脂肪干細胞聯(lián)合右旋美托咪定對大鼠急性腎缺血再灌注損傷的保護作用

張建波 林楚妍 萬麗 徐世元

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院疼痛科（廣州510260）；2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院麻醉科（廣州520280）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是臨床常見的器官損傷，主要表現(xiàn)為腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）下降，引起血肌酐（serum creatinine，Scr）及尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的滯留升高。其中30%～40%的AKI 患者在圍術(shù)期發(fā)生，其主要原因為腎缺血再灌注損傷，常見于血流動力學(xué)急劇變化的心血管等大手術(shù)及腎移植手術(shù)后［1］。

目前尚未找到可顯著改善腎缺血再灌注損傷后AKI 生存預(yù)后的治療方法。脂肪干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）作為一種脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞，具有促組織再生、抑制炎癥、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫等功能，近年來廣泛用于器官保護研究領(lǐng)域。研究［2-3］報道，ADSCs 對腎缺血再灌注所致的AKI 發(fā)揮一定的器官保護作用。右旋美托咪定（Dexmedetomidine）作為一種α2 受體激動劑，是圍手術(shù)期常用的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛藥物，有研究報道其對多種器官缺血再灌注損傷包括對腎臟缺血再灌注損傷均具有一定的器官保護作用［4-5］。

在大鼠腎缺血再灌注損傷模型中，相對于單獨使用右旋美托咪定或ADSCs，聯(lián)合使用兩種方法能否產(chǎn)生更強的腎臟保護作用尚不明確。本研究擬探究兩者聯(lián)合使用對大鼠急性腎缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及設(shè)備鹽酸右旋美托咪定注射液（批號：15011432，江蘇恒瑞制藥公司）、肌酐測定試劑盒（Bio Assay Systems 公司）、尿素氮測定試劑盒（Bio Assay Systems 公司）等。動物手術(shù)臺（上?？得泪t(yī)療器械有限公司，中國）、普通光學(xué)顯微鏡（Nikon，日本）、倒置熒光顯微鏡（Nikon 公司）、共聚焦顯微鏡（Nikon 公司）、冰凍切片機（Leica 公司）等。

1.1.2 實驗動物清潔級SD 雄性健康大鼠，11 ～12 周齡，體質(zhì)量350 ～370 g。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物倫理本研究均遵守動物實驗相關(guān)倫理及實驗動物中心相關(guān)使用準則。

1.2.2 實驗動物選擇及分組健康成年雄性SD大鼠40 只，隨機將其分為5 組，每組8 例。（1）空白對照組（Sham 組）：所有大鼠腹腔注射苯巴比妥鈉50 mg/kg，待充分麻醉后，切開腹腔不做任何處理，于關(guān)腹后4 h，經(jīng)尾靜脈注射PBS 液1 mL。（2）缺血-再灌注組（IR 組）：麻醉后開腹將雙側(cè)腎蒂夾閉40 min，移除動脈夾后再灌注4 h 后，經(jīng)尾靜脈注射PBS液1 mL。（3）右旋美托咪定處理組（IR+DEX組）：腹腔注射右旋美托咪定25 μg/kg，30 min后，再按上述方法建立腎缺血-再灌注模型。（4）脂肪干細胞處理組（IR + ADSCs 組）：建立腎缺血-再灌注模型后4 h，經(jīng)尾靜脈注射ADSCs細胞懸液（1 mL的PBS液中含約1×106個ADSCs）。（5）ADSCs 聯(lián)合右旋美托咪定組（IR + DEX +ADSCs 組）：腹腔注射右旋美托咪定25 μg/kg，30 min 后，將雙側(cè)腎動脈夾閉40 min，移除動脈夾再灌注4 h 后，經(jīng)尾靜脈注射ADSCs 細胞懸液。

1.2.3 缺血再灌注誘導(dǎo)AKI 模型的建立（1）取清潔級別，體質(zhì)量350 ～370 g 雄性健康SD 大鼠，于術(shù)前6 h 禁食、不禁水；（2）大鼠麻醉后，開腹游離雙腎，充分暴露雙側(cè)腎蒂，將無創(chuàng)動脈夾持續(xù)夾閉雙側(cè)腎蒂40 min，見腎臟缺血蒼白或瘀血青紫為夾閉動脈有效標志。夾閉后將濕熱的生理鹽水紗布覆蓋腹腔，置大鼠于37 ℃的恒溫毯上保溫，同時監(jiān)測血壓、呼吸指標；（3）40 min 后去除動脈血管夾，見腎臟由缺血蒼白變紅色為再灌注成功；（4）逐層縫合腹腔，術(shù)后繼續(xù)置于37 ℃恒溫毯上保溫，蘇醒后確定生命體征平穩(wěn)置于籠中飼養(yǎng)。

