干細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中的研究與進(jìn)展

廖益東 王梓力 陳光唐 王旭東 徐卡婭

1貴州醫(yī)科大學(xué)（貴陽 550004）；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（貴陽 550004）

缺血性腦血管病已成為全球死亡及致殘的主要原因［1］。我國每年有240萬患者，110萬患者死于腦梗塞，大約只有5%的患者能使用目前的治療方法治療。缺血性腦卒中主要是由一根或多根腦動脈阻塞引起的［2］。血液供應(yīng)不足會降低腦細(xì)胞所需的葡萄糖和氧氣，并破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，從而導(dǎo)致神經(jīng)功能的缺失。目前的治療方法包括動靜脈溶栓、血管內(nèi)支架成形術(shù)、血管內(nèi)介入治療及外科手術(shù)等，但通常受限于梗塞治療的時間窗（發(fā)病急性期4.5～6 h內(nèi)）及嚴(yán)重的出血并發(fā)癥［3］。盡管經(jīng)使用上述的方法積極治療后，許多患者仍然遺有殘疾。急需開展新的基礎(chǔ)或臨床研究，以便能探索出一種更有效、更安全的治療方法，可以提高患者生活質(zhì)量，從而減輕社會醫(yī)療負(fù)擔(dān)，這對我國國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展有重要意義。缺血性腦卒中的特征性變化是腦動脈閉塞后導(dǎo)致神經(jīng)元的急性喪失以及突觸結(jié)構(gòu)的破壞［4］。由于神經(jīng)細(xì)胞的更新能力有限且轉(zhuǎn)換緩慢，內(nèi)源性細(xì)胞替代不足以修復(fù)受損的神經(jīng)元，因此干細(xì)胞療法已成為治療缺血性腦卒中最有前景的方法。干細(xì)胞是具有自我更新、高度增殖和多系分化的細(xì)胞群體，能夠產(chǎn)生高度分化的功能子細(xì)胞，可以通過分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子和替換受損的神經(jīng)元、通過抑制顱內(nèi)外炎癥反應(yīng)和抗細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，還可釋放細(xì)胞營養(yǎng)生長因子等增強(qiáng)內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制的物質(zhì)而起到神經(jīng)保護(hù)及修復(fù)的作用。

1 移植干細(xì)胞治療腦卒中可能的作用機(jī)制

目前認(rèn)為干細(xì)胞的作用機(jī)制可能有：（1）細(xì)胞的替代作用：恢復(fù)神經(jīng)功能最直接的方法就是運(yùn)用干細(xì)胞中新分化的神經(jīng)細(xì)胞替換受損的組織。經(jīng)研究證實(shí)，移植后的干細(xì)胞進(jìn)入腦組織結(jié)構(gòu)中，能夠在特定條件下進(jìn)行分化，代替損傷的神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)的傳導(dǎo)作用以及連接結(jié)構(gòu)的重新建立。（2）促進(jìn)血管生成：腦卒中的治療不光需要神經(jīng)組織的恢復(fù)，還需要開通血管，其中新生血管數(shù)量與患者的生存期呈正相關(guān)，因而提示血管再生是神經(jīng)功能重構(gòu)的重要機(jī)制。ZHANG等［5］發(fā)現(xiàn)90 d內(nèi)的血管體積從中風(fēng)前的3%增加到中風(fēng)后的5.7%，在梗死區(qū)周圍也觀察到了毛細(xì)血管生成。此外，干細(xì)胞還可以通過調(diào)節(jié)Notch1和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞等的表達(dá)，來發(fā)揮其在血管生成中的作用。所以干細(xì)胞有可能調(diào)動了機(jī)體免疫細(xì)胞的能力，如調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞來達(dá)到其有益目的，這是今后研究的熱點(diǎn)［6-8］。（3）免疫和炎癥的調(diào)節(jié)作用：在腦缺血性卒中后，大量的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被動員起來，并持續(xù)聚集到損傷區(qū)域。這類細(xì)胞有兩種表型，分別是M1和M2，表型為M1基因的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞因子，抑制神經(jīng)元、突觸的再生，不利于神經(jīng)功能恢復(fù)。而表型為M2基因的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞能夠減輕局部炎癥反應(yīng)，清除細(xì)胞碎片，并釋放大量營養(yǎng)因子來促進(jìn)血管、神經(jīng)細(xì)胞重塑，從而實(shí)現(xiàn)神經(jīng)功能恢復(fù)［9-10］。在最近研究中發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)樣細(xì)胞已經(jīng)從培養(yǎng)的人類胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞衍生而來，說明干細(xì)胞可以促進(jìn)小膠質(zhì)樣細(xì)胞增殖分化［11］。此外干細(xì)胞也可分泌抗炎細(xì)胞因子和調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞介質(zhì)釋放，通過免疫介導(dǎo)作用減弱神經(jīng)性炎癥［12］?？傮w來說，干細(xì)胞極有可能是通過免疫調(diào)節(jié)，降低了顱內(nèi)外炎癥反應(yīng)，調(diào)動有益的免疫細(xì)胞，來介導(dǎo)卒中后患者神經(jīng)功能恢復(fù)。（4）抗凋亡作用：這種作用可能是通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子等營養(yǎng)因子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的［7，13］。移植干細(xì)胞治療缺血性卒中的作用機(jī)制可能有促進(jìn)血管生成、免疫調(diào)控、對抗細(xì)胞凋亡等。見圖1。

