TLR4基因敲除對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響①

楊 艷 薛 征（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071）

哮喘是以氣道炎癥與可變氣流阻塞、氣道高反應(yīng)性和氣道壁重塑為特征的一種慢性炎癥性疾病。盡管隨著GINA方案的推廣，糖皮質(zhì)激素、β2受體激動(dòng)劑、抗膽堿能藥物、白三烯調(diào)節(jié)劑等被廣泛用于臨床，大多數(shù)哮喘患者病情能得到控制，但仍影響著全球4.3%的人口，依舊是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。研究者們對(duì)于哮喘的病理機(jī)制尚未完全掌握，是部分哮喘患者病情未受控制、發(fā)生率逐年上升的主要原因。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2失衡并不能完全解釋哮喘的病因，另兩個(gè)功能相對(duì)獨(dú)立的細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在哮喘發(fā)病中也具有重要意義。Toll樣受體4（TLR4）作為模式識(shí)別受體家族成員之一，可及時(shí)識(shí)別病原體相關(guān)的分子模式，進(jìn)一步調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)，參與過(guò)敏性疾?。?］。胸腺基質(zhì)淋巴生成素（TSLP）是調(diào)控過(guò)敏性炎癥反應(yīng)的總開(kāi)關(guān)之一，在哮喘、過(guò)敏性鼻炎、特異性皮炎中起重要作用。最新文獻(xiàn)報(bào)道，人類(lèi)和鼠類(lèi)在TSLP基因序列上均存在核因子-κB（NF-κB）的結(jié)合位點(diǎn)，在致敏原的刺激下，呼吸道上皮細(xì)胞TLR2、TLR4、TLR9等激活，可誘導(dǎo)產(chǎn)生TSLP［3-4］。LI等［5］證實(shí)，過(guò)敏性角膜炎的病理過(guò)程可能由TLR4通過(guò)TSLP/OX40L信號(hào)通路觸發(fā)，但在哮喘模型中，鮮有報(bào)道。因此本研究擬利用TLR4-/-小鼠，建立哮喘模型，觀(guān)察TLR4敲除對(duì)哮喘氣道炎癥的影響，并探討其影響是否引起TSLP、OX40L表達(dá)改變，從而影響Th1/Th2、Treg/Th17平衡。

1 材料與方法

1.1 材 料4～6周 齡SPF雄 性BALB/c WT和TLR4-/-小鼠，體重18～22 g；OVA、鋁佐劑（Sigma）；霧化器、電子天平、蘇木精、伊紅、DEPC處理水、緩沖液、RIPA組織細(xì)胞快速裂解液等（上?；鶢栴D公司）；Trizol（Invitrogen）；IL-4、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β、TSLP ELISA試劑盒（Bioswap）；T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3、OX40L抗體（Abcam）；電泳儀（BIORAD）；電轉(zhuǎn)儀（大連競(jìng)邁）；酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃）；成像系統(tǒng)（Tanon）；Real-time PCR檢測(cè)儀（ABI）等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠哮喘模型建立WT和TLR4-/-小鼠各10只，分別隨機(jī)分為對(duì)照組、哮喘組，即為野生小鼠對(duì)照組（WT-NS），野生小鼠哮喘組（WT-OVA），基因敲除小鼠對(duì)照組（TLR4-/--NS），基因敲除小鼠哮喘組（TLR4-/--OVA），每組5只。哮喘組小鼠于第1天和第14天腹腔注射1 ml致敏液（0.1 g OVA+0.01 g鋁佐劑+1 ml NS）。第21～27天，用5%OVA NS溶液霧化激化，每次40 min，1次/d，連續(xù)7 d。對(duì)照組腹腔注射致敏液和霧化激發(fā)以等量NS溶液替代。末次激發(fā)后24 h采集標(biāo)本。

1.2.2 HE染色觀(guān)察肺組織病理學(xué)改變 取各組小鼠右肺上葉置于10%甲醛固定48 h后，依次進(jìn)行清洗、脫水、透明處理、浸蠟、石蠟包埋，最后常規(guī)切片及HE染色后，通過(guò)顯微鏡拍照，觀(guān)察肺組織病理變化。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液（BALF）中細(xì)胞因子濃度 結(jié)扎右側(cè)支氣管，予1.5 ml預(yù)冷N(xiāo)S灌洗左側(cè)主支氣管肺葉，收集BALF，離心后取上清液，按ELISA試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定標(biāo)本中IL-4、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β、TSLP濃度。

