調(diào)控Dicer1影響宮頸癌細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)特征

趙璨 何登

宮頸癌是目前最為常見的婦科惡性腫瘤之一，占全球女性腫瘤發(fā)病率和死亡率第4位，2018年統(tǒng)計全球新發(fā)病例570 000例，死亡近311 000例[1-2]。宮頸癌在35～55歲為高發(fā)年齡段，高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染是其發(fā)病的主要原因，而疾病的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)仍為患者的主要死亡原因，因此我們需要進(jìn)一步探查相應(yīng)潛在生物標(biāo)志物和作用位點，為宮頸癌診治提供相應(yīng)的新思路。

Dicer1作為雙鏈RNA 特異性核酸內(nèi)切酶，在miRNAs生成過程中起到關(guān)鍵作用[1]。Dicer1可將雙鏈RNA(dsRNA)和pre-miRNA剪切成小片段干擾RNA和miRNA而發(fā)揮相應(yīng)功能。既往研究表明Dicer1在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，能夠參與腫瘤組織的生成以及癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)行為，Dicer1表達(dá)的變化與肺癌、直腸癌、食管癌、乳腺癌以及前列腺癌等惡性腫瘤的發(fā)展和預(yù)后均密切相關(guān)[1]。本實驗組在前期研究結(jié)論的基礎(chǔ)之上，繼續(xù)通過對宮頸腫瘤組織和細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染調(diào)控 Dicer1，觀察Dicer1表達(dá)變化對宮頸腫瘤組織和細(xì)胞生物學(xué)的影響，為進(jìn)一步研究 Dicer1 在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及分子機制提供相應(yīng)依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞株培養(yǎng)

宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)細(xì)胞W12和S12 細(xì)胞用含10% 3T3細(xì)胞上清的 DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)；CaSki和C33A均用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。所有培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司。

二、組織標(biāo)本及抗體選擇

選取華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院手術(shù)標(biāo)本，包括 25例各級別CIN組織，病理標(biāo)本均由兩位以上病理學(xué)家診斷和審核。Anti-Dicer1抗體購自Abcam公司(貨號ab14601)，Western blot按 1∶500 稀釋于5%脫脂牛奶，免疫組化按1∶100 稀釋于0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液。

三、RT-PCR檢測Dicer1 mRNA表達(dá)

收集W12和S12細(xì)胞沉淀，加入1 ml TRIzol試劑(Invitrogen公司)，應(yīng)用苯酚氯仿抽提總RNA，Nanodrop儀器測定 RNA濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(TaKaRa公司，貨號K4707)逆轉(zhuǎn)錄mRNA成cDNA，置-20 ℃待用。引物序列：Dicer1上游為5′-TCGAGCCTCCATTGTTGGTC-3′，下游為5′-TAGC-ACTGCCTTCGTTTCGT-3′；GAPDH上游為5′-CC-ACTCCTCCACCTTTGAC-3′，下游為5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。All-in-one TM-qPCR Mix試劑盒(Genecopoeia公司，貨號B24WY0203)實時定量PCR檢測Dicer1基因表達(dá)。

四、Western blot檢測細(xì)胞系中Dicer1表達(dá)

收集W12與S12細(xì)胞沉淀，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30 min，裂解后12 000 r/min 離心，取上清提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配制8% SDS-PAGE凝膠，50 μg蛋白樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。Anti-Dicer1抗體按1∶500稀釋, GAPDH抗體按 1∶1 000 稀釋; 辣根過氧化氫酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗按1∶1 000稀釋。在Bio-Rad凝膠成像儀下電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒對PVDF膜進(jìn)行圖像采集與分析。

五、免疫組化測定宮頸病變組織Dicer1表達(dá)

取宮頸疾病譜組織組合芯片CR602和組織石蠟切片置烤箱 68 ℃烤片過夜，從環(huán)保脫蠟液至70%乙醇梯度脫水，0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)。Anti-Dicer1抗體(按1∶100稀釋)4 ℃孵育過夜；按兔鼠通用組化試劑盒步驟操作，DAB顯色5 min；蘇木素染核，中性樹脂封片；倒置相差顯微鏡觀察Dicer1表達(dá)情況并評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：無著色0分，淡黃色1分，淺黃色2分，棕黃色3分和棕褐色4分。

