jìn)行之后的分析。

三、基因本體論(gene ontology, GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析

利用Cytoscape 3.8.2[8]中的 ClueGO 2.5.7[9]插件對DEGs進(jìn)行GO富集分析及數(shù)據(jù)可視化，以P≤0.05，卡帕系數(shù)>0.4為篩選條件；利用RStudio 1.2.5033中ClusterProfiler 3.18.0(http：//dx.doi.org/10.1089/omi.2011.0118)對DEGs進(jìn)行 KEGG通路富集分析及數(shù)據(jù)可視化，以P≤0.05，q≤0.05為篩選條件。

四、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction, PPI)構(gòu)建及關(guān)鍵基因分析

本研究通過STRING數(shù)據(jù)庫(http：//www.string-db.org/)構(gòu)建DEGs的PPI，以互作評分>0.4分，去掉無連接的節(jié)點構(gòu)建[10]。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行可視化和關(guān)鍵基因篩選。cytoHubba 0.1插件中包括最大集團(tuán)中心度(maximal cliquecentrality, MCC)、最大鄰域組件分量(density of maximum neighborhood component, DMNC)、度(degree)、邊緣滲透分量(edge percolated component, EPC)等10種關(guān)鍵基因的算法，為了提高預(yù)測的可靠性，比較不同算法得到的關(guān)鍵基因，以重復(fù)出現(xiàn)最多的為最終結(jié)果。

五、關(guān)鍵基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及miRNA預(yù)測

利用NetworkAnalyst 3.0[11]預(yù)測可能與關(guān)鍵基因相互作用的轉(zhuǎn)錄因子及miRNA。其中預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子使用的是ENCODE數(shù)據(jù)庫(https：//www.encodeproject.org/)的數(shù)據(jù)，篩選條件為峰值強(qiáng)度系數(shù)<500，預(yù)測調(diào)節(jié)電位評分<1分；miRNA使用的是miRTarBase數(shù)據(jù)庫(http：//mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/)的數(shù)據(jù)。

結(jié) 果

一、BPH與正常對照樣本DEGs篩選

從GEO數(shù)據(jù)庫下載的兩個數(shù)據(jù)集，其中數(shù)據(jù)集GSE119195共包含5個BPH樣本和3個正常對照樣本，GSE7307包含7個BPH樣本和6個正常對照樣本。為了使DEGs有更好的普遍性，分別進(jìn)行DEGs分析后利用韋恩圖取交集。GSE119195 DEGs篩選后結(jié)果顯示有63個上調(diào)基因，122個下調(diào)基因；GSE7307 DEGs篩選后結(jié)果顯示有567個上調(diào)基因，590個下調(diào)基因。對兩個數(shù)據(jù)集結(jié)果繪制韋恩圖(圖1)，顯示有36個共同的上調(diào)DEGs，45個下調(diào)DEGs，具體結(jié)果見表1。

表1 兩個數(shù)據(jù)集共同的DEGs

圖1 兩個數(shù)據(jù)集的DEGs韋恩圖

二、對DEGs進(jìn)行功能富集分析

對81個DEGs進(jìn)行了GO分析和KEGG通路分析。GO富集顯示DEGs主要集中在干細(xì)胞負(fù)性增殖調(diào)控、乙醇初步代謝、維生素效應(yīng)等15個生物過程(表2，圖2)。而KEGG的結(jié)果(圖3)顯示主要集中在Hippo信號通路、腎素分泌、PPAR信號通路等10條通路。

表2 DEGs GO分析結(jié)果

注：圓形代表富集到的條目;連線代表兩個GO富集條目之間存在相同的DEGs；圖形越大表明富集到的基因數(shù)目越多

注：形狀大小反映富集在該通路的基因數(shù)目，顏色反映P值大小

三、DEGs構(gòu)建PPI

DEGs在STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI后再在Cytoscape中可視化，共顯示有52個節(jié)點，67條連線(圖4)，隨后利用cytoHubba的不同計算方法各取前5的關(guān)鍵基因(表3)，以不同方法中出現(xiàn)次數(shù)最多的5個關(guān)鍵基因作為最終的關(guān)鍵基因，即CCL2、LPL、VCAN、IGF1、WNT2。