1.2.4 腎功能檢測在0、24、96 h，經(jīng)各組大鼠眼眶后靜脈叢取血液標本500 μL，按照肌酐及尿素氮試劑盒（Bio Assay systems，美國）說明書步驟，測量各組大鼠血清中兩項指標濃度。同時收集各組大鼠0、24、96 h 時間點的尿液，分別檢測各時間點尿液中尿蛋白與肌酐水平，并計算其比值（UP/UC）。

1.2.5 各組大鼠96 h 腎臟HE 染色組織病理學(xué)檢查腎組織標本經(jīng)組織固定、脫水、包埋、切片及染色后，采用盲法由病理科醫(yī)生在光鏡下對腎臟組織損傷進行評分。在200 倍光鏡下，隨機選取每個標本的10個不重疊視野，觀察標本中腎小管壞死、管型形成、上皮細胞刷狀緣脫落、腎小管擴張及腎間質(zhì)出血水腫等情況，按損傷面積評分：正常未受損為0 分，損傷面積≤10%為1 分，11%～25%為2 分，26% ～45%為3 分，46% ～75%為4 分，≥76%為5 分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用G*Power 軟件對樣本量估算，檢驗效能取0.8，估算大鼠試驗前后血Scr 及BUN 兩指標達到統(tǒng)計學(xué)差異（α 值取0.05 雙側(cè)檢驗）所需樣本量。所有計量資料以（）表示，采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析。各組大鼠中計量資料的比較，采用重復(fù)測量的方差分析及單因素方差分析進行統(tǒng)計；腎臟組織損傷評分的等級資料，采用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能結(jié)果

2.1.1 各組在0、24、96 h肌酐結(jié)果不同時間血肌酐比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2 277.5，P＜0.001），且時間因素和分組因素有交互作用（F=350.4，P＜0.001）；各組在三個時間點之間的血肌酐比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表1。

表1 各組在0、24、96 h 的血肌酐結(jié)果Tab.1 The level of serum creatinine at 0，24，96 h in each group ±s，mg/dL

表1 各組在0、24、96 h 的血肌酐結(jié)果Tab.1 The level of serum creatinine at 0，24，96 h in each group ±s，mg/dL

注：表中采用的“a，b，c，d”字母標記同一時間各組之間的差異，不同字母標記的組之間表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；相同字母標記的各組之間，表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。*表示重復(fù)測量方差分析中主體效應(yīng)（時間）的F 值和P 值；“#”標示的分別為時間和組別間交互效應(yīng)的F 值和P 值

分組Sham 組IR 組IR+DEX 組IR+ADSCs 組IR+DEX+ADSCs 組合計F 值P 值0 h 0.23±0.02 0.22±0.02 0.21±0.01 0.21±0.03 0.23±0.02 0.22±0.02 1.49 0.225 24 h 0.29±0.02a 3.61±0.27b 1.96±0.25c 1.71±0.15c 1.66±0.19c 1.84±1.08 567.9＜0.001 96 h 0.50±0.06a 3.94±0.18b 1.49±0.04c 1.41±0.06c 0.70±0.03d 1.61±1.25 1 093.3＜0.001 F 值111.3 1 267.5 293.9 1 020.4 344.2 2 277.5*350.4#P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001*＜0.001#

2.1.2 各組在0、24、96 h 血尿素氮結(jié)果不同時間點血尿素氮比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 465.6，P＜0.001），且時間因素和分組因素有交互效應(yīng)（F= 51.2，P＜0.001）；各組在三個時間點之間的血尿素氮比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組在0、24、96 h 的血尿素氮結(jié)果Tab.2 The level of serum BUN at 0，24，96 h in each group ±s，mg/dL

表2 各組在0、24、96 h 的血尿素氮結(jié)果Tab.2 The level of serum BUN at 0，24，96 h in each group ±s，mg/dL

注：表中采用的“a，b，c，d”字母標記同一時間各組之間的差異，不同字母標記的組之間表示有統(tǒng)計學(xué)差異（P ＜0.05）；相同字母標記的各組之間，表示無統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞0.05）?！?“標示的分別為重復(fù)測量方差分析中主體效應(yīng)（時間）的F 值和P 值；“#”標示的分別為時間和組別間交互效應(yīng)的F 值和P 值

分組Sham 組IR 組IR+DEX 組IR+ADSCs 組IR+DEX+ADSCs 組合計F 值P 值0 h 13.9±1.47a 14.4±2.21a 15.1±2.02a 15.9±2.28a 16.4±2.65a 15.2±0.62 1.695 0.173 24 h 15.6±1.43a 82.6±9.89b 70.4±11.80c 69.6±14.10c 65.2±12.0c 60.7±25.70 46.553＜0.001 96 h 19.9±4.34a 106.0±15.5b 63.4±6.40c 49.6±15.20d 40.8±7.40d 56.0±30.85 70.199＜0.001 F 值8.202 212.877 189.282 76.983 79.234 465.6*51.2#P 值＜0.05＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001*＜0.001#

