天花粉蛋白聯(lián)合siPD-1促進卵巢癌細胞凋亡及機制研究①

鄒立君 胡律江（江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，撫州 344000）

卵巢癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，隱匿性強，發(fā)現(xiàn)時往往已發(fā)生腹腔浸潤和遠處轉(zhuǎn)移，患者五年生存率僅為35%。盡管當前醫(yī)療技術(shù)飛速發(fā)展，但卵巢癌患者發(fā)病及死亡情況均不容樂觀。2015年中國癌癥研究報告顯示，卵巢癌年新增發(fā)病人數(shù)約為5.2萬，年死亡人數(shù)達2.25萬［1］。異質(zhì)性是腫瘤最常見特征之一，也是導(dǎo)致卵巢癌治療困難的重要因素［2］?；A(chǔ)研究及臨床實踐均表明卵巢癌發(fā)病誘因多樣，多靶點藥物聯(lián)合治療效果更為顯著。

天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）是從傳統(tǒng)中藥葫蘆科植物栝樓塊根中分離提純的有效成分，是一種單鏈核糖體失活蛋白，具有RNA N-糖苷酶活性，具有較強的抗腫瘤活性［3-4］。大量研究證實TCS在多種腫瘤中發(fā)揮抑制作用，如在宮頸癌中，TCS可抑制癌細胞生長及增殖［5］；在非小細胞肺癌中，TCS可增強癌細胞對化療藥物的敏感性［6］；在卵巢癌中，TCS可促進癌細胞HO8910凋亡［7］。

程序性細胞死亡受體-1（programmed cell death-1，PD-1）是表達于免疫細胞表面的抑制性受體分子，通過與其配體PD-L1結(jié)合誘導(dǎo)已活化的T細胞凋亡，抑制T細胞活性，協(xié)助腫瘤細胞逃避機體免疫殺傷［8］。目前，PD-1抑制劑已成功開發(fā)，臨床用于多種惡性腫瘤治療，已取得較好療效和安全性［9-10］。TCS和PD-1抑制劑均可抑制腫瘤細胞生長，但二者聯(lián)合作用及機制尚未闡明。

本研究以卵巢癌細胞為研究對象，分析TCS和siPD-1對腫瘤細胞凋亡的影響及機制，同時考察TCS和siPD-1聯(lián)用對卵巢癌的治療效果，為卵巢癌治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人卵巢癌細胞株SKOV3購自中科院上海細胞所。

1.1.2 試劑RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司；雙抗（100μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素）購于碧云天生物技術(shù)有限公司；TCS購于上海金山制藥有限公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購 于美國Invitrogen公司；siPD-1購于安徽通用生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于Roche；Trizol購于天根生化科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit購于TaKaRa；Sun Shine Bio qPCR mix kit購于生興生物有限公司；Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9、β-actin等引物由上海啟因生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理SKOV3采用RPMI1640培養(yǎng)基（含10%FBS、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素）于37℃、5%CO2培養(yǎng)。胰酶消化對數(shù)生長期細胞，重懸，以1×105個/孔接種于6孔板，分為空白對照組：12 h后更換培養(yǎng)液，無任何藥物處理；TCS處理組：12 h后加入 含 不同濃度（20、40、60、80、100μg/ml）TCS的培養(yǎng)基，各濃度設(shè)3個復(fù)孔；TCS+siPD-1聯(lián)合處理組：12 h后加入含不同濃度（20、40、60、80、100μg/ml）TCS和不同濃度（60、80、100、120、150 nmol/L）siPD-1的培養(yǎng)基。siPD-1轉(zhuǎn)染按轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000說明書進行：取設(shè)定摩爾濃度的siPD-1與無血清RPMI1640混合至25μl，取1μl轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000與無血清RPMI1640混合至體積25μl，室溫靜置5 min，充分混合得到轉(zhuǎn)染物，室溫靜置20 min，逐滴滴入預(yù)先準備好的細胞中，37℃、5%CO2孵育6 h，更換含10%血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，1 200 r/min離心5 min收集細胞，提取總RNA，RT-PCR檢測PD-1基因敲減效率，各濃度設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)至24 h、48 h時分別收集3組細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測TCS、TCS/siPD1處理后卵巢癌細胞凋亡情況 按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明，采用不含EDTA的胰酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，預(yù)冷PBS緩沖液洗滌細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS緩沖液重懸細胞制成細胞懸液（1×106個/ml），取100μl細胞懸液加入10μg Annexin V輕輕混勻，室溫反應(yīng)15 min，再加入5μl PI，避光室溫孵育15 min，加入400μl PBS緩沖液，1 h內(nèi)流式細胞儀檢測。

