• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    脂肪干細胞聯(lián)合右旋美托咪定對大鼠急性腎缺血再灌注損傷的保護作用

    2022-01-03 10:43:00張建波林楚妍萬麗徐世元
    實用醫(yī)學(xué)雜志 2021年23期
    關(guān)鍵詞:右旋尿素氮肌酐

    張建波 林楚妍 萬麗 徐世元

    1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院疼痛科(廣州510260);2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院麻醉科(廣州520280)

    急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是臨床常見的器官損傷,主要表現(xiàn)為腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR)下降,引起血肌酐(serum creatinine,Scr)及尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)的滯留升高。其中30%~40%的AKI 患者在圍術(shù)期發(fā)生,其主要原因為腎缺血再灌注損傷,常見于血流動力學(xué)急劇變化的心血管等大手術(shù)及腎移植手術(shù)后[1]。

    目前尚未找到可顯著改善腎缺血再灌注損傷后AKI 生存預(yù)后的治療方法。脂肪干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)作為一種脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞,具有促組織再生、抑制炎癥、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫等功能,近年來廣泛用于器官保護研究領(lǐng)域。研究[2-3]報道,ADSCs 對腎缺血再灌注所致的AKI 發(fā)揮一定的器官保護作用。右旋美托咪定(Dexmedetomidine)作為一種α2 受體激動劑,是圍手術(shù)期常用的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛藥物,有研究報道其對多種器官缺血再灌注損傷包括對腎臟缺血再灌注損傷均具有一定的器官保護作用[4-5]。

    在大鼠腎缺血再灌注損傷模型中,相對于單獨使用右旋美托咪定或ADSCs,聯(lián)合使用兩種方法能否產(chǎn)生更強的腎臟保護作用尚不明確。本研究擬探究兩者聯(lián)合使用對大鼠急性腎缺血再灌注損傷的保護作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑及設(shè)備鹽酸右旋美托咪定注射液(批號:15011432,江蘇恒瑞制藥公司)、肌酐測定試劑盒(Bio Assay Systems 公司)、尿素氮測定試劑盒(Bio Assay Systems 公司)等。動物手術(shù)臺(上??得泪t(yī)療器械有限公司,中國)、普通光學(xué)顯微鏡(Nikon,日本)、倒置熒光顯微鏡(Nikon 公司)、共聚焦顯微鏡(Nikon 公司)、冰凍切片機(Leica 公司)等。

    1.1.2 實驗動物清潔級SD 雄性健康大鼠,11 ~12 周齡,體質(zhì)量350 ~370 g。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 動物倫理本研究均遵守動物實驗相關(guān)倫理及實驗動物中心相關(guān)使用準則。

    1.2.2 實驗動物選擇及分組健康成年雄性SD大鼠40 只,隨機將其分為5 組,每組8 例。(1)空白對照組(Sham 組):所有大鼠腹腔注射苯巴比妥鈉50 mg/kg,待充分麻醉后,切開腹腔不做任何處理,于關(guān)腹后4 h,經(jīng)尾靜脈注射PBS 液1 mL。(2)缺血-再灌注組(IR 組):麻醉后開腹將雙側(cè)腎蒂夾閉40 min,移除動脈夾后再灌注4 h 后,經(jīng)尾靜脈注射PBS液1 mL。(3)右旋美托咪定處理組(IR+DEX組):腹腔注射右旋美托咪定25 μg/kg,30 min后,再按上述方法建立腎缺血-再灌注模型。(4)脂肪干細胞處理組(IR + ADSCs 組):建立腎缺血-再灌注模型后4 h,經(jīng)尾靜脈注射ADSCs細胞懸液(1 mL的PBS液中含約1×106個ADSCs)。(5)ADSCs 聯(lián)合右旋美托咪定組(IR + DEX +ADSCs 組):腹腔注射右旋美托咪定25 μg/kg,30 min 后,將雙側(cè)腎動脈夾閉40 min,移除動脈夾再灌注4 h 后,經(jīng)尾靜脈注射ADSCs 細胞懸液。

    1.2.3 缺血再灌注誘導(dǎo)AKI 模型的建立(1)取清潔級別,體質(zhì)量350 ~370 g 雄性健康SD 大鼠,于術(shù)前6 h 禁食、不禁水;(2)大鼠麻醉后,開腹游離雙腎,充分暴露雙側(cè)腎蒂,將無創(chuàng)動脈夾持續(xù)夾閉雙側(cè)腎蒂40 min,見腎臟缺血蒼白或瘀血青紫為夾閉動脈有效標志。夾閉后將濕熱的生理鹽水紗布覆蓋腹腔,置大鼠于37 ℃的恒溫毯上保溫,同時監(jiān)測血壓、呼吸指標;(3)40 min 后去除動脈血管夾,見腎臟由缺血蒼白變紅色為再灌注成功;(4)逐層縫合腹腔,術(shù)后繼續(xù)置于37 ℃恒溫毯上保溫,蘇醒后確定生命體征平穩(wěn)置于籠中飼養(yǎng)。