圖1 移植干細(xì)胞治療缺血性腦卒中的可能作用機(jī)制Fig.1 The possible mechanism of stem cell transplantation in the treatment of ischemic stroke

2 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）

MSCs屬于成體干細(xì)胞的一大類型，運(yùn)用最為廣泛，獲取輕松，便于保存，同時MSCs還具有免疫源性低、多項(xiàng)分化潛能等優(yōu)勢。隨著研究進(jìn)展人們認(rèn)識到，腦血管病的亞急性期，動脈閉塞后導(dǎo)致神經(jīng)元急性喪失以及突觸結(jié)構(gòu)的破壞，干細(xì)胞能釋放的高度分化的功能子細(xì)胞和生長因子，能降低內(nèi)源性神經(jīng)炎癥，減少興奮性的神經(jīng)毒性，調(diào)控腦內(nèi)微環(huán)境來指導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞抗炎，從而起到神經(jīng)保護(hù)及修復(fù)作用［14-15］。最新研究表明過度上調(diào)水通道蛋白4（AQP4）會引起血腦屏障的損壞，MSCs能夠下調(diào)AQP4，來減輕血腦屏障的破壞，更加有益于病變部位新皮質(zhì)的生成［16］。體內(nèi)研究還表明，在缺血性腦卒中大鼠體內(nèi)注射MSCs能減輕血腦屏障的滲漏，調(diào)控免疫系統(tǒng)和旁分泌機(jī)制來促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)［17-18］。隨后SAVITZ等［19］應(yīng)用骨髓來源的自體干細(xì)胞群ALD-401通過頸內(nèi)動脈注入穩(wěn)定期缺血性腦卒中患者顱內(nèi)血管，未出現(xiàn)任何的安全問題和緊急不良事件，驗(yàn)證了該自體MSCs對于臨床患者是具有安全性的。筆者思考，頸內(nèi)注射改變了原有血流動力學(xué)，大規(guī)模應(yīng)用是否可能引發(fā)新的血栓，這都需要大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究數(shù)據(jù)來提供有力證明。LEE等［20］也運(yùn)用靜脈途徑注射自體MSCs，隨訪五年后得出，這種干細(xì)胞移植策略對腦卒中患者是安全和有效的。綜上述研究，中樞神經(jīng)系統(tǒng)及顱內(nèi)外炎性反應(yīng)在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵的作用，MSCs能通過遷移作用存活在缺血區(qū)域，同時發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用來對抗腦卒中后顱內(nèi)炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞增殖，這種MSCs細(xì)胞治療劑，可能在腦血管疾病治療中發(fā)揮巨大潛力［7］?？傮w來看，干細(xì)胞要想大規(guī)模應(yīng)用需要不同的實(shí)驗(yàn)方法以及不同國家的人群進(jìn)行移植，獲取可靠研究數(shù)據(jù)，并且還需妥善解決治療時間窗、移植途徑、細(xì)胞劑量等問題。目前臨床運(yùn)用主要的移植途徑分為立體定位注射、外周血注射及腦脊液循環(huán)注射，目前研究表明，腦卒中急性期通過外周血注射的患者受益更大，因此，缺血性卒中的不同時間窗移植干細(xì)胞，來觀察它的療效是非常必要的［21-22］。相信隨著干細(xì)胞治療腦卒中的不斷深入，局限性問題將在將會迎刃而解。

3 納米材料在干細(xì)胞移植傳遞和調(diào)控中的作用

納米顆粒（直徑10～100 nm），因其尺寸和形狀可調(diào)節(jié)，具有較大的表面積，有利于細(xì)胞或者分子（藥物、抗體）附著及可攜帶多種生物配體。臨床研究表明，使用聚合物涂層涂抹納米顆粒表面，更加提高了生物利用度，正是由于材料的特性，超順磁性氧化鐵納米顆粒（Surparamagnetic iron oxidenanoparticles，SPIONs）的導(dǎo)入才能實(shí)時監(jiān)測治療效果，成為干細(xì)胞移植治療領(lǐng)域的又一重大發(fā)現(xiàn)［23-24］。另一方面納米材料作為干細(xì)胞移植的傳遞體，更加有利于改善干細(xì)胞存活和歸巢、調(diào)控干細(xì)胞的行為及誘導(dǎo)其分化、增強(qiáng)干細(xì)胞的旁分泌等［25］。目前干細(xì)胞移植最大難題就是真正遷移到靶區(qū)細(xì)胞數(shù)量少，納米材料的應(yīng)用增加了細(xì)胞的運(yùn)載數(shù)量［26］。與此同時，納米材料的生物特性可調(diào)節(jié)干細(xì)胞的行為和腦內(nèi)局部微環(huán)境，從而提高移植干細(xì)胞體內(nèi)存活率。其可能的原因如下，納米材料附加了某些生物活性分子，而且自身也具有一定生物活性。據(jù)可靠研究表明附加的生物活性分子包括化學(xué)小分子藥物、核酸類藥物、肽類藥物、干細(xì)胞因子等［27］，見圖2。為了使干細(xì)胞能更好地運(yùn)用于臨床，需要開發(fā)多類型的新型材料、或者涂層材料搭載干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用。