1.2.3 RT-PCR檢 測SKOV3細胞Caspase-3級聯(lián) 相關(guān)凋亡分子mRNA表達0.25%胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞沉淀。加入1 ml Trizol溶液充分振蕩混勻，室溫靜置5 min使細胞充分裂解。每1 ml Trizol加入0.2 ml氯仿，蓋好管蓋劇烈振蕩15 s，室溫靜置3 min。按Trizol試劑盒說明提取總RNA。根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit說明配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，37℃5 min，42℃60 min，85℃5 s，采用SunShineBio qPCR mix kit將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行擴增，擴增條件為：95℃2 min熱激活，95℃15 s，60℃60 s，40個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-PCR

1.2.4 Caspase-3酶活性檢測 收集加藥處理的細胞，裂解，按Caspase-3酶活性檢測試劑盒說明書加入底物，檢測吸光度值，得到Caspase-3酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCS與siPD-1可誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細胞凋亡 與空白對照組相比，TCS處理后的卵巢癌SKOV3細胞凋亡率明顯升高，且TCS處理組細胞凋亡率隨TCS作用時間延長和濃度增加逐漸升高（P＜0.05），表明TCS可誘導(dǎo)卵巢癌細胞SKOV3凋亡（圖1A）。siPD-1單獨處理SKOV3細胞也可促進其凋亡。siPD-1處理組細胞凋亡率隨作用時間延長和濃度增加逐漸升高，當濃度100 nmol/L時，與空白對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1B）。

2.2 TCS與siPD-1協(xié)同促進卵巢癌SKOV3細胞凋亡 空白對照組24 h和48 h凋亡率較低。加入TCS/siPD-1 24 h后，不同濃度處理組凋亡率明顯升高，48 h凋亡率進一步升高。TCS+siPD-1對SKOV3細胞凋亡的影響呈劑量和時間依賴性。與TCS處理組相比，TCS+siPD-1處理組細胞凋亡率上升更為顯著（P＜0.05）。表明TCS可協(xié)同siPD-1促進卵巢癌細胞SKOV3凋亡（圖1C）。

圖1 TCS與siPD-1促進SKOV3細胞凋亡Fig.1 TCS and siPD-1 proluoted apoptosis of SKOV3 cell

2.3 TCS和siPD-1協(xié)同促進SKOV3細胞Caspase級聯(lián)分子mRNA表達 與空白對照組（PBS）相比，不同濃度TCS處理組、TCS/siPD-1處理組24 h和48 h SKOV3細胞Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達上升，且呈時間和劑量依賴性（P＜0.05）。TCS+siPD-1處 理 組Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達顯著高于TCS處理組（P＜0.05）。提示TCS和siPD-1聯(lián)用對Caspase-3相關(guān)凋亡基因表達影響更大（圖2）。

圖2 TCS及siPD-1誘 導(dǎo)SKOV3細 胞Caspase級 聯(lián) 分 子mRNA表達Fig.2 mRNA expressions of members in Caspase cascade response of SKOV3 cells induced by TCS and siPD-1

2.4 TCS和siPD-1協(xié)同促進SKOV3細胞Caspase-3酶活性 不同濃度TCS處理48 h，Caspase-3酶活性明顯增強，且呈劑量依賴性。TCS/siPD-1處理48 h，Caspase-3酶活性比TCS單獨使用時顯著增強。表明TCS協(xié)同siPD-1誘導(dǎo)Caspase-3酶活性（圖3）。

圖3 TCS及siPD-1增強SKOV3細胞Caspase-3酶活性Fig 3 TCS and siPD-1 promoted activity of Caspase-3 in SKOV3 cells