1.2.4 Western blot檢測(cè)肺組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取各組小鼠右側(cè)支氣管、右肺下葉，剪碎并磨制成勻漿，并測(cè)蛋白濃度。隨后依次上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行膜上蛋白檢測(cè)，接著將一抗加入封閉液中稀釋?zhuān)?∶1 000進(jìn)行稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜后，孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，隨后根據(jù)用量，用封閉液稀釋二抗，與膜37℃孵育1 min，用TBST洗滌3次，最后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯示蛋白條帶。X線(xiàn)片在圖像分析系統(tǒng)上分析，比較GATA-3、T-bet、RORγt、Foxp3、OX40L與GAPDH的相對(duì)吸光度值。

1.2.5 Real-time PCR檢測(cè)肺組織中mRNA水平使用Trizol試劑提取肺組織及支氣管中的總RNA后，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。反應(yīng)體積為25μl，反應(yīng)體系含SYBRGreen Mix 12.5μl，上下游引物各0.5μl，cDNA模板2μl，ddH2O 9.5μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)加熱10 min，95℃變形15 s，60℃退火45 s，40個(gè)循環(huán)后，在60℃保持1 min，使產(chǎn)物延伸完整。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software分析各樣本的Ct值，得出GATA-3、T-bet、RORγt、Foxp3 mRNA水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用±s表示。各組計(jì)量資料采用單因素方差分析，并用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般行為特征WT-OVA組小鼠霧化后毛發(fā)豎立、煩躁掻鼻、呼吸加深、急促、腹肌痙攣，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)大小便失禁、體重減輕等情況。TLR4-/--OVA組小鼠一般行為特征較WT-OVA組明顯減輕。WT-NS組和TLR4-/--NS組無(wú)上述表現(xiàn)。

2.2 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變WT-OVA組小鼠肺組織及氣管周?chē)梢?jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等大量炎癥因子浸潤(rùn)，上層基底膜增厚；TLR4-/--OVA組小鼠較WT-OVA組肺組織炎癥程度明顯減輕，少見(jiàn)炎癥因子浸潤(rùn)；WT-NS組及TLR4-/--NS組小鼠氣道管腔及周?chē)M織平滑，未見(jiàn)炎癥因子浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色（×200）Fig.1 HE staining of lung tissue of mice in each group（×200）

2.3 各組小鼠BALF中IL-4、IFN-γ濃度 與WTNS相比，WT-OVA組小鼠IL-4顯著升高，IFN-γ顯著降低（P＜0.01），與WT-OVA相比，TLR4-/--OVA組小鼠IL-4顯著降低，IFN-γ顯著升高（P＜0.01），IL-4促進(jìn)Th0向Th2細(xì)胞分化，IFN-γ促進(jìn)Th0向Th1細(xì)胞分化，說(shuō)明敲除TLR4基因可抑制Th2炎癥因子而促進(jìn)Th1炎癥因子釋放。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠BALF中IL-4、IFN-γ濃度（±s，ng/ml）Tab.1 Concentration of IL-4 and IFN-γin BALF of mice in each group（±s，ng/ml）

表1 各組小鼠BALF中IL-4、IFN-γ濃度（±s，ng/ml）Tab.1 Concentration of IL-4 and IFN-γin BALF of mice in each group（±s，ng/ml）

Note：Compared with WT-NS，1）P＜0.01；compared with WT-OVA，2）P＜0.01.

