HCV核心蛋白調(diào)控miR-486-5p/AKR1B10促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長的實(shí)驗(yàn)研究①

馮麗萍 張輝潔 歐雯婷 余 盈（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤中心，湛江 524000）

2018年數(shù)據(jù)顯示，全球因肝癌死亡人數(shù)高達(dá)78.2萬，而我國占50%以上［1］。肝癌是我國癌癥死亡的重要原因之一，且其發(fā)病率和死亡率持續(xù)升高，嚴(yán)重威脅人們身體健康和生命安全［2］。丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一種小包膜正鏈單股RNA病毒，其感染是除乙型肝炎病毒外誘發(fā)肝癌的另一大危險因素；HCV核心蛋白（HCV core protein，HCVc）是HCV編碼的一種多功能蛋白，可通過與細(xì)胞內(nèi)信號通路相互作用調(diào)控相關(guān)因子表達(dá)，影響細(xì)胞增殖和凋亡等生物學(xué)行為，導(dǎo)致肝癌發(fā)生［3］。因此，深入研究HCVc促進(jìn)肝癌發(fā)生的分子機(jī)制對HCV感染相關(guān)性肝癌防治具有重要意義。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類非編碼RNA，可通過與靶基因3'UTR特異性結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其表達(dá)發(fā)揮作用，其異常表達(dá)與HCV感染相關(guān)性肝癌發(fā)生聯(lián)系密切［4］。研究指出，miR-486-5p在肝癌中異常低表達(dá)且可抑制HepG2細(xì)胞生長［5］；另外，原發(fā)性外周血單個核細(xì)胞中人類免疫缺陷病毒和HCV共同感染可引發(fā)miR-486-5p表達(dá)下調(diào)［6］；但HCV單獨(dú)感染是否影響肝癌miR-486-5p表達(dá)尚未明確。研究顯示，HCV感染可引起肝組織中醛酮還原家族1B10（aldehyde reductase family 1 member B10，AKR1B10）表達(dá)上調(diào)，而AKR1B10在肝癌中異常高表達(dá)，且可通過調(diào)控HepG2細(xì)胞增殖和凋亡發(fā)揮重要促癌作用［7-9］。本研究采用生物信息學(xué)軟件探索miR-486-5p和AKR1B10 3'UTR的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，推測miR-486-5p與AKR1B10的可能靶向關(guān)系，HCV感染可能通過調(diào)控肝癌中miR-486-5p/AKR1B10發(fā)揮致癌作用，因此，本研究擬通過HCVc腺病毒感染人肝癌細(xì)胞株HepG2，觀察miR-486-5p和AKR1B10表達(dá)變化及兩者作用關(guān)系，以期為HCV感染相關(guān)性肝癌發(fā)生機(jī)制和治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2購于寧波明舟生物科技有限公司（貨號：ATCC HB-8065）；EMEM培養(yǎng)基購于上海子起生物科技有限公司（貨號：30-2003）；胎牛血清購于上海生工生物工程股份有限公司（貨號：E510002-0100）；重組腺病毒Ad-GFPHCVc（滴度為1×1011pfu/ml）和陰性對照腺病毒Ad-GFP（滴度為1×1011pfu/ml）由長沙艾碧維生物科技有限公司旗下奧諾基因合成（貨號：均為HGrAd003167）；脂質(zhì)體3000、Trizol試劑、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、通用RT-PCR試劑盒、MTT試劑盒和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司（貨號：L3000008、15596018、D0010、RP1100、M1020-500T、CA1020-20T）；SYBR Green定量PCR試劑盒購于北京金福賽生物科技有限公司（貨號：GF1051）；miR-486-5p模擬物、模擬物陰性對照miR-NC、miR-486-5p抑制劑和抑制劑陰性對照購于南通百奧邁科生物技術(shù)有限公司（貨號：CS7004、CS7005、CS8004、CS8005）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與腺病毒感染 采用含10%胎牛血清的EMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞（37℃、5%CO2、95%相對濕度）。將長勢良好的指數(shù)期HepG2細(xì)胞按1×105個/孔平鋪于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)貼壁，以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為20、40、60、80和100對HepG2細(xì)胞進(jìn)行GFP腺病毒感染，感染48 h后采用熒光顯微鏡觀察感染效率。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 實(shí)驗(yàn)分為空白組：正常培養(yǎng)不進(jìn)行感染；陰性對照組：感染陰性對照腺病毒Ad-GFP；HCVc組：感染重組腺病毒Ad-GFPHCVc，每組設(shè)3個重復(fù)。按1×105個/孔取指數(shù)期HepG2細(xì)胞接種至6孔板，常規(guī)培養(yǎng)貼壁，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別加入Ad-GFP、Ad-GFP-HCVc腺病毒（MOI=60）培養(yǎng)48 h。