表3 不同計算方法得到前5的關(guān)鍵基因

注：圓形代表基因；紫色為下調(diào)基因；紅色為上調(diào)基因；連線代表兩基因間存在相互作用

四、利用數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及miRNA預(yù)測

將關(guān)鍵基因輸入NetworkAnalyst在線分析工具進(jìn)行關(guān)鍵基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(圖5)及miRNA預(yù)測(圖6)，其中ZNF2、ZNF501能同時參與調(diào)控VCAN、LPL兩個關(guān)鍵基因；hsa-mir-129-5p同時參與調(diào)節(jié)VCAN、IGF1，hsa-mir-29a-3p同時參與調(diào)節(jié)IGF1、LPL，hsa-mir-155-5p同時參與調(diào)節(jié)LPL、CCL2，hsa-mir-1-3p、hsa-mir-24-3p、hsa-mir-26b-5p、hsa-mir-98-5p同時參與調(diào)節(jié)CCL2、IGF1。

注：深藍(lán)色菱形代表下調(diào)基因；紅色菱形代表上調(diào)基因；淺藍(lán)色菱形代表預(yù)測得到的可能與關(guān)鍵基因相互作用的轉(zhuǎn)錄因子

注：深藍(lán)色菱形代表下調(diào)基因；紅色菱形代表上調(diào)基因；淺藍(lán)色菱形代表預(yù)測得到的可能與關(guān)鍵基因相互作用的miRNA

討 論

BPH的病理表現(xiàn)在不同患者間有很大的差異，有的以間質(zhì)增生為主、有的以腺上皮增生為主、有的兩者均有，病理表現(xiàn)不同的患者對一線藥物的反應(yīng)性差異很大，而產(chǎn)生病理異質(zhì)性的原因在于BPH是一個多因素疾病[12]。因此，當(dāng)前對于BPH，根據(jù)不同病因和病理表現(xiàn)實施個性化的治療是十分重要的。近幾十年來為了找出BPH不同病理表現(xiàn)背后的關(guān)鍵致病機(jī)制，進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)及臨床研究，但其具體的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制目前仍不完全明確。

本研究盡可能收集了目前已公開的相關(guān)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，試圖通過基因表達(dá)的差異來分析那些尚未明了的BPH發(fā)病機(jī)制，為后續(xù)的BPH個性化治療研究提供思路。本研究共發(fā)現(xiàn)36個上調(diào)DEGs，45個下調(diào)DEGs。GO分析發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集于干細(xì)胞負(fù)性增殖調(diào)控、乙醇初步代謝、維生素效應(yīng)等生物學(xué)過程，KEGG主要富集于Hippo信號通路、腎素分泌、PPAR信號通路等信號通路；最終得到CCL2、LPL、VCAN、IGF1、WNT2這5個關(guān)鍵基因。我們通過查閱文獻(xiàn)試圖明確這5個關(guān)鍵基因與BPH病理生理機(jī)制的相關(guān)性，為BPH的病因研究提供一定的基礎(chǔ)(圖7)。

圖7 文章思路圖

5個關(guān)鍵基因中IGF1與BPH的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系已有較多文獻(xiàn)支持[14-18]。IGF1作為一種重要的生長因子，通過激活PI3K-AKT/PKB和Ras-MAPK通路，廣泛參與細(xì)胞的增殖、遷移，生長和凋亡[13]，同時其結(jié)構(gòu)與胰島素相似，能表現(xiàn)出部分胰島素的功能，如促進(jìn)葡萄糖吸收、糖原合成等。有研究證實血漿IGF1水平高的男性患BPH的風(fēng)險顯著升高，反之IGFBP-3(胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白，能與IGF1結(jié)合，抑制其與靶細(xì)胞結(jié)合發(fā)揮作用)水平高的男性患BPH的風(fēng)險顯著降低[14]。研究證實BPH患者前列腺組織中IGF1和IGF2基因表達(dá)明顯上調(diào)，且與前列腺體積相關(guān)[15]。另一研究證實IGF1/Akt/β-catenin信號軸對睪酮誘導(dǎo)的大鼠BPH有促進(jìn)作用[16]；IL-1可通過IGF1通路介導(dǎo)前列腺的炎性增生[17]；5α還原酶抑制劑通過抑制睪酮轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮是治療BPH常用的藥物，長期使用5α還原酶抑制劑后BPH患者的前列腺成纖維細(xì)胞IGF1水平下降，從而上調(diào)前列腺成纖維細(xì)胞自噬水平[18]。

