lncRNA MALAT1/miR-101-3p/SMAD2分子軸調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究

陳小麗 黃 達(dá) 吳碧瑩 馮清春（?？谑械谌嗣襻t(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，?？?571100）

膠質(zhì)瘤是大腦中最常見的原發(fā)性腫瘤，即使采用手術(shù)、放射和化療等綜合治療，患者的五年生存率仍小于5%［1-2］。研究報(bào)道，膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）的增加導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性增加［3］。因此，探究膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT發(fā)展進(jìn)程的分子機(jī)制十分重要。證據(jù)表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）可以調(diào)控癌細(xì)胞EMT進(jìn)程，如李娟等［4］報(bào)道，lncRNA GAS5可阻斷乳腺癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程。研究表明，MALAT1作為促癌基因能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活力及腫瘤發(fā)生［5］，且MALAT1表達(dá)在體內(nèi)可受到多種因素的影響，如YANG等［6］報(bào)道，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可通過分泌外泌體使膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)升高。但關(guān)于MALAT1調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT的機(jī)制研究較少。lncRNA可通過調(diào)控下游靶miRNAs影響癌細(xì)胞EMT。如MALAT1下調(diào)miR-1-3p促進(jìn)食管癌細(xì)胞EMT進(jìn)程［7］。文獻(xiàn)報(bào)道，miR-101-3p的表達(dá)在膠質(zhì)瘤中被抑制，且miR-101-3p可通過抑制EMT進(jìn)程抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［8］。但未有MALAT1/miR-101-3p/SMAD2分子軸調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究將從細(xì)胞水平探討MALAT1通過調(diào)控miR-101-3p/SMAD2影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料 本研究收集2015年5月至2018年6月?？谑械谌嗣襻t(yī)院收治的病例資料完整的膠質(zhì)瘤患者35例，并通過手術(shù)切除膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織，清洗干凈迅速保存于液氮中。入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)頭顱CT和MRI檢查確診為膠質(zhì)瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)過放化療的患者；不同意采集樣本和手術(shù)不耐受的患者；有免疫系統(tǒng)疾病的患者。所有研究對(duì)象對(duì)本研究均簽署知情同意書，本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251（貨號(hào)：BNCC337874）、SHG-44（貨號(hào)：BNCC338187）和HS683（貨號(hào)：BNCC339564）以及人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA（貨號(hào)：BNCC341796）均購(gòu)自北納生物；pcDNA3.1-MALAT1、si-MALAT1、miR-101-3p mimics、陰 性 寡 核苷酸以及pcDNA3.1-SMAD2均購(gòu)自上海吉瑪公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；全蛋白提取試劑盒和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DMEM、胎牛血清以及青-鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine 2000和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；CCK-8試劑盒和免疫印跡一抗和二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；Transwell小室均購(gòu)自美國(guó)康寧公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海漢恒生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞均培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)，使用胰酶消化U251細(xì)胞，并接種至6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書分別將pcDNA3.1-MALAT1、si-MALAT1、miR-101-3p mimics、陰性寡核苷酸以及pcDNA3.1-SMAD2混合轉(zhuǎn)染到U251細(xì)胞中，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中MALAT1及miR-101-3p表達(dá) 按照總RNA提取試劑盒說明書提取組織和細(xì)胞的總RNA，并測(cè)定其濃度和純度。隨后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的全部RNA反轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)定MALAT1和miR-101-3p的表達(dá)水平，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火35 s，72℃延伸10 s，共50個(gè)循環(huán)。檢測(cè)引物由昆明擎科生物科技有限公司合成，以U6作為內(nèi)參。檢測(cè)結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證MALAT1、miR-101-3p及SMAD2的靶向關(guān)系 利用生物信息預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)MALAT1、miR-101-3p和SMAD2的結(jié)合片段，用qRT-PCR擴(kuò)增MALAT1和SMAD2上與miR-101-3p的結(jié)合片段，并將該結(jié)合片段插入到pMIRREPORT載體中，構(gòu)建MALAT1和SMAD2野生型質(zhì)粒，再利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變，構(gòu)建MALAT1和SMAD2突變質(zhì)粒。然后用MALAT1和SMAD2野生質(zhì)粒及突變質(zhì)粒與miR-101-3p mimics分別或同時(shí)對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)各組熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8檢測(cè)U251細(xì)胞增殖活力 將各組待檢細(xì)胞傳代接種于96孔板中，每孔4×104個(gè)細(xì)胞，并培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，分別于培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d時(shí)向每孔加入10μl CCK-8溶液，然后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)每孔450 nm處的吸光度（OD）值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 Transwell檢測(cè)U251細(xì)胞遷移和侵襲能力將各組待檢細(xì)胞傳代培養(yǎng)于用基質(zhì)膠預(yù)先包被好的Transwell小室中，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，小室下層加入正常培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后用無菌棉簽擦去小室內(nèi)的細(xì)胞，首先用4%多聚甲醛固定，然后用結(jié)晶紫對(duì)侵襲至下層的細(xì)胞染色，每孔隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。遷移實(shí)驗(yàn)不鋪基質(zhì)膠。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot檢測(cè)SMAD2及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá) 用全蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞中的總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)各組蛋白濃度。10%SDSPAGE進(jìn)行蛋白條帶分離，半干法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋好的一抗（SMAD2，1∶1 000；E-cadherin，1∶1 000；N-cadherin，1∶1 000；Vimentin，1∶1 000；GAPDH，1∶1 500）4℃封閉過夜。次日棄去一抗，洗滌3次后加入1∶3 000稀釋的二抗室溫孵育2 h；棄去二抗，洗滌3次后滴加ECL化學(xué)發(fā)光劑，用凝膠成像系統(tǒng)采集蛋白條帶圖像，并用Image J對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件分析，圖片繪制采用GraphPad Prism 7軟件。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05或P＜0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MALAT1在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MALAT1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01，圖1A）；同時(shí)，MALAT1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U251、SNG-44和HS683）中的表達(dá)顯著高于人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA（P＜0.01，圖1B）。此外，MALAT1在U251細(xì)胞中的表達(dá)最高，選擇U251細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。因此，膠質(zhì)瘤發(fā)展可能與MALAT1異常表達(dá)相關(guān)。