1.2.3 RT-PCR檢測HepG2細(xì)胞中HCVc基因表達(dá)收集處理后的3組HepG2細(xì)胞，加入1 ml Trizol試劑提取總RNA，參照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增條件為：94℃6 min，94℃15 s、60℃30 s、72℃30 s，72℃5 min，38個循環(huán)。PCR擴(kuò)增引物HCVc基因（長度180 bp）F：5'-CAACGCAAACCAAAATGCGA-3'，R：5'-CTTTCGGAATCGGCTGAC-3'；內(nèi)參GAPDH基因（長度217 bp）F：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，R：5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 MTT法檢測HepG2細(xì)胞增殖 將指數(shù)期HepG2細(xì)胞調(diào)整濃度為1×105個/ml，200μl/孔接種至96孔板，常規(guī)培養(yǎng)貼壁后，按1.2.2分組處理；分別在腺病毒感染細(xì)胞48 h、72 h和96 h時，參照MTT試劑盒說明書采用酶標(biāo)儀檢測HepG2細(xì)胞增殖活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞凋亡 收集腺病毒感染48 h后的3組HepG2細(xì)胞，預(yù)冷磷酸緩沖液漂洗2次，嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測HepG2細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 qRT-PCR檢測HepG2細(xì)胞miR-486-5p表達(dá)采用Trizol法提取3組HepG2細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，參照SYBR Green定量PCR試劑盒說明書采用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以U6為內(nèi) 參，2-ΔΔCt法計 算HepG2細(xì)胞miR-486-5p表達(dá)。擴(kuò)增條件為：94℃2 min，94℃10 s、60℃30 s，40個循環(huán)。PCR擴(kuò)增引物序列：miR-486-5p F：5'-CATTGTGCTGTTCGTGCAGTTAA-3'，R：5'-CCCTCCAGGAATTGGCCTGTCTT-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGT-3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Western blot檢 測HepG2細(xì) 胞HCVc和AKR1B10蛋白表達(dá) 收集處理后的3組HepG2細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液抽提總蛋白，二奎啉甲酸法對總蛋白進(jìn)行定量；將蛋白樣品和上樣緩沖液按1∶1混合，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，轉(zhuǎn)入1∶1 000稀釋的一抗（HCVc、AKR1B10、GAPDH）4℃孵育過夜，轉(zhuǎn)入1∶2 000稀釋的二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記）室溫孵育2 h，顯影；以GAPDH為內(nèi)參，Quantity one軟件分析HepG2細(xì)胞HCVc和AKR1B10蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將指數(shù)期HepG2細(xì)胞平鋪至6孔板，常規(guī)培養(yǎng)至70%融合，參照脂質(zhì)體3000說明書將miR-486-5p抑制劑及其陰性對照轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，命名為anti-miR-486-5p組和anti-miRNC組，以正常培養(yǎng)不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞作為對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后收集3組細(xì)胞，RT-qPCR檢測miR-486-5p表達(dá)，Western blot檢測AKR1B10蛋白表達(dá)。

1.2.9 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn) 將含miR-486-5p和AKR1B10結(jié)合位點(diǎn)序列和定點(diǎn)突變序列克隆重組至pmirGLO載體，構(gòu)建pmirGLO-AKR1B10野生型載體質(zhì)粒（AKR1B10-Wt）和pmirGLO-AKR1B10突變型載體質(zhì)粒（AKR1B10-Mut）；參照脂質(zhì)體3000說明書將miR-486-5p模擬物、模擬物陰性對照miR-NC分別與AKR1B10-Wt、AKR1B10-Mut共轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞（每組設(shè)3個復(fù)孔），轉(zhuǎn)染48 h后，采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測各處理組細(xì)胞熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GFP腺病毒感染效果 采用Ad-GFP腺病毒在MOI=60時感染HepG2細(xì)胞48 h，熒光顯微鏡觀察顯示感染效率達(dá)95%以上（圖1A）。RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，空白組和陰性對照組細(xì)胞中未見HCVc mRNA和蛋白表達(dá)，而HCVc組細(xì)胞中可見HCVc mRNA和蛋白表達(dá)（圖1B、C）。