VCAN與BPH的相關(guān)性有文獻(xiàn)報道，但仍需進(jìn)一步驗證。它負(fù)責(zé)編碼多種細(xì)胞外基質(zhì)，它們在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)組成外，還參與細(xì)胞黏附、分化和存活[19]。有研究發(fā)現(xiàn)在BPH患者的前列腺中VCAN表達(dá)明顯增加[20]。TGF-β通過調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞的增殖、生長、分化和凋亡等多個過程參與BPH的發(fā)生、發(fā)展[21]，它作用于前列腺間質(zhì)細(xì)胞后會促使VCAN在間質(zhì)的積累[22]。此外有研究報道VCAN能激活Toll樣受體，從而促進(jìn)腫瘤炎性微環(huán)境產(chǎn)生[23]，而同樣有文獻(xiàn)報道炎癥微環(huán)境與BPH發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性[24-25]，因此我們猜測VCAN可作為TGF-β下游分子，通過參與炎癥微環(huán)境的形成，促進(jìn)BPH進(jìn)展。

雖然目前尚無直接關(guān)于BPH與生長因子家族成員之一WNT2的研究，但是β-catenin作為WNT2下游的轉(zhuǎn)錄因子，已有文獻(xiàn)報道其能促進(jìn)前列腺細(xì)胞良性增生[26]。WNT2參與的主要通路包括典型的WNT2/β-catenin通路與非典型的WNT2/Ca2+、PCP、WNT2/JNK和 WNT/Rho 等通路。這些通路的靶基因包括c-Myc、Cyclin D1、Cox-2、Cox-9、AR等，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增殖、凋亡等多個生理過程[27]。因此我們推測WNT2通路參與BPH的發(fā)生、發(fā)展。

LPL和趨化因子CCL2與BPH的關(guān)系暫無文獻(xiàn)報道，但這兩個基因都參與代謝綜合征(metabolic syndrome, MetS)的發(fā)生、發(fā)展。MetS指包括中樞性肥胖、血脂異常、高血壓、胰島素抵抗和葡萄糖耐受不良等代謝異常的綜合征，該病在老年人群中十分常見[28]。越來越多的文獻(xiàn)報道MetS與BPH的發(fā)生密切相關(guān)[4,29]。

LPL負(fù)責(zé)編碼脂蛋白脂肪酶，與肝胰脂肪酶屬于同一基因家族[30]。其主要負(fù)責(zé)水解脂蛋白，促進(jìn)脂肪代謝，是能量代謝的關(guān)鍵酶之一。對MetS患者的內(nèi)臟脂肪LPL表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，MetS患者的LPL基因甲基化程度較重，伴有LPL的表達(dá)量降低，說明LPL的表達(dá)異常和MetS的發(fā)生特別是肥胖密切相關(guān)[31]。而有文獻(xiàn)報道肥胖與前列腺體積增大、LUST風(fēng)險增加呈正相關(guān)，同時減肥能在一定程度上降低患BPH的風(fēng)險及LUST癥狀的嚴(yán)重程度[32]。

CCL2是參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程中分泌蛋白超家族一員[33]。該分子主要由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，通過招募單核巨噬細(xì)胞廣泛參與炎癥和腫瘤的病理、生理過程[34]。目前有大量文獻(xiàn)報道CCL2與慢性前列腺炎相關(guān)[35-36]。同時CCL2也參與MetS的病理、生理過程[37]，研究證實CCL2能通過降低大鼠脂肪組織對胰島素的敏感性，可能直接參與脂肪組織胰島素抵抗的形成[38]。但在前列腺局部，研究證實胰島素會促進(jìn)BPH的進(jìn)展[15,29]，因此推測前列腺組織中CCL2表達(dá)水平的降低可能會使前列腺上皮對胰島素敏感性增加，促進(jìn)BPH進(jìn)展。

綜上所述，得到的關(guān)鍵基因中IGF1、LPL、CCL2可能通過影響前列腺物質(zhì)、能量代謝水平參與BPH的發(fā)生、發(fā)展，而VCAN參與炎癥對BPH的影響，WNT2是影響B(tài)PH的生長因子之一。本研究利用生物信息學(xué)方法，對GEO數(shù)據(jù)庫中與BPH相關(guān)的數(shù)據(jù)集進(jìn)行二次挖掘，篩選出了可能參與BPH發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵基因及相關(guān)通路，這些基因可能有助于對BPH病因的研究。但其具體作用還有待進(jìn)一步的基礎(chǔ)及臨床研究驗證。值得注意的是，由于目前利用測序技術(shù)研究BPH病理生理的文章較少，本文使用的數(shù)據(jù)集中BPH組總病例數(shù)為12例，對照組為9例，病例數(shù)不足可能對結(jié)果的可靠性有一定影響。同時本研究為純粹的生物信息研究，其結(jié)論缺少實驗結(jié)果支撐，對可靠性有一定影響，但目前我們沒有BPH患者和相應(yīng)對照的前列腺樣本，擬在以后收集相關(guān)樣本以驗證本研究所得結(jié)論。