2.1.3 各組在0、24、96 h尿蛋白/肌酐比值結(jié)果各組主體效應(yīng)（時間效應(yīng)）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4163.2，P＜0.001），且時間因素和分組因素有交互作用（F= 547.2，P＜0.001）。Sham 組內(nèi)不同時間點的尿蛋白/肌酐比值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.174），其余4 組不同時間尿蛋白/肌酐比值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）,見表3。

表3 各組在0、24、96 h 的尿蛋白/肌酐比值結(jié)果Tab.3 The level of urine protein/creatine at 0，24，96 h in each group ±s

表3 各組在0、24、96 h 的尿蛋白/肌酐比值結(jié)果Tab.3 The level of urine protein/creatine at 0，24，96 h in each group ±s

注：表中采用的“a，b，c，d”字母標記同一時間各組之間的差異，不同字母標記的組之間表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；相同字母標記的各組之間，表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。“*“標示的分別為重復(fù)測量方差分析中主體效應(yīng)（時間）的F 值和P 值；“#”標示的分別為時間和組別間交互效應(yīng)的F 值和P 值

分組Sham 組IR 組IR+DEX 組IR+ADSCs 組IR+DEX+ADSCs 組合計F 值P 值0 h 1.19±0.17a 1.22±0.09a 1.20±0.13a 1.19±0.06a 1.24±0.04a 1.21±0.11 0.386 0.817 24 h 1.31±0.07a 7.02±0.14b 4.24±0.19c 3.63±0.14d 2.76±0.22e 3.79±1.92 1 398.9＜0.001 96 h 1.22±0.11a 3.85±1.74b 2.20±0.16c 1.80±0.05d 1.34±0.12a 2.08±0.97 535.4＜0.001 F 值1.986 4408.6 717.8 1547.3 336.4 4163.2*547.2#P 值0.174＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001*＜0.001#

2.1.4 各組大鼠生命體征結(jié)果及脫落情況Sham組大鼠生命體征平穩(wěn)，未有受試脫落情況；IR 組、IR+DEX 組、IR+ADSCs 組均有2 例大鼠因生命體征惡化死亡，而IR+DEX+ADSCs 組1 例大鼠出現(xiàn)呼吸抑制導(dǎo)致實驗后觀察期死亡。

2.2 HE 染色結(jié)果各組大鼠實驗處理96 h 后HE染色結(jié)果，Sham 組：無明顯異常（圖1A）；IR 組：可見顯著的腎小管結(jié)構(gòu)破壞紊亂、管腔擴張、管型形成、同時伴有腎間質(zhì)出血等（圖1B），而IR+DEX 組、IR+ADSCs 組上述病理情況較IR 組有一定改善，腎間質(zhì)出血、水腫減少，僅見較少量管型及腎小管腫脹（圖1C、D），而IR+DEX+ADSCs 組較IR+DEX 組、IR+ADSCs 組的腎組織損傷改善更為顯著，腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)相對完整，腎間質(zhì)出血、水腫基本消失（圖1E）。

圖1 各組96 h 后HE 染色結(jié)果及腎組織損傷評分（100 μm，×200）Fig.1 HE staining of each group after 96 h and scores of kidney pathological injuries（100 μm，×200）

2.3 各組腎臟組織病理損傷評分96 h 腎組織損傷病理結(jié)果顯示，Sham、IR、IR + DEX、IR + ADSCs和IR+DEX+ADSCs 組的96 h 腎組織損傷評分分別為0、（4.25 ± 0.71）、（3.25 ± 0.71）、（3.00 ± 0.53）和（1.88±0.64），各組間損傷評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=32.510，P＜0.001）。

3 討論

脂肪干細胞由ZUK 等［6］于2001年首次在脂肪組織中分離獲得，近年來逐漸成為間充質(zhì)干細胞的研究熱點，在再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域如器官損傷修復(fù)方面呈現(xiàn)出較好的應(yīng)用研究前景。

結(jié)合既往腎缺血再灌注的建模方法及預(yù)實驗結(jié)果，本研究最終采用夾閉雙側(cè)腎動脈40 min 的方案。通過觀察造模后腎臟顏色的典型改變（由紅變蒼白后呈黑紫）及結(jié)合顯微鏡下腎臟病理改變及相關(guān)腎功能指標，驗證建模成功。參考既往的研究報道［7-8］，探索有關(guān)注射ADSCs 的細胞量、時間及途徑，本文選擇ADSCs 的實驗細胞量為1×106，并選擇注射時間為腎缺血再灌注后4 h；既往ADSCs 研究中，關(guān)于注射途徑的有經(jīng)腎動脈、尾靜脈或者局部注射等方法，本研究采用簡便易行的尾靜脈注射方法，以確保實驗的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