圖2 附加于納米材料的各類活性分子、藥物的負(fù)載方式Fig.2 Loading methods of various active molecules and drugs attached to nanomaterials

4 移植后干細(xì)胞追蹤方法及臨床應(yīng)用 磁共振成像

MRI是干細(xì)胞移植臨床追蹤的最有前途的無創(chuàng)成像方法之一。為了通過MRI追蹤移植的干細(xì)胞，需要使用造影劑標(biāo)記，以獲得足夠的信號強(qiáng)度差異，才能在MRI顯示出來。經(jīng)過多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)超順磁性氧化鐵（SPIO）納米顆粒成為干細(xì)胞標(biāo)記的首選［28］。研究發(fā)現(xiàn)，具有中空結(jié)構(gòu)的錳磁性納米粒子（MnOHo）并用β1抗體對其進(jìn)行了修飾，在干細(xì)胞注射前使用預(yù)先進(jìn)行標(biāo)記，注射進(jìn)小鼠體內(nèi)后通過MRI檢測，MnOHo依然存在于標(biāo)記的干細(xì)胞中，證明了MnOHo對轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞具有生物安全、高效標(biāo)記，多重檢測的優(yōu)點(diǎn)，從而能夠在臨床前對移植的人類干細(xì)胞進(jìn)行微創(chuàng)監(jiān)測［29］；ZHANG等［30］還向卒中小鼠的大腦內(nèi)注射了熒光介導(dǎo)的二氧化硅涂層來包裹SPIO，標(biāo)記的干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)熒光修飾的SPIO對干細(xì)胞進(jìn)行了高效的跟蹤，這種方法有望在MRI應(yīng)用中取得巨大成功。然而，又有報告指出SPIO的局限性就是隨著細(xì)胞分裂的進(jìn)行，SPIO的濃度會減半，導(dǎo)致信號減少，影響MRI結(jié)果的準(zhǔn)確性，這對長期追蹤造成了很大的阻礙［31-32］?？傮w而言，MRI雖然具有非侵入性的優(yōu)點(diǎn)，但是標(biāo)記物容易隨著細(xì)胞的分裂而削弱，需要和納米顆?；蚧蛐揎椷M(jìn)一步整合，提高它的特異性，以便更加適合其臨床應(yīng)用，這是未來干細(xì)胞成像的新趨勢。

5 思考與展望

2014年“干細(xì)胞及轉(zhuǎn)化研究”被列為國家重點(diǎn)研發(fā)計劃，為干細(xì)胞治療缺血性卒中提供了豐富的理論依據(jù)和技術(shù)支持。然而，目前干細(xì)胞應(yīng)用于缺血性卒中治療的臨床試驗(yàn)大多數(shù)都是短期案例研究，缺乏長期的全面的臨床數(shù)據(jù)分析。但是大量的動物試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了干細(xì)胞治療缺血性腦卒中的一個可行性、安全性和先進(jìn)性，如何將動物試驗(yàn)與臨床應(yīng)用結(jié)合是目前棘手的問題。現(xiàn)如今，干細(xì)胞治療腦缺血性卒中的機(jī)制仍不明確，還可能存在的機(jī)制如：干細(xì)胞是如何將健康線粒體定向歸巢至靶細(xì)胞以挽救受損細(xì)胞，從而調(diào)控免疫細(xì)胞，減輕了顱內(nèi)外源性炎性反應(yīng)，這些修復(fù)的機(jī)制還有待深入研究。隨著我們國家人民對醫(yī)療水平的需求，還需要結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，思考注射的干細(xì)胞劑量對患者的療效，以及適宜時間窗的選擇及移植途徑等問題。最新研究表明可采用納米新型材料搭載移植干細(xì)胞，該材料具有很多優(yōu)勢，不僅減少了干細(xì)胞損失率、還調(diào)控了顱內(nèi)微環(huán)境，讓更多的干細(xì)胞到達(dá)受損靶點(diǎn)發(fā)揮治療效應(yīng)。但是遞送干細(xì)胞藥物產(chǎn)品的臨床運(yùn)用可能存在免疫排斥，生物相容性、血管化等問題仍然面臨挑戰(zhàn)。未來干細(xì)胞的成功運(yùn)用，不僅需要到臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)問題，而且還要不斷的回歸到基礎(chǔ)研究中解決問題，這樣才能為顱內(nèi)移植干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新的理論依據(jù)，為缺血性腦卒中防治提供潛在的應(yīng)用靶點(diǎn)。