Groups WT-NS TLR4-/--NS WT-OVA TLR4-/--OVA IL-4 132.74±8.16 79.49±5.19 336.13±36.761）179.11±26.982）IFN-γ 2 951.14±187.45 3 199.65±42.86 1 040.14±381.181）2 376.58±171.602）

2.4 各組小鼠BALF中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β濃度 與WT-NS相比，WT-OVA組小鼠IL-6、IL-17、TGF-β顯著升高，IL-10顯著降低（P＜0.01），與WTOVA相比，TLR4-/--OVA組小鼠IL-6、IL-17、TGF-β顯著降低，IL-10顯著升高（P＜0.01）。Th17能分泌IL-6、IL-17、TGF-β等炎癥因子，IL-10為T(mén)reg的代表炎癥因子，敲除TLR4基因可調(diào)整Th17/Treg細(xì)胞平衡。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠BALF中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β濃度（±s，ng/ml）Tab.2 Concentrations of IL-6，IL-10，IL-10 and TGF-βin BALF of mice in each group（±s，ng/ml）

表2 各組小鼠BALF中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β濃度（±s，ng/ml）Tab.2 Concentrations of IL-6，IL-10，IL-10 and TGF-βin BALF of mice in each group（±s，ng/ml）

Note：Compared with WT-NS，1）P＜0.01；compared with WT-OVA，2）P＜0.01.

Groups WT-NS TLR4-/--NS WT-OVA TLR4-/--OVA IL-6 68.82±7.22 47.08±9.19 194.69±17.981）111.96±1.292）IL-10 1 314.83±134.10 961.64±50.28 399.03±98.121）710.14±58.602）IL-17 161.94±11.71 125.27±16.98 491.79±32.521）268.80±26.262）TGF-β 113.95±17.79 98.94±11.45 303.26±59.611）169.95±19.932）

2.5 各組小鼠BALF中TSLP濃度 與WT-NS相比，WT-OVA組小鼠TSLP顯著升高（P＜0.01），與WT-OVA相比，TLR4-/--OVA組小鼠TSLP顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠BALF中TSLP濃度（±s，ng/ml）Tab.3 Concentration of TSLP in BALF of mice in each group（±s，ng/ml）

表3 各組小鼠BALF中TSLP濃度（±s，ng/ml）Tab.3 Concentration of TSLP in BALF of mice in each group（±s，ng/ml）

Note：Compared with WT-NS，1）P＜0.01；compared with WT-OVA，2）P＜0.01.

Groups WT-NS TLR4-/--NS WT-OVA TLR4-/--OVA TSLP 172.46±45.81 128.92±3.09 561.86±67.491）253.88±14.872）

2.6 各組小鼠肺組織中GATA-3、T-bet蛋白表達(dá)及mRNA水 平 與WT-NS相 比，WT-OVA組 小 鼠GATA-3表達(dá)水平及mRNA水平顯著升高（P＜0.01），T-bet蛋白表達(dá)及mRNA水平顯著降低（P＜0.01），與WT-OVA相比，TLR4-/--OVA組小鼠GATA-3蛋白表達(dá)及mRNA水平顯著降低（P＜0.01），T-bet蛋白表達(dá)及mRNA水平顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。GATA-3可以促進(jìn)Th2的分化而限制Th1因子分泌，T-bet決定Th1的分化并可將Th2逆轉(zhuǎn)為T(mén)h1，敲除TLR4基因可在蛋白及基因水平上調(diào)整Th1/Th2失衡。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠肺組織中GATA、T-bet蛋白表達(dá)及mRNA水平（±s）Tab.4 Protein expression and mRNA levels of GATA and T-bet in lung tissues of mice in each group（±s）

表4 各組小鼠肺組織中GATA、T-bet蛋白表達(dá)及mRNA水平（±s）Tab.4 Protein expression and mRNA levels of GATA and T-bet in lung tissues of mice in each group（±s）

Note：Compared with WT-NS，1）P＜0.01；compared with WT-OVA，2）P＜0.05，3）P＜0.01.

Groups WT-NS TLR4-/--NS WT-OVA TLR4-/--OVA GATA-3 Proteins 0.342±0.085 0.270±0.002 0.795±0.0191）0.397±0.0083）mRNA 0.012±0.003 0.008±0.002 0.023±0.0031）0.015±0.0023）0.396±0.088 0.630±0.045 0.054±0.0081）0.429±0.0553）T-bet Proteins mRNA 0.015±0.005 0.018±0.004 0.006±0.0011）0.012±0.0042）