有關(guān)右旋美托咪定對器官缺血再灌注損傷保護作用的研究報道，其給藥途徑和濃度均有一定差異。有研究采用右旋美托咪定1、10 μg/kg 兩種濃度靜脈注射的方法，結(jié)果表明缺血前預(yù)先靜脈注射1 μg/kg，比缺血后注射10 μg/kg，具有更佳的腎缺血再灌注損傷的保護作用［9］，也有研究采用持續(xù)靜脈輸注的方法也取得了一定的腎保護作用［10］。既往有關(guān)右旋美托咪定腹腔內(nèi)注射的劑量在10 ～100 μg/kg 之間，缺血前1 h 給藥對器官缺血再灌注的保護作用更為顯著。結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果，確定試驗給藥方案為腎缺血再灌注損傷前30 min、腹腔注射25 μg/kg。

為減少評價者主觀偏倚的發(fā)生，本研究選擇雙盲條件下，由病理科醫(yī)生對各組大鼠腎組織病理損傷情況進行顯微鏡下評估。本研究結(jié)果顯示，IR 組腎臟病理損傷最為嚴重，多數(shù)顯示腎小管管腔重度擴張，上皮細胞大量凋亡壞死，腎小管內(nèi)出現(xiàn)顆粒管型、大量紅細胞管型等，同時有多數(shù)腎間質(zhì)出血、水腫等。IR+DEX、IR+ADSCs 組腎臟病理損傷均得到顯著的緩解；而IR+DEX+ADSCs組則進一步顯著改善。因此，右旋美托咪定和ADSCs 聯(lián)合使用具有更好的腎缺血再灌注組織損傷保護作用。

血肌酐及尿素氮能較客觀地反映腎小球濾過率，是腎臟功能評價的常用指標。尿蛋白/肌酐比值相對于單純的尿蛋白檢測，能更加靈敏地反映腎小管損傷程度。本研究采用上述三種指標能更全面評估腎臟損傷的程度。IR+DEX 組的三項指標均比IR 組明顯降低，同時在腎病理損傷上也有顯著的改善，該結(jié)果與既往多項研究中右旋美托咪定減輕腎損傷結(jié)果是較為一致的［9-12］。在24 h時，三項指標水平更低，且在處理72 h 下降最為顯著，但96 h 后上述指標未進一步顯著下降，其趨勢與多項報道結(jié)果接近。與IR 組比較，IR+ADSCs 組在腎功能和病理組織損傷均有一定程度改善，和既往ADSCs 減輕AKI 的研究結(jié)果相符［8，13］，但各實驗中ADSCs 的用量、給予途徑及評價時間點有所不同，因此在一致的研究方案的對比需進一步探索。本研究中，與處理前比較（0 h），ADSCs 組處理后24 h，血肌酐、尿素氮及尿蛋白/肌酐比值均大幅降低，至96 h 后仍然有小幅度下降；腎臟病理損傷評分結(jié)果也有顯著改善，該結(jié)果與SHEASHAA等［8］報道的結(jié)果變化趨勢吻合；此外有報道［13-15］觀察1 周以上的評價結(jié)果，表明ADSCs 同樣具有改善腎功能并可減輕腎臟纖維化等作用，表明其具有較長期的腎保護作用。

IR+DEX 組和IR+ADSCs 組在實驗處理后24 h的組間比較，兩者對腎臟缺血再灌注損傷后的保護作用是大致接近。值得關(guān)注的是：與上述兩組比較，IR+DEX+ADSCs 組，盡管在24 h 在血肌酐、尿素氮方面無明顯差異，但其處理后96 h 的血肌酐、尿素氮、尿蛋白/肌酐比值及腎損傷評分在都顯著優(yōu)于上述兩組，其中96 h 的尿蛋白/肌酐比值與同組缺血-再灌注處理前（0 h）的水平無明顯差異，說明其對腎小管損傷的修復(fù)作用顯著。

本研究不足之處在于未能進一步探討其保護作用的具體機制，根據(jù)既往報道可能與兩者對腎缺血再灌注后損傷的抑制炎癥、抗氧化應(yīng)激等作用相關(guān)［16-21］。

總之，雖然單獨使用右旋美托咪定或ADSCs，對改善腎缺血再灌注損傷后的腎功能及腎組織損傷均有一定作用，但聯(lián)合使用比單獨使用其中之一，具有更顯著的腎臟保護作用。