六、CCK-8法測定細(xì)胞增殖水平

制備S12細(xì)胞懸液，PBS漂洗細(xì)胞后更換為內(nèi)含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，加CCK-8，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h。細(xì)胞純化和培養(yǎng)后的S12細(xì)胞及Dicer1基因沉默S12細(xì)胞分別于48 h及72 h檢測450 nm吸光度水平。

七、細(xì)胞侵襲與遷移實驗

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液制成密度為2×10個/ml的單細(xì)胞懸液，將Transwell小室置于24孔板中。取Matrigel膠與無血清RPMI-1640培養(yǎng)液以1∶8比例稀釋包被于Transwell小室底部膜的上室面，置于37 ℃培養(yǎng)箱30 min使其凝固，水化后加入制備好的無血清細(xì)胞懸液200 μl，下室加入10%胎牛血清培養(yǎng)液600 μl，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育0、12、24、36、48、72 h后取出固定染色，倒置顯微鏡觀察穿過Transwell小室底部膜的下室面細(xì)胞，隨機選取5個低倍視野并計數(shù)。

取對數(shù)生長期的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液制成密度為2×10個/ml的單細(xì)胞懸液，將Transwell小室置于24孔板中。Transwell小室上室加入制備好的細(xì)胞懸液200 μl，下室加入帶血清培養(yǎng)液600 μl，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育0、12、24、36、48、72 h后取出固定染色，倒置顯微鏡觀察穿過Transwell小室底部膜的下室面細(xì)胞，隨機選取5個低倍視野并計數(shù)。

八、統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Graphpad Prism 5軟件作圖，計量資料采用Fisher精確檢驗及t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CIN組織Dicer1與HPV L1蛋白表達(dá)差異

本研究收集了25例宮頸癌前病變患者宮頸局部病變組織，通過免疫組化分別測定患者Dicer1及HPV L1表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)15例患者同時存在Dicer1和HPV L1表達(dá)，7例患者Dicer1和HPV L1均為陰性，2例患者Dicer1陰性而HPV L1陽性，1例患者Dicer1和HPV L1均為陰性。通過卡方檢驗χ2=10.45，P=0.001，F(xiàn)isher精確檢驗P=0.000 5。提示Dicer1蛋白表達(dá)量與HPV感染具有相關(guān)性(圖1)。

圖1 CIN組織Dicer1表達(dá)與HPVL1蛋白表達(dá)相關(guān)(蘇木素染核，×50，×200)

二、CIN組織HPV感染程度與Dicer1表達(dá)量相關(guān)性

通過免疫組化檢查，我們發(fā)現(xiàn)HPV陽性患者的宮頸CIN組織Dicer1表達(dá)量明顯高于HPV陰性及病變旁宮頸組織(圖2A)，且隨著CIN等級逐漸上升，Dicer1表達(dá)量逐漸增加(圖2B)。

A：HPV陽性患者的CIN組織Dicer1表達(dá)量明顯高于HPV陰性患者；B：隨著CIN級別增加，Dicer1表達(dá)量亦逐漸增加。

三、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CIN細(xì)胞系(W12、S12)及宮頸癌細(xì)胞系(CaSki、C33A)下調(diào)Dicer1基因結(jié)果

