基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討白藜蘆醇抗衰老的作用機(jī)制#

曾宇鑫 汪夢(mèng) 張曉 梁楠

（成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，四川 成都 610500）

衰老主要表現(xiàn)為機(jī)體功能的衰退、身體適應(yīng)力減退。全球人口老齡化的趨勢(shì)迫切需要人們更好地了解衰老的過程，從而找尋預(yù)防、延遲或減輕其發(fā)展的策略[1-2]。目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激和炎癥激活是引起衰老的主要原因[3]。

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）具有抗衰老、抗腫瘤等多種生物活性[4-6]可用于治療多種與年齡有關(guān)的疾病，例如阿爾茨海默氏病[7-8]、血脂異常[9]，同時(shí)具有預(yù)防衰老延長(zhǎng)壽命的作用[10-11]，然而其抗衰老的機(jī)制還不十分清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于藥物結(jié)構(gòu)及其作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)之間的生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，可以預(yù)測(cè)藥物治療疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)和機(jī)制。因此，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究Res抗衰老作用機(jī)制具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 Res作用靶點(diǎn)的獲取

在美國國家生物技術(shù)信息中心負(fù)責(zé)維護(hù)的Pubchems數(shù)據(jù)庫（https: //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找Res的3D化學(xué)結(jié)構(gòu)。在華東理工大學(xué)開發(fā)與維護(hù)的藥效團(tuán)匹配與潛在識(shí)別靶標(biāo)平臺(tái)PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http: //www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）中[12]，通過Res的3D化學(xué)結(jié)構(gòu)搜索目標(biāo)僅為人類的相關(guān)蛋白質(zhì)，以標(biāo)準(zhǔn)化擬合得分（Normalized Fit Score）≥0.4和z分?jǐn)?shù)≥0.4為篩選條件，得到Res作用靶點(diǎn)，通過UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的基因名（Gene names）。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

GeneCard數(shù)據(jù)庫（https: //www.genecards.org/）收錄了關(guān)于人的蛋白質(zhì)編碼基因、RNA基因、遺傳基因座、基因簇和未分類的基因等詳細(xì)信息，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中[13]，我們輸入關(guān)鍵詞衰老（Aging），以相關(guān)性得分（Relevance score）≥20.00為篩選條件查詢得到衰老相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 Res抗衰老靶點(diǎn)

在Venny圖在線繪制工具（https: // bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中，分別輸入搜索的Res作用靶點(diǎn)、衰老相關(guān)靶點(diǎn)到 Res、衰老下面的欄目，兩者之間的交集即為Res抗衰老的潛在靶點(diǎn)。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析

將Res抗衰老的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https: //string-db.org/）[14]，限定物種為人，置信度設(shè)置為0.4，制作蛋白互相作用（protein-pro tein interaction，PPI）圖后下載圖片和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)表格。統(tǒng)計(jì)各個(gè)基因在網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)表格中出現(xiàn)的次數(shù)，并繪制柱狀圖。

1.5 GO富集分析和KEGG通路分析

將Res抗衰老的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https: //david.ncifcrf.gov/）[15]，選擇物種為人，下載基因本體論中（Gene Ontology，GO）分析中的生物學(xué)過程（Biological Process，BP）、細(xì)胞成分（Cel-lular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）富集分析結(jié)果，并下載京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析結(jié)果，利用微生信在線繪圖網(wǎng)站（http: // www.bioinformatics.com.cn/）制作GO富集分析柱狀圖和KEGG通路分析氣泡圖。

1.6 構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)-GO-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)

將 Res抗衰老的潛在治療靶點(diǎn)，取前 20條KEGG通路分析結(jié)果、前10條GO（BP，CC，MF）富集分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)-GO-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 Res作用靶點(diǎn)

從PharmMapper數(shù)據(jù)庫中獲得目標(biāo)僅為人類的Res相關(guān)蛋白質(zhì)總計(jì)224個(gè)。以標(biāo)準(zhǔn)化擬合得分（Normalized Fit Score）≥0.4和z分?jǐn)?shù)≥0.4為篩選條件，篩選后經(jīng) UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換名稱后我們得到91個(gè)匹配靶點(diǎn)。

2.2 衰老相關(guān)靶點(diǎn)

我們從 GeneCard數(shù)據(jù)庫中獲得衰老相關(guān)靶點(diǎn)共有24457個(gè)，以Relevance score≥20.00為篩選條件，篩選后得到474個(gè)衰老相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 Res抗衰老潛在靶點(diǎn)分析

將Res作用靶點(diǎn)和衰老相關(guān)靶點(diǎn)取交集后，我們得到22個(gè)Res抗衰老的潛在靶點(diǎn)，見圖1，分別為 ESR1、ALB、NOS3、AR、ANXA5、EGFR、CDK6、SRC、NR3C2、SOD2、PTPN11、F2、SERPINA1、MAPK10、PLAU、ERBB4、MET、ARSA、JAK2、FGFR1、MAPK1、IGF1，見表1。

表1 Res抗衰老潛在靶點(diǎn)

圖1 Res抗衰老潛在靶點(diǎn)的Venny圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將Res潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，分析PPI網(wǎng)絡(luò)圖，EGFR 、MAPK1、MET、ESR1、SRC、IGF1占據(jù)核心位置，見圖2。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，靶點(diǎn)互相關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)數(shù)最高的 5名是 IGF1、ALB、ESR1、MAPK1、EGFR，見圖3，并且它們都與SIRT1有聯(lián)系，見圖3。

圖2 Res抗衰老潛在靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)度柱狀圖（左）和Res抗衰老潛在靶點(diǎn)的蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)圖（右）

