經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道3基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓患者微量白蛋白尿的關(guān)系

沙熱扎提·依沙江 王蒙蒙 李瑜 陳玉嵐 孫曉靖徐新娟 張向陽

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1高血壓科，2綜合內(nèi)二科（烏魯木齊 830011）；3新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（烏魯木齊 830063）

原發(fā)性高血壓可引起心腦腎及血管等靶器官的損害，其中微量白蛋白尿（microalbuminuria，MAU）是心血管疾病的預(yù)測因子和危險(xiǎn)因素，是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的高血壓早期腎損害篩查標(biāo)志物之一［1-3］。MAU與高血壓之間存在雙向關(guān)聯(lián)，i-SEARCH全球研究［4］顯示全球高血壓患者中MAU的總患病率為58.4%，另一項(xiàng)中國成年人縱向研究［5］發(fā)現(xiàn)MAU者患高血壓風(fēng)險(xiǎn)增加75%。高血壓MAU產(chǎn)生的潛在機(jī)制與腎小球?yàn)V過屏障中內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）的功能障礙有關(guān)［6-7］，而瞬時(shí)受體電位通道3（transient receptor potential channel，TRPC3）通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度參與EC功能障礙的過程［8-10］，提示TRPC3可能與高血壓產(chǎn)生MAU相關(guān)，TRPC3主要受控于TRPC3基因。本研究以原發(fā)性高血壓患者為研究對(duì)象，評(píng)估TRPC3基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與MAU之間的相關(guān)性，以期為高血壓早期腎損害的干預(yù)研究提供新的思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年4月至2017年12月于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院高血壓科住院并確診為原發(fā)性高血壓的患者449例，其中女143例，男306例；平均年齡（47.27±10.17）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）以《中國高血壓防治指南2010年版》［11］為高血壓診斷依據(jù)；（2）年齡18 ～ 65歲；（3）所選患者均為漢族，且患者之間無一、二級(jí)親屬關(guān)系；（4）經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，簽署知情同意并且自愿參與該次研究患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）繼發(fā)性高血壓；（2）腎小球腎炎、腎病綜合征、IgA腎病等腎臟疾??；（3）嚴(yán)重心、肝、腎功能不全；（4）血糖控制欠佳的糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、甲狀腺功能減退癥等內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)疾病；（5）慢性消耗性疾病和惡性腫瘤；（6）目前口服腎毒性藥物；（7）因各種原因無法配合完成該研究及臨床資料不全者。

1.2 分組 根據(jù)是否合并微量白蛋白尿分單純高血壓組（EH組）378例和高血壓合并MAU組（EH+MAU組）71例。MAU診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《中國高血壓防治指南2010年版》建議，24 h尿微量白蛋白在30～300 mg為MAU。

1.3 研究方法

1.3.1 一般資料收集 包括入院時(shí)間、性別、年齡、吸煙史、飲酒史、家族史，測量身高、體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)（BMI）。

1.3.2 血液指標(biāo)測定 所有研究對(duì)象禁食8 h，次日清晨抽取空腹肘靜脈血，采用羅氏C8000全自動(dòng)生化儀分析空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、胱抑素C、維生素D、同型半胱氨酸（Hcy）等。

1.3.3 尿微量白蛋白測定 患者正常飲食，當(dāng)日清晨8點(diǎn)，排掉首次小便，此后每次小便全部留在清潔的容器中，次日清晨8點(diǎn)記錄容器中尿量，搖勻后取留10～20 mL尿標(biāo)本送檢，采用貝克曼Dxc800全自動(dòng)生化分析儀檢測24 h尿微量白蛋白。

1.3.4 血壓測量 采用美國welch Allyn動(dòng)態(tài)血壓監(jiān)測儀6100監(jiān)測，記錄24 h平均收縮壓（24 h SBP）、24 h平均舒張壓（24 h DBP）、24 h平均脈壓。

1.3.5 TRPC3基因多態(tài)性檢測

1.3.5.1 DNA提取 采取清晨空腹肘靜脈血5 mL，-70℃冷凍保存待測；按照TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒說明方法提取DNA；用紫外分光光度計(jì)測量DNA濃度和純度。