圖1 腺病毒感染效果Fig.1 Adenovirus infection effect

2.2 HCVc促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞增殖并抑制其凋亡 腺病毒感染48 h、72 h和96 h時，陰性對照組和空白組細(xì)胞增殖活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但HCVc組細(xì)胞增殖活力明顯高于陰性對照組（P＜0.05）；陰性對照組和空白組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但HCVc組細(xì)胞凋亡率明顯低于陰性對照組（P＜0.05，圖2、表1）。

表1 HCVc對HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of HCVc on proliferation and apoptosis of HepG2 cells（±s，n=9）

表1 HCVc對HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of HCVc on proliferation and apoptosis of HepG2 cells（±s，n=9）

Note：1）P＜0.05 vs Negative control group.

Groups Blank Negative control HCVc FP OD490 48 h 0.62±0.03 0.60±0.04 0.73±0.061）21.689＜0.001 72 h 0.89±0.06 0.93±0.05 1.35±0.101）108.894＜0.001 96 h 1.19±0.13 1.22±0.15 1.68±0.151）32.903＜0.001 Apoptosis rate（%）9.52±1.16 8.75±1.23 3.02±0.211）117.323＜0.001

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果Fig.2 Flow cytometry results

2.3 HCVc下調(diào)肝癌HepG2細(xì)胞miR-486-5p表達(dá)，上調(diào)AKR1B10蛋白表達(dá) 與空白組相比，陰性對照組細(xì)胞miR-486-5p和AKR1B10蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與陰性對照組相比，HCVc組細(xì)胞miR-486-5p表達(dá)明顯降低，而AKR1B10蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，圖3、表2）。

表2 HCVc對HepG2細(xì) 胞miR-486-5p和AKR1B10蛋 白表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of HCV on miR-486-5p and AKR1B10 protein expressions of HepG2 cells（±s，n=9）

表2 HCVc對HepG2細(xì) 胞miR-486-5p和AKR1B10蛋 白表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of HCV on miR-486-5p and AKR1B10 protein expressions of HepG2 cells（±s，n=9）

Note：1）P＜0.05 vs Negative control group.

Groups Blank Negative control HCVc F P miR-486-5p 1.00±0.00 0.98±0.08 0.41±0.041）378.788＜0.001 AKR1B10 protein 0.48±0.04 0.46±0.03 0.89±0.071）214.905＜0.001

圖3 Western blot檢測AKR1B10蛋白表達(dá)Fig.3 AKR1B10 protein expression detected by Western blot

2.4 下調(diào)miR-486-5p表達(dá)可上調(diào)HepG2細(xì)胞AKR1B10蛋白表達(dá) 與對照組相比，anti-miR-NC組細(xì)胞miR-486-5p和AKR1B10蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與anti-miR-NC組相比，antimiR-486-5p組細(xì)胞miR-486-5p表達(dá)明顯降低，而AKR1B10蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，圖4、表3）。

表3 下調(diào)miR-486-5p表達(dá)對HepG2細(xì)胞AKR1B10蛋白表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of miR-486-5p down-regulation on AKR1B10 protein expression of HepG2 cells（±s，n=9）

表3 下調(diào)miR-486-5p表達(dá)對HepG2細(xì)胞AKR1B10蛋白表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of miR-486-5p down-regulation on AKR1B10 protein expression of HepG2 cells（±s，n=9）

Note：1）P＜0.05 vs anti-miR-NC group.

Groups Control anti-miR-NC anti-miR-486-5p F P miR-486-5p 1.00±0.00 0.98±0.09 0.19±0.031）640.300＜0.001 AKR1B10 protein 0.43±0.03 0.45±0.04 0.78±0.061）171.000＜0.001

圖4 Western blot檢測AKR1B10蛋白表達(dá)Fig.4 AKR1B10 protein expression detected by Western blot

2.5 miR-486-5p可與AKR1B10靶向結(jié)合Target-Scan軟件預(yù)測結(jié)果顯示，miR-486-5p和AKR1B10 3'UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)（圖5）；與模擬物陰性對照miR-NC相比，共轉(zhuǎn)染miR-486-5p模擬物與AKR1B10-Wt質(zhì)粒細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），但共轉(zhuǎn)染miR-486-5p模擬物與AKR1B10-Mut質(zhì)粒細(xì)胞熒光素酶活性無明顯改變（P＞0.05，圖6）。