2.5 GO富集分析

GO富集分析中的生物學(xué)過程分析結(jié)果前 3條分別為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肽基酪氨酸磷酸化、磷脂酰肌醇 3-激酶信號(hào)的正調(diào)控；GO富集分析中的細(xì)胞定位分析結(jié)果前3條分別為細(xì)胞核、受體復(fù)合物、細(xì)胞外區(qū)；GO富集分析中的分子功能分析結(jié)果前3條分別蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、磷脂酰肌醇-4, 5-二磷酸3-激酶活性，見圖4。

圖4 Res抗衰老潛在靶點(diǎn)的GO富集分析

2.6 KEGG通路分析

KEGG通路分析中前5條包含有：Ras、PI3KAkt、ErbB、Rap1、FoxO、GnRH、HIF-1信號(hào)通路，見圖5和表2。在PI3K-Akt信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路中都出現(xiàn)了 IGF1、MAPK1、EGFR，見表2。

表2 20條KEGG信號(hào)通路參數(shù)

圖5 Res抗衰老潛在靶點(diǎn)KEGG通路分析

2.7 構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)-GO-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)

將Res抗衰老的潛在治療靶點(diǎn)，取前20條KEGG通路分析，把前10條GO（BP，CC，MF）富集分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件中構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)-GO-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)。在“藥物-疾病-靶點(diǎn)-GO-KEGG 通路”網(wǎng)絡(luò)圖中 EGFR、MAPK1和FGFR1處于核心位置，見圖6。這說明白藜蘆醇通過EGFR、MAPK1和FGFR1調(diào)節(jié)多條通路共同治療衰老。

圖6 “藥物-疾病-靶點(diǎn)-GO-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

細(xì)胞衰老能持續(xù)的對(duì)抗增殖反應(yīng)，產(chǎn)生不經(jīng)歷細(xì)胞死亡的不可逆生長(zhǎng)停滯狀態(tài)[16-17]，在驅(qū)動(dòng)機(jī)體衰老過程中起關(guān)鍵作用[18]。根據(jù)激活信號(hào)的不同，可分為復(fù)制性衰老和過早衰老。復(fù)制性衰老其特征是有限的潛能復(fù)制，將其壽命限制在一定數(shù)量的細(xì)胞分裂中。目前已知這個(gè)過程是通過細(xì)胞端粒（染色體末端的TTAGGG重復(fù)序列）[19-20]縮短觸發(fā)信號(hào)誘導(dǎo)的[21]。另一方面，過早衰老是通過激活致癌基因、抑制基因失活、DNA損傷

和氧化應(yīng)激等生物學(xué)作用實(shí)現(xiàn)的。Res有多種抗衰老作用，例如延緩血管衰老[22-23]以及劑量依賴性延緩細(xì)胞衰老[24]。Res在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中的作用是雙向的，低劑量的Res可以通過誘導(dǎo)早衰來阻止癌細(xì)胞的生長(zhǎng)；然而，Res也能誘導(dǎo)正常原代細(xì)胞衰老。

為了尋找Res抗衰老的關(guān)鍵靶點(diǎn)，本文利用PharmMapper數(shù)據(jù)庫獲取 Res作用靶點(diǎn)，用GeneCard數(shù)據(jù)庫獲取疾病相關(guān)靶點(diǎn)，用Venny圖獲取Res抗衰老靶點(diǎn)。

在PPI網(wǎng)絡(luò)中，靶點(diǎn)互相關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)數(shù)最高的前5名是IGF1、ALB、ESR1、MAPK1、EGFR。此外，Res抗衰老潛在靶點(diǎn)的蛋白互相作用圖還提示 IGF1、ALB、ESR1、MAPK1、EGFR 與 SIRT1相互聯(lián)系。SIRT1是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，下游眾多因子已被發(fā)現(xiàn)對(duì)哺乳動(dòng)物衰老有明顯的抑制作用[25-26]，一方面參與調(diào)控NF-κB、FOXO、p53等，另一方面參與細(xì)胞葡萄糖穩(wěn)態(tài)的保護(hù)，有利于延長(zhǎng)生物體壽命，防止衰老。在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型中，Res能增加Sirtuins活性，抑制過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)人原代角質(zhì)形成細(xì)胞衰老[27]。

FOXO3可影響細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等生物過程，其受Akt1，MAPK1等因子調(diào)節(jié)，在人類角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)較高[28]。胰島素的敏感性和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)受 AMPK-FOXO3的調(diào)控。Res通過 FOXO3參與許多細(xì)胞的基本過程，包括細(xì)胞應(yīng)激的抵抗、胰島素信號(hào)的傳遞和壽命等。敲除FOXO3后，Res不影響細(xì)胞衰老和增殖。因此，Res對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞衰老和增殖的影響是由AMPK-FOXO3信號(hào)途徑調(diào)控的。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)Res對(duì)抗衰老的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行分析。在蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)中MAPK1、IGFR和EGFR處于蛋白相互聯(lián)系的核心位置，與其他靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)度高；GO富集分析和KEGG通路分析提示EGFR、MAPK1和IGFR與信號(hào)通路PI3K-Akt、FoxO和HIF-1存在聯(lián)系；在藥物-疾病-靶點(diǎn)- GO-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)圖中MAPK1、IGFR、EGFR是相關(guān)度最好的靶點(diǎn)，說明他們可能是核心靶點(diǎn)。因此，Res主要通過MAPK1、IGFR和EGFR調(diào)節(jié)胰島素、sirtuin和SIRT1等因子，進(jìn)而影響FoxO、PI3K-Akt和HIF-1信號(hào)通路，調(diào)控衰老，這些結(jié)果為Res抗衰老的發(fā)病機(jī)制提供了新的研究思路。