1.3.5.2 PCR擴(kuò)增分型 使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design軟件設(shè)計(jì)TRPC3基因5個(gè)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物。采用多重PCR技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR引物見表1。檢測結(jié)果使用TYPER 4.0軟件分型并輸出結(jié)果。

表1 PCR引物Tab.1 PCR primer

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Hardy-Weinberg檢驗(yàn)比較兩組間是否具有群體代表性，P＞0.05為符合Hardy-Weinberg平衡。應(yīng)用logistic回歸模型分析影響尿微量白蛋白的獨(dú)立相關(guān)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較 兩組間年齡、BMI、甘油三酯、24 h平均收縮壓、24 h平均舒張壓差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表2。

表2 EH組與EH+MAU組一般臨床資料對(duì)比Tab.2 Comparison of general clinical data of EH group and EH+MAU group ±s

表2 EH組與EH+MAU組一般臨床資料對(duì)比Tab.2 Comparison of general clinical data of EH group and EH+MAU group ±s

年齡（歲）男［例（%）］吸煙史［例（%）］飲酒史［例（%）］家族史［例（%）］高血壓病程（月）BMI（kg/m2）空腹血糖（mmol/L）尿素（mmol/L）肌酐（μmol/L）甘油三酯（mmol/L）總膽固醇（mmol/L）高密度脂蛋（mmol/L）低密度脂蛋（mmol/L）維生素D（nmol/L）同型半胱氨酸（μmol/L）胱抑素C（mg/L）24 h平均收縮（mmHg）24 h平均舒張（mmHg）24 h平均脈壓（mmHg）EH組（n=378）47.77±10.05 251（66.40）151（39.95）143（37.83）257（67.99）62.03±73.15 26.27±3.22 4.84±0.92 5.26±1.37 71.01±15.79 1.90±1.35 4.23±0.89 1.13±0.30 2.80±0.73 36.42±17.07 14.32±8.00 1.63±14.94 133.66±13.13 84.42±11.28 49.24±8.28 EH+MAU組（n=71）44.58±10.45 55（77.46）34（47.89）27（38.03）48（67.61）74.73±78.95 28.02±3.92 4.96±1.26 5.38±1.37 72.92±18.87 2.57±2.74 4.16±0.87 1.07±0.28 2.67±0.69 34.91±23.23 14.53±8.58 1.02±1.29 144.27±16.85 93.09±13.00 51.18±8.49 P值0.015 0.072 0.238 1.000 1.000 0.186＜0.001 0.352 0.484 0.365 0.046 0.534 0.125 0.190 0.538 0.843 0.734＜0.001＜0.001 0.072

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 兩組基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)（P＞0.05），具有群體代表性。

2.3 EH組與EH+MAU組基因頻率的比較 兩組rs953691位點(diǎn)基因型分布、等位基因及顯性模型（GG/GT+TT）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），余位點(diǎn)基因型分布及各模型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見圖1。

圖1 EH組與EH+MAU組基因頻率分布Fig.1 Frequency distribution of EH group and EH+MAU group

2.4 Logistic回歸分析 以MAU為因變量，年齡、BMI、甘油三酯、24 h平均收縮壓、24 h平均舒張壓和TRPC3基因rs953691顯性模型基因型為自變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果顯示：甘油三酯、24 h平均收縮壓（≥150 mmHg）和rs953691 GG基因型為原發(fā)性高血壓患者出現(xiàn)MAU的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3。

表3 原發(fā)性高血壓患者微量白蛋白尿影響因素的logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of factors influencing microalbuminuria in essentialhypertension patients