    1.2.4 腎功能檢測在0、24、96 h,經(jīng)各組大鼠眼眶后靜脈叢取血液標本500 μL,按照肌酐及尿素氮試劑盒(Bio Assay systems,美國)說明書步驟,測量各組大鼠血清中兩項指標濃度。同時收集各組大鼠0、24、96 h 時間點的尿液,分別檢測各時間點尿液中尿蛋白與肌酐水平,并計算其比值(UP/UC)。

    1.2.5 各組大鼠96 h 腎臟HE 染色組織病理學(xué)檢查腎組織標本經(jīng)組織固定、脫水、包埋、切片及染色后,采用盲法由病理科醫(yī)生在光鏡下對腎臟組織損傷進行評分。在200 倍光鏡下,隨機選取每個標本的10個不重疊視野,觀察標本中腎小管壞死、管型形成、上皮細胞刷狀緣脫落、腎小管擴張及腎間質(zhì)出血水腫等情況,按損傷面積評分:正常未受損為0 分,損傷面積≤10%為1 分,11%~25%為2 分,26% ~45%為3 分,46% ~75%為4 分,≥76%為5 分。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用G*Power 軟件對樣本量估算,檢驗效能取0.8,估算大鼠試驗前后血Scr 及BUN 兩指標達到統(tǒng)計學(xué)差異(α 值取0.05 雙側(cè)檢驗)所需樣本量。所有計量資料以()表示,采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析。各組大鼠中計量資料的比較,采用重復(fù)測量的方差分析及單因素方差分析進行統(tǒng)計;腎臟組織損傷評分的等級資料,采用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 腎功能結(jié)果

    2.1.1 各組在0、24、96 h肌酐結(jié)果不同時間血肌酐比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2 277.5,P<0.001),且時間因素和分組因素有交互作用(F=350.4,P<0.001);各組在三個時間點之間的血肌酐比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),見表1。

    表1 各組在0、24、96 h 的血肌酐結(jié)果Tab.1 The level of serum creatinine at 0,24,96 h in each group ±s,mg/dL

    表1 各組在0、24、96 h 的血肌酐結(jié)果Tab.1 The level of serum creatinine at 0,24,96 h in each group ±s,mg/dL

    注:表中采用的“a,b,c,d”字母標記同一時間各組之間的差異,不同字母標記的組之間表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05);相同字母標記的各組之間,表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。*表示重復(fù)測量方差分析中主體效應(yīng)(時間)的F 值和P 值;“#”標示的分別為時間和組別間交互效應(yīng)的F 值和P 值

    分組Sham 組IR 組IR+DEX 組IR+ADSCs 組IR+DEX+ADSCs 組合計F 值P 值0 h 0.23±0.02 0.22±0.02 0.21±0.01 0.21±0.03 0.23±0.02 0.22±0.02 1.49 0.225 24 h 0.29±0.02a 3.61±0.27b 1.96±0.25c 1.71±0.15c 1.66±0.19c 1.84±1.08 567.9<0.001 96 h 0.50±0.06a 3.94±0.18b 1.49±0.04c 1.41±0.06c 0.70±0.03d 1.61±1.25 1 093.3<0.001 F 值111.3 1 267.5 293.9 1 020.4 344.2 2 277.5*350.4#P 值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001*<0.001#

    2.1.2 各組在0、24、96 h 血尿素氮結(jié)果不同時間點血尿素氮比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 465.6,P<0.001),且時間因素和分組因素有交互效應(yīng)(F= 51.2,P<0.001);各組在三個時間點之間的血尿素氮比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

    表2 各組在0、24、96 h 的血尿素氮結(jié)果Tab.2 The level of serum BUN at 0,24,96 h in each group ±s,mg/dL

    表2 各組在0、24、96 h 的血尿素氮結(jié)果Tab.2 The level of serum BUN at 0,24,96 h in each group ±s,mg/dL