抑制Dicer1基因可明顯增加W12細(xì)胞HPV E2和E6 mRNA蛋白表達(dá)，提示W(wǎng)12惡性程度增加，抑制Dicer1后，W12細(xì)胞HPV E2 mRNA表達(dá)量前后分別為0.31±0.05、0.59±0.11，t=-4.58，P=0.04。提示Dicer1對宮頸組織具有一定保護(hù)作用(圖3A)。當(dāng)S12、CaSki、C33A細(xì)胞系的Dicer1基因下調(diào)時，沉默后(Shdicer水平)相對沉默前(NC水平)，S12、CaSki細(xì)胞系E6蛋白表達(dá)量明顯增加，而C33A中E6表達(dá)量無明顯差異，此外S12、CaSki細(xì)胞系抑癌基因P53、Rb和P21相應(yīng)蛋白表達(dá)量明顯降低，而在C33A中表達(dá)亦無明顯差異(圖3B)。抑制S12細(xì)胞系Dicer1基因可下調(diào)P53、P21 mRNA表達(dá)，其對Rb mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義，此外E6及E7 mRNA表達(dá)量亦明顯降低(圖3C)。Dicer1抑制前后，S12細(xì)胞Rb mRNA表達(dá)量分別為0.98±0.02、1.02±0.10，t=-0.63，P=0.59；P53 mRNA 表達(dá)量分別為1.01±0.16、0.59±0.09，t=11.27，P=0.008；P21 mRNA表達(dá)量分別為0.64±0.09、0.47±0.04，t=9.47，P=0.001；HPV E6 mRNA表達(dá)量分別為1.01±0.46、0.58±0.02，t=2.14，P=0.03；HPV E7 mRNA表達(dá)量分別為1.10±0.17、0.32±0.11，t=26.43，P=0.002。

四、CIN細(xì)胞系S12增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移實驗

通過CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)，抑制S12細(xì)胞系Dicer1基因，隨著時間增加，S12細(xì)胞系A(chǔ)450逐漸增加，Dicer1抑制48 h前后S12細(xì)胞A450分別為0.31±0.08、0.41±0.12，t=-0.45，P=0.05；而72 h水平S12細(xì)胞A450前后分別為0.46±0.11，0.94±0.27，t=-5.196，P=0.04。提示細(xì)胞的惡性程度有所提高，且在48 h和72 h與沉默前相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3D)，圖3E結(jié)果提示抑制S12細(xì)胞Dicer1可明顯增強細(xì)胞的侵襲性及轉(zhuǎn)移能力。

A：RT-PCR檢測抑制Dicer1對W12細(xì)胞HPV E2和E6的影響；B：Western blot檢測抑制Dicer1對宮頸腫瘤細(xì)胞HPV E6及抑癌基因的作用；C：RT-PCR檢測S12細(xì)胞下調(diào)Dicer1對抑癌基因和HPV E6、E7在mRNA水平的影響；D：抑制Dicer1基因?qū)12細(xì)胞增殖的影響；E：抑制Dicer1基因?qū)12細(xì)胞侵襲性和遷移性的作用(結(jié)晶紫染色，×50)

討 論

宮頸癌是女性較常見的疾病，隨著宮頸脫落細(xì)胞篩查、HPV檢查和HPV疫苗逐漸普及，宮頸癌的發(fā)病率及死亡率已逐漸降低。盡管我們的診治能力提高,但超過一半的患者在發(fā)現(xiàn)時已出現(xiàn)局部浸潤擴散或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其5年生存率仍低于20%[1-2]。因此進(jìn)一步探究宮頸癌的發(fā)病機制仍是認(rèn)識這一疾病的關(guān)鍵。

高危型HPV病毒與宮頸宿主細(xì)胞整合是宮頸癌病理發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵過程，其涉及多階段和多基因異常調(diào)控[2]，其作用機制是HPV病毒整合到宿主細(xì)胞基因組后干擾E2基因表達(dá)，削弱E2基因?qū)6、E7基因轉(zhuǎn)錄抑制作用，使P53和Rb失活，同時使E6、E7致癌基因過表達(dá)[3]，從而破壞細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)信號傳導(dǎo)通路，此外E5癌蛋白參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)損害作用，也影響感染細(xì)胞凋亡過程，最終導(dǎo)致細(xì)胞永生化引起癌變[4]。