圖5 miR-486-5p與AKR1B10存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)Fig.5 There were complementary binding sites between miR-486-5p and AKR1B10

圖6 各組細(xì)胞熒光素酶活性Fig.6 Luciferase activity of cells in each group

3 討論

HCVc是一種反式激活蛋白，不僅可通過影響HCV感染細(xì)胞的基因表達(dá)，還可通過形成同二聚體結(jié)構(gòu)、異二聚體結(jié)構(gòu)或多聚體結(jié)構(gòu)干擾細(xì)胞內(nèi)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡等過程，進(jìn)而發(fā)揮致癌作用［10］。本研究采用HCVc重組腺病毒感染HepG2細(xì)胞，細(xì)胞增殖活力明顯增強(qiáng)，凋亡能力明顯降低，表明HCVc具有促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用，與XU等［11］報道的HCVc可通過上調(diào)miR-196a靶向FOXO1促進(jìn)HepG2細(xì)胞異常增殖的結(jié)果以及FENG等［12］報道的HCVc可通過調(diào)控sirt1-p53-bax通路抑制HepG2細(xì)胞凋亡的結(jié)果一致。

miRNAs是一類與肝癌發(fā)生密切相關(guān)的非編碼RNA［13］。HCVc可通過調(diào)控部分miRNAs表達(dá)發(fā)揮致癌作用。如SHIU等［14］報道，HCVc可通過下調(diào)miR-138表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞復(fù)制性衰老；WANG等［15］研究指出，HCVc可通過調(diào)節(jié)TGFBRAP1和HOTTIP表達(dá)影響參與調(diào)控致癌進(jìn)展的miR-122和miR-204表達(dá)；HUANG等［16］發(fā)現(xiàn)，HCVc可通過下調(diào)miR-152表達(dá)調(diào)節(jié)Wnt1表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞異常增殖。miR-486-5p是在肝癌中異常低表達(dá)的miRNA，可通過調(diào)控相關(guān)靶基因（如PIK3R1、H3F3B、NEK2等）抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5，17-18］；但miR-486-5p是否參與HCVc致癌機(jī)制尚未闡明。本研究進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，HCVc重組腺病毒感染后，HepG2細(xì)胞miR-486-5p表達(dá)下調(diào)，表明HCVc可抑制HepG2細(xì)胞miR-486-5p表達(dá)。提示HCVc促進(jìn)肝癌發(fā)生的分子機(jī)制可能與下調(diào)肝癌中的抑癌基因miR-486-5p表達(dá)有關(guān)。

AKR1B10是一種醛酮還原酶，不僅在調(diào)節(jié)視黃酸代謝和促進(jìn)脂質(zhì)合成等過程中發(fā)揮重要作用，還在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮重要致癌作用［19-20］。本研究進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，HCVc可上調(diào)HepG2細(xì)胞AKR1B10蛋白表達(dá)，與SATO等［21］研究所得出的HCVc可上調(diào)肝組織中AKR1B10表達(dá)結(jié)果一致。同時鑒于錢瑞坤等［8］研究證實(shí)，AKR1B10在肝癌中可通過調(diào)控HepG2細(xì)胞增殖和凋亡發(fā)揮促癌作用，提示HCVc促進(jìn)肝癌發(fā)生過程中，其可能通過增強(qiáng)促癌因子AKR1B10表達(dá)使AKR1B10的致癌作用增強(qiáng)進(jìn)而促進(jìn)肝癌發(fā)生。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-486-5p抑制劑下調(diào)miR-486-5p表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞中AKR1B10蛋白表達(dá)明顯升高，表明miR-486-5p低表達(dá)可促進(jìn)HepG2細(xì)胞AKR1B10蛋白表達(dá)。另外，本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miR-486-5p可與AKR1B10靶向結(jié)合，表明AKR1B10是miR-486-5p的潛在靶基因。提示肝癌發(fā)生過程中，低表達(dá)miR-486-5p可能通過靶向上調(diào)促癌因子AKR1B10蛋白表達(dá)發(fā)揮促癌作用。

綜上所述，HCVc可引起HepG2細(xì)胞miR-486-5p表達(dá)下調(diào)和AKR1B10蛋白表達(dá)上調(diào)，AKR1B10是miR-486-5p的潛在靶基因，HCVc促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能與調(diào)控miR-486-5p/AKR1B10有關(guān)。但HCVc是直接還是間接調(diào)控miR-486-5p表達(dá)有待進(jìn)一步探討。