2.7 各組小鼠肺組織中RORγt、Foxp3蛋白表達(dá)及mRNA水平與WT-NS相比，WT-OVA組小鼠RORγt蛋白表達(dá)及mRNA水平顯著升高（P＜0.01），F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)及mRNA水平顯著降低（P＜0.01），與WT-OVA相比，TLR4-/--OVA組小鼠RORγt蛋白表達(dá)及mRNA平顯著降低（P＜0.01），F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)及mRNA水平顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。Foxp3和RORγt分別為T(mén)reg、Th17的正向調(diào)節(jié)蛋白，敲除TLR4基因能通過(guò)調(diào)節(jié)RORγt、Foxp3蛋白表達(dá)及mRNA水平來(lái)改變Treg/Th17炎癥因子分泌。見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠肺組織中RORγt、Foxp3蛋白表達(dá)及mRNA水平（±s）Tab.5 Protein expression and mRNA levels of RORγt and Foxp3 in lung tissues of mice in each group（±s）

表5 各組小鼠肺組織中RORγt、Foxp3蛋白表達(dá)及mRNA水平（±s）Tab.5 Protein expression and mRNA levels of RORγt and Foxp3 in lung tissues of mice in each group（±s）

Note：Compared with WT-NS，1）P＜0.01；compared with WT-OVA，2）P＜0.05，3）P＜0.01.

Groups WT-NS TLR4-/--NS WT-OVA TLR4-/--OVA RORγt Proteins 0.246±0.079 0.328±0.019 0.603±0.0511）0.448±0.0133）mRNA 0.015±0.003 0.009±0.001 0.032±0.0051）0.021±0.0033）0.466±0.145 0.667±0.053 0.134±0.0811）0.450±0.0133）Foxp3 Proteins mRNA 0.012±0.003 0.016±0.004 0.005±0.002 0.010±0.0022）

2.8 各組小鼠肺組織中OX40L蛋白表達(dá)水平與WT-NS相比，WT-OVA組小鼠OX40L蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），與WT-OVA相比，TLR4-/--OVA組小鼠OX40L蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)表6。

表6 各組小鼠肺組織中OX40L蛋白表達(dá)水平（±s）Tab.6 Protein expression of OX40L in lung tissues of mice in each group（±s）

表6 各組小鼠肺組織中OX40L蛋白表達(dá)水平（±s）Tab.6 Protein expression of OX40L in lung tissues of mice in each group（±s）

Note：Compared with WT-NS，1）P＜0.01；compared with WT-OVA，2）P＜0.01.