HPV感染宮頸宿主細(xì)胞包括多種miRNA調(diào)節(jié)變化[5]。在細(xì)胞代謝、增殖、分化和凋亡的信號分子調(diào)節(jié)過程中miRNA極為重要，其可識別相應(yīng)目標(biāo)mRNA，且在轉(zhuǎn)錄后通過靶mRNA的降解下調(diào)以及抑制翻譯過程而負(fù)反饋調(diào)控目的基因表達(dá)，從而形成類似癌基因或抑癌基因的功能，參與各類腫瘤的病理學(xué)機制。目前發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中有97類miRNA表達(dá)上調(diào)，而同時有47類miRNA表達(dá)下調(diào)或沉默。miRNA表達(dá)差異有助于臨床區(qū)分腫瘤和正常組織類型，亦能鑒別腫瘤類型、分期以及其他臨床特征[5-6]。Dicer1作為核糖核酸酶Ⅲ家族成員，可將dsRNA和 pre-miRNA剪切成小片段干擾RNA和miRNA。miRNA在宮頸癌的臨床意義顯著，然而Dicer1在宮頸癌病理發(fā)生、發(fā)展的分子機制及臨床意義的研究較少。Dicer1突變或缺失可引起胸膜肺母細(xì)胞瘤、囊性腎腫瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤、卵巢支持細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞腫瘤等[7-9]。Dicer1表達(dá)對肺癌、食管癌和卵巢癌等多種腫瘤的預(yù)后有顯著影響，然而Dicer1在宮頸癌細(xì)胞和組織的表達(dá)研究較少且存有一定爭議。有研究認(rèn)為Dicer1 mRNA在宮頸癌和癌旁組織中的表達(dá)較正常宮頸組織低[10]。此外也有文獻(xiàn)報道，宮頸癌組織中Dicer1的蛋白水平和mRNA水平亦不一致，該研究在蛋白水平上揭示了FIGO分期Ⅰ-Ⅱ和Ⅲ-Ⅳ期宮頸癌組織中Dicer1蛋白表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Dicer1表達(dá)亦與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)[11]。

本研究前期也發(fā)現(xiàn)正常宮頸上皮組織中Dicer1蛋白表達(dá)較低，同時在宮頸癌分化程度較好的組織中表達(dá)較高，然而在惡性程度更高的宮頸癌組織中反而表達(dá)較低，提示基因mRNA和蛋白表達(dá)水平不一致也是常見的分子現(xiàn)象。另外我們先前曾報道了Dicer1表達(dá)與宮頸癌組織病理分級相關(guān)，在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中惡性程度越高其表達(dá)越低[7]。正常宮頸上皮中，Dicer1表達(dá)量較低，而HPV感染的宮頸上皮Dicer1表達(dá)量增加，并隨著CIN的進(jìn)展，其表達(dá)量逐漸增加。據(jù)此分析Dicer1表達(dá)量可能與HPV感染密切相關(guān)，HPV感染宮頸上皮后，Dicer1蛋白可能直接或間接(生成 miRNA)參與防御HPV病毒感染。本文在上述研究基礎(chǔ)之上進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Dicer1蛋白表達(dá)量與HPV L1感染具有相關(guān)性，此外質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CIN細(xì)胞系(W12、S12)及宮頸癌細(xì)胞系(CaSki、C33A)下調(diào)Dicer1基因結(jié)果為：抑制Dicer1可明顯增加W12細(xì)胞HPV E2和E6 mRNA蛋白表達(dá)，W12細(xì)胞惡性程度增加，P53、Rb及P21基因在Dicer1下調(diào)后均有降低，提示Dicer1與抑癌基因可能具有協(xié)同作用，而Dicer1對宮頸組織具有一定保護(hù)作用，而且通過CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)，抑制S12細(xì)胞系Dicer1基因，隨著時間增加，S12細(xì)胞系A(chǔ)450逐漸增加，提示細(xì)胞侵襲性、遷移性均提高。因此，我們考慮在宮頸惡性腫瘤發(fā)病過程中，Dicer1基因具有抵抗腫瘤細(xì)胞進(jìn)展的作用，本文為研究Dicer1在宮頸癌中的作用及分子機制提供一定依據(jù)，我們下一步研究將增加樣本量、補充臨床資料和腫瘤分子生物學(xué)研究。