3 討論

卵巢癌是一類高發(fā)病率、高轉(zhuǎn)移、高致死率的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重威脅女性生命安全［11］。手術(shù)輔以鉑類藥物為主的化療是卵巢癌的傳統(tǒng)治療方法。但由于手術(shù)方法不成熟以及對鉑類藥物等化療藥物的耐藥性，卵巢癌細胞極易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后不良［12-14］。因此，急需探索可改善卵巢癌預(yù)后的新藥物和新的治療方法。

近年來中藥研究發(fā)現(xiàn)，多種傳統(tǒng)中藥含有具有明顯抗腫瘤活性的有效成分［15］。TCS是從傳統(tǒng)中藥葫蘆科植物栝樓塊根中分離提純的有效成分，是一種單鏈核糖體失活蛋白，具有RNA N-糖苷酶活性，具有抗菌抗病毒、增強免疫系統(tǒng)功能、終止妊娠等多種藥理作用［16］。近年研究發(fā)現(xiàn)，TCS可通過競爭結(jié)合真核細胞28 S rRNA核糖體抑制細胞蛋白合成，抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡，具有較強的抗腫瘤活性［17］。TCS通過調(diào)節(jié)Notch信號通路表達抑制鼻咽癌細胞CNE2增殖，誘導(dǎo)CNE2凋亡［18］。胃癌中，TCS能夠抑制胃癌細胞SGC7901磷酸化ERK表達，通過調(diào)節(jié)ERK信號通路誘導(dǎo)SGC7901細胞凋亡［19］。此外，TCS對黑色素瘤、宮頸癌、大腸癌、乳腺癌等均有明顯抑制作用［20-23］。但TCS對卵巢癌的作用及分子機制研究較少。

PD-1是免疫球蛋白超家族成員，主要表達于活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞及NK細胞表面［24］。腫瘤細胞表達PD-1配體，可與T淋巴細胞表面的PD-1結(jié)合，阻斷P13K/Akt通路，誘導(dǎo)T淋巴細胞凋亡，使腫瘤細胞逃避T淋巴細胞殺傷，最終導(dǎo)致腫瘤細胞免疫抑制和逃逸［25-26］。近年P(guān)D-1已成為腫瘤免疫治療靶點，PD-1抗體和抑制劑在多種惡性腫瘤治療中已取得顯著療效，安全性較高［27-28］。此外，較多研究發(fā)現(xiàn)PD-1還表達于多個腫瘤細胞，且發(fā)揮不同作用，如在黑色素瘤中，激活PD-1/PD-L1信號可促進腫瘤生長，而在肺癌中，阻斷PD-1信號可促進腫瘤細胞增殖［29-30］。因此，PD-1信號廣泛參與腫瘤生長及增殖。本研究發(fā)現(xiàn)敲減PD-1分子后，卵巢癌SKOV-3細胞凋亡水平明顯升高。提示PD-1在卵巢癌細胞中可能保護癌細胞免受PD-1介導(dǎo)的程序性凋亡作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，TCS可誘導(dǎo)卵巢癌細胞SKOV3凋亡，且細胞凋亡率隨TCS作用時間延長和濃度增加而逐漸升高（P＜0.05）。與TCS處理組相比，TCS聯(lián)合siPD-1處理組細胞凋亡率上升更為明顯（P＜0.05），且呈劑量和時間依賴性。進一步采用RTPCR檢測凋亡相關(guān)基因表達，結(jié)果顯示TCS處理組、TCS聯(lián)合siPD-1處理組細胞Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達均上升，表達水平隨處理時間延長和藥物濃度增加更為明顯（P＜0.05）；TCS聯(lián)合siPD-1處理組Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達明顯高于TCS處理組（P＜0.05）。此外，ELISA結(jié)果顯示TCS處理組、TCS聯(lián)合siPD-1處理組Caspase-3酶活性顯著提高（P＜0.05）。提示TCS協(xié)同siPD-1誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡機制可能與促進Caspase-3酶活性、激活Caspase-3相關(guān)凋亡通路級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，TCS可誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡，且與siPD-1聯(lián)用具有協(xié)同促凋亡效應(yīng)，TCS與siPD-1的協(xié)同效應(yīng)可能通過調(diào)節(jié)Caspase-3相關(guān)凋亡通路級聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)。