Groups WT-NS TLR4-/--NS WT-OVA TLR4-/--OVA OX40L 0.273±0.112 0.274±0.024 1.055±0.1331）0.719±0.0582）

3 討論

TLR4是一種跨膜蛋白，屬于模式識(shí)別受體家族。機(jī)體受到外界微生物或環(huán)境中不利因子侵襲后，TLRs可將識(shí)別到的微生物或內(nèi)源性分子相關(guān)信號(hào)傳遞給下游蛋白激酶，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子激活，觸發(fā)體內(nèi)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，釋放炎癥因子及介質(zhì)［6-7］。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物中存在11種TLRs，只有TLR2和TLR4才能觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子易位，激活免疫相關(guān)基因，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，表明TLR2和TLR4可能與哮喘最相關(guān)［8-9］。最新一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，用OVA聯(lián)合脂多糖（LPS）對(duì)TLR2-/-及TLR4-/-小鼠建立哮喘模型，TLR2-/-小鼠氣道上皮中杯狀細(xì)胞增殖，氣道黏膜下層炎癥細(xì)胞膨脹，然而，TLR4-/-小鼠肺組織未見(jiàn)明顯病理改變［10］；用OVA、LPS聯(lián)合亞洲沙塵（ASD）同樣對(duì)兩組小鼠造模發(fā)現(xiàn)，TLR2-/-小鼠肺部杯狀細(xì)胞增殖率和炎癥細(xì)胞炎癥率顯著升高，IL-5、IL-6、IL-13、TNF-α等炎癥因子蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，與TLR2-/-小鼠相比，TLR4-/-肺部病理改變及炎癥因子表達(dá)方面均較輕，考慮TLR2-/-小鼠能表達(dá)TLR4蛋白，LPS可以通過(guò)TLR4信號(hào)途徑激活小鼠的Th2反應(yīng)，TLR4與TLR2相比，識(shí)別的微生物信號(hào)可能更廣泛。先前的研究報(bào)道，OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠血液?jiǎn)魏思?xì)胞中TLR4 mRNA表達(dá)水平增加，小劑量的LPS刺激OVA致敏后的小鼠，可通過(guò)TLR4信號(hào)誘導(dǎo)Th2炎癥反應(yīng)，促進(jìn)IL-4、IL-5的釋放［11-12］。TANG等［13］研究表明使用TLR4拮抗劑治療過(guò)敏性鼻炎哮喘綜合征小鼠，可通過(guò)降低BALF中IL-4、IL-5、IL-13濃度及減少單核細(xì)胞浸潤(rùn)，調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的積聚明顯改善下氣道癥狀。越來(lái)越多的證據(jù)表明，靶向TLR4信號(hào)通路作為新的哮喘治療靶點(diǎn)具有巨大的潛力。本研究結(jié)果顯示，TLR4-/-哮喘小鼠比野生哮喘小鼠肺部炎癥反應(yīng)輕，嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，IL-4濃度、GATA-3蛋白水平顯著降低，IFN-γ濃度、T-bet蛋白水平顯著上升，提示TLR4基因敲除可調(diào)整Th1/Th2失衡，扭轉(zhuǎn)Th2優(yōu)勢(shì)化，使肺組織處于低炎癥狀態(tài)。Treg/Th17的穩(wěn)態(tài)在維持肺免疫方面具有重要意義，Th17/Treg失衡與哮喘、過(guò)敏性鼻炎等炎癥性和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［14］。IL-6是控制Th17/Treg平衡的關(guān)鍵細(xì)胞因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除TLR4基因除了可調(diào)整Th1/Th2失衡外，還能通過(guò)降低IL-6、IL-17、TGF-β濃度，RORγt蛋白表達(dá)及mRNA水平，提高IL-10濃度，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)及mRNA水平恢復(fù)Treg/Th17平衡。

TSLP是一種與IL-7密切相關(guān)的新型的Ⅰ型細(xì)胞因子，主要由皮膚、腸道和肺等屏障表面的上皮細(xì)胞表達(dá)，誘導(dǎo)Th0分化為T(mén)h2，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。哮喘患兒外周血中TSLP水平明顯高于正常查體患兒，且與肺功能水平呈負(fù)相關(guān)，提示TSLP在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用［15］。目前，過(guò)敏性角膜炎模型中TSLP主要由角膜上皮細(xì)胞里的TLRs誘導(dǎo)的觀(guān)點(diǎn)已被公認(rèn)［16］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TLR4-/-基因敲除小鼠TSLP濃度相比于野生模型組小鼠顯著降低，提示在哮喘中TSLP可能由TLR4觸發(fā)。此外，大量研究表明，TSLP很大程度上發(fā)揮作用是通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）上的OX40配體（OX40L）來(lái)實(shí)現(xiàn)的［17-18］。這與本研究發(fā)現(xiàn)一致，野生模型組小鼠TSLP濃度及OX40L蛋白表達(dá)水平較空白組顯著升高，TLR4-/-基因敲除小鼠TSLP濃度隨著OX40L水平降低。OX40是TNFR家族成員，主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞，OX40L為OX40的配體，在活化抗原提呈細(xì)胞、內(nèi)皮和活化T細(xì)胞上存在。OX40與OX40L的結(jié)合向新激活的效應(yīng)T細(xì)胞傳遞了強(qiáng)烈的共刺激信號(hào)，增強(qiáng)Th2的反應(yīng)，IL-6與OX40L協(xié)同作用，誘導(dǎo)Th2分化的同時(shí)也可阻斷Treg細(xì)胞的作用［19-20］。

綜上所述，發(fā)現(xiàn)在哮喘模型中，TLR4-/-基因敲除可以顯著減輕肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可能與TSLP/OX40L水平減低，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2、Treg/T17失衡有關(guān)，為后續(xù)深入研究TLR4在哮喘中的作用、臨床治療靶點(diǎn)及策略提供前期基礎(chǔ)證據(jù)，然而確切的分子機(jī)制有待下一步研究。