圖1 MALAT1在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)Fig.1 MALAT1 was up-regulated in glioma tissues and cell lines

2.2 敲低MALAT1抑制U251細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT在U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-MALAT1或pcDNA 3.1-MALAT1，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示：于U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-MALAT1后，MALAT1的表達(dá)水平顯著降低，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MALAT1后，MALAT1的表達(dá)水平顯著增加（均P＜0.01，圖2A）。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，敲低MALAT1顯著抑制U251細(xì)胞增殖活力（P＜0.05，圖2B）。Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，沉默MALAT1后，U251細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著被抑制（P＜0.05，圖2C、D）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-MALAT1后，E-cadherin表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而N-cadherin和Vimentin表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.01，圖2E）。由此可知，敲低lncRNA MALAT1顯著抑制了U251細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT。

圖2 敲低MALAT1抑制U251細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMTFig.2 Knockdown of MALAT1 repressed proliferation，invasion，migration and EMT of U251 cells

2.3 miR-101-3p靶 向 結(jié) 合MALAT1和SMAD2的3'UTR通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)starBase和Target-Scan得知，miR-101-3p可結(jié)合MALAT1和SMAD2的3'UTR位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)如圖3A所示。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-101-3p可顯著降低野生型MALAT1和SMAD2質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度（P＜0.05或P＜0.01，圖3B）；而將結(jié)合位點(diǎn)突變后，過表達(dá)miR-101-3p不影響其突變型熒光強(qiáng)度（P＞0.05）。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：過表達(dá)MALAT1顯著抑制miR-101-3p表達(dá)（P＜0.01，圖3C）。Western blot結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-101-3p顯著抑制SMAD2表達(dá)（P＜0.01，圖3D）。因此，miR-101-3p可靶向結(jié)合MALAT1和SMAD2的3'UTR。