3 討論

TRPC3是TRPC家族中具有代表性且非常重要的一個(gè)亞群，主要受控于TRPC3基因。人類TRPC3基因由位于4號(hào)染色體上的13個(gè)外顯子組成。近年大量研究成果已證實(shí)，TRPC3在腎小管、腎間質(zhì)、腎上皮及脈管系統(tǒng)中表達(dá)并參與不同類型的腎臟疾病。在慕尼黑大鼠腎皮質(zhì)中TRPC3表達(dá)增高，且與蛋白尿有關(guān)［12］；敲除TRPC3基因可改善梗阻腎引起的腎小管間質(zhì)損傷和腎纖維化［13］；另外，聯(lián)合敲除TRPCs（包括TRPC3）可降低糖尿病小鼠腎功能不全的易感性［14］。然而TRPC3基因多態(tài)性在原發(fā)性高血壓腎損害中的作用尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，EH+MAU組患者BMI、甘油三酯、24 h平均血壓水平明顯高于EH組，與RAIKOU等［15］、KUANG等［16］結(jié)果一致。Logistic回歸顯示，排除混雜因素后甘油三酯和24 h平均收縮壓（≥150 mmHg）仍是原發(fā)性高血壓合并MAU的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。另外發(fā)現(xiàn)，EH+MAU組患者較EH組年齡小，與AL-SHARIFI等［17］研究結(jié)論相反，可能原因考慮：（1）EH+MAU組更高的血壓、血脂、BMI水平使患者更早出現(xiàn)MAU。（2）AL-SHARIFI等［17］研究納入的病患為伊拉克人群，而本研究為中國漢族人群，這種差異可能與地理區(qū)域和遺傳因素相關(guān)；（3）AL-SHARIFI等［17］研究，患者平均年齡（59.0±7.2）歲，而本研究患者平均年齡為（47.27±10.17）歲，抽樣人群年齡差異可能導(dǎo)致研究結(jié)果不一致。因此，在強(qiáng)調(diào)血壓、血脂達(dá)標(biāo)的基礎(chǔ)上，更好地控制體質(zhì)量是預(yù)防高血壓患者M(jìn)AU的重要策略之一。

TRPC3的5個(gè)位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明具有群體代表性。基因頻率的比較結(jié)果顯示，rs953691位點(diǎn)基因型、等位基因及顯性模型在兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測rs953691位點(diǎn)的變異可能是高血壓合并MAU的危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步行l(wèi)ogistic回歸分析顯示，TRPC3基因rs953691位點(diǎn)GG基因型的高血壓患者發(fā)生微量白蛋白尿的風(fēng)險(xiǎn)性是GT+TT基因型的2.169倍，提示TRPC3基因多態(tài)性是高血壓合并MAU的獨(dú)立危險(xiǎn)因素?？赡軝C(jī)制如下：（1）TRPC3在高血壓患者內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，其誘導(dǎo)的Ca2+作用于內(nèi)皮骨架中的肌球—肌動(dòng)蛋白，引起內(nèi)皮細(xì)胞膜流動(dòng)性增加進(jìn)而破壞腎小球?yàn)V過屏障的結(jié)構(gòu)和功能［9，18］。（2）TRPC3參與 RAAS 系統(tǒng)激活并釋放血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）［19］，AngⅡ損傷腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞，打破腎血管自我調(diào)節(jié)能力，引起腎小球高壓力、高濾過［20］。（3）TRPC3 通過 Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)節(jié)激酶控制腎成纖維細(xì)胞增殖、分化和活化，使腎間質(zhì)纖維化和腎小管損害，進(jìn)而加重腎損傷［21］。

綜上所述，高血壓早期出現(xiàn)MAU是環(huán)境和遺傳因素共同影響的結(jié)果。血壓、甘油三酯和TRPC3基因多態(tài)性是高血壓患者M(jìn)AU的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。TRPC3基因rs953691位點(diǎn)的GG基因型可能增加高血壓患者M(jìn)AU發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步深入研究TRPC3基因的功能和作用機(jī)制可以為高血壓患者M(jìn)AU的早期診斷及有效防控提供理論依據(jù)。

本研究新穎之處：探討TRPC3基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓患者M(jìn)AU的關(guān)系，明確了rs953691位點(diǎn)的GG基因型與高血壓患者M(jìn)AU具有相關(guān)性，為高血壓早期腎損害的干預(yù)提供了新思路。不足之處：本研究對(duì)象全部來自同一家醫(yī)院的住院患者，可能存在選擇偏移，此外本研究樣本量較小，未設(shè)健康對(duì)照組。下一步研究方向：納入健康人群，擴(kuò)大樣本量，對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行長期隨訪和多中心研究，進(jìn)一步行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。