圖3 miR-101-3p靶向結(jié)合MALAT1和SMAD2的3'UTRFig.3 miR-101-3p targeted bind to 3'UTR of MALAT1 and SMAD2

2.4 MALAT1/miR-101-3p/SMAD2分子軸促進(jìn)U251細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT Western blot檢測(cè)pcDNA3.1-SMAD2轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后U251細(xì)胞中SMAD2表達(dá)顯著高于對(duì)照組U251（P＜0.01，圖4A）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-101-3p mimics后，miR-101-3p表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，圖4B）；但分別同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MALAT1和miR-101-3p mimics或miR-101-3p mimics和pcDNA3.1-SMAD2后，miR-101-3p表達(dá)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-101-3p mimics后U251細(xì)胞增殖活力顯著降低（P＜0.05或P＜0.01，圖4C）。Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-101-3p后，U251細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著低于對(duì)照組（P＜0.01，圖4D、E）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-101-3p后，E-cadherin表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；而N-cadherin和Vimentin表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.01，圖4F）。與此同時(shí)，回復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：MALAT1靶向下調(diào)miR-101-3p對(duì)SMAD2的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)U251細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT。因此，MALAT1通過下調(diào)miR-101-3p、上調(diào)SMAD2表達(dá)促進(jìn)U251細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT。

圖4 MALAT1/miR-101-3p/SMAD2分子軸促進(jìn)U251細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMTFig.4 MALAT1/miR-101-3p/SMAD2 axis promoted the proliferation，invasion，migration and EMT of U251 cells

3 討論

大量文獻(xiàn)證實(shí)，lncRNA可以調(diào)控包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)展進(jìn)程［9］。例如，lncRNA GAPLINC通過靶向SNAI2促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲［10］。MALAT1，即肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1，也稱為核濃縮轉(zhuǎn)錄本2，已被證實(shí)作為致癌基因在包括骨肉瘤、食管癌、甲狀腺癌等多種癌癥中可以促進(jìn)癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT等惡性生物學(xué)行為［11-12］。此外也有研究報(bào)道MALAT1在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)［13］，但具體作用機(jī)制尚不完全明確。本研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中均高表達(dá)，且敲低MALAT1可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、侵襲、遷移和EMT。

研究表明，lncRNA可通過調(diào)控下游靶miRNAs在腫瘤中發(fā)揮作用。例如，lncRNA HOXA11-AS通過靶向下調(diào)miR-214-3p促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲；lncRNA NEAT1可通過上調(diào)miR-200a-3p表達(dá)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的EMT過程［14］。同時(shí)大量研究證實(shí)miRNAs在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中也扮演重要角色。例如，miR-199a-5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)miR-199a-5p能夠抑制膠質(zhì)瘤發(fā)展；過表達(dá)miR-422a抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲［15-16］。miR-101-3p已被證實(shí)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中低表達(dá)，且能夠通過抑制EMT進(jìn)程抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和轉(zhuǎn)移［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-101-3p可靶向結(jié)合MALAT1的3'UTR，且MALAT1可通過下調(diào)miR-101-3p的表達(dá)水平促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT等惡性生物學(xué)行為。

眾所周知，miRNAs可在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平靶向調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。例如，miR-101-3p靶向下調(diào)Med19抑制乳腺癌發(fā)展進(jìn)程［12］；miR-101-3p靶向下調(diào)FOXP1的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生［18］。SMADs家族是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)重要基因家族，其中SMAD2屬于受體激活的SMADs，在多種腫瘤中異常表達(dá)［19］。且有文獻(xiàn)報(bào)道，降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中SMAD2的表達(dá)可以抑制膠質(zhì)瘤的致癌活性［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-101-3p可以靶向下調(diào)SMAD2的表達(dá)水平；回復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MALAT1能夠靶向下調(diào)miR-101-3p對(duì)SMAD2的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT。

綜上所述，MALAT1作為致癌基因在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，其通過靶向下調(diào)miR-101-3p、上調(diào)SMAD2的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程，為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。