    注:表中采用的“a,b,c,d”字母標記同一時間各組之間的差異,不同字母標記的組之間表示有統(tǒng)計學(xué)差異(P <0.05);相同字母標記的各組之間,表示無統(tǒng)計學(xué)差異(P >0.05)?!?“標示的分別為重復(fù)測量方差分析中主體效應(yīng)(時間)的F 值和P 值;“#”標示的分別為時間和組別間交互效應(yīng)的F 值和P 值

    分組Sham 組IR 組IR+DEX 組IR+ADSCs 組IR+DEX+ADSCs 組合計F 值P 值0 h 13.9±1.47a 14.4±2.21a 15.1±2.02a 15.9±2.28a 16.4±2.65a 15.2±0.62 1.695 0.173 24 h 15.6±1.43a 82.6±9.89b 70.4±11.80c 69.6±14.10c 65.2±12.0c 60.7±25.70 46.553<0.001 96 h 19.9±4.34a 106.0±15.5b 63.4±6.40c 49.6±15.20d 40.8±7.40d 56.0±30.85 70.199<0.001 F 值8.202 212.877 189.282 76.983 79.234 465.6*51.2#P 值<0.05<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001*<0.001#

    2.1.3 各組在0、24、96 h尿蛋白/肌酐比值結(jié)果各組主體效應(yīng)(時間效應(yīng))差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4163.2,P<0.001),且時間因素和分組因素有交互作用(F= 547.2,P<0.001)。Sham 組內(nèi)不同時間點的尿蛋白/肌酐比值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P= 0.174),其余4 組不同時間尿蛋白/肌酐比值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),見表3。

    表3 各組在0、24、96 h 的尿蛋白/肌酐比值結(jié)果Tab.3 The level of urine protein/creatine at 0,24,96 h in each group ±s

    表3 各組在0、24、96 h 的尿蛋白/肌酐比值結(jié)果Tab.3 The level of urine protein/creatine at 0,24,96 h in each group ±s

    注:表中采用的“a,b,c,d”字母標記同一時間各組之間的差異,不同字母標記的組之間表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05);相同字母標記的各組之間,表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。“*“標示的分別為重復(fù)測量方差分析中主體效應(yīng)(時間)的F 值和P 值;“#”標示的分別為時間和組別間交互效應(yīng)的F 值和P 值

    分組Sham 組IR 組IR+DEX 組IR+ADSCs 組IR+DEX+ADSCs 組合計F 值P 值0 h 1.19±0.17a 1.22±0.09a 1.20±0.13a 1.19±0.06a 1.24±0.04a 1.21±0.11 0.386 0.817 24 h 1.31±0.07a 7.02±0.14b 4.24±0.19c 3.63±0.14d 2.76±0.22e 3.79±1.92 1 398.9<0.001 96 h 1.22±0.11a 3.85±1.74b 2.20±0.16c 1.80±0.05d 1.34±0.12a 2.08±0.97 535.4<0.001 F 值1.986 4408.6 717.8 1547.3 336.4 4163.2*547.2#P 值0.174<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001*<0.001#

    2.1.4 各組大鼠生命體征結(jié)果及脫落情況Sham組大鼠生命體征平穩(wěn),未有受試脫落情況;IR 組、IR+DEX 組、IR+ADSCs 組均有2 例大鼠因生命體征惡化死亡,而IR+DEX+ADSCs 組1 例大鼠出現(xiàn)呼吸抑制導(dǎo)致實驗后觀察期死亡。

    2.2 HE 染色結(jié)果各組大鼠實驗處理96 h 后HE染色結(jié)果,Sham 組:無明顯異常(圖1A);IR 組:可見顯著的腎小管結(jié)構(gòu)破壞紊亂、管腔擴張、管型形成、同時伴有腎間質(zhì)出血等(圖1B),而IR+DEX 組、IR+ADSCs 組上述病理情況較IR 組有一定改善,腎間質(zhì)出血、水腫減少,僅見較少量管型及腎小管腫脹(圖1C、D),而IR+DEX+ADSCs 組較IR+DEX 組、IR+ADSCs 組的腎組織損傷改善更為顯著,腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)相對完整,腎間質(zhì)出血、水腫基本消失(圖1E)。

    圖1 各組96 h 后HE 染色結(jié)果及腎組織損傷評分(100 μm,×200)Fig.1 HE staining of each group after 96 h and scores of kidney pathological injuries(100 μm,×200)

    2.3 各組腎臟組織病理損傷評分96 h 腎組織損傷病理結(jié)果顯示,Sham、IR、IR + DEX、IR + ADSCs和IR+DEX+ADSCs 組的96 h 腎組織損傷評分分別為0、(4.25 ± 0.71)、(3.25 ± 0.71)、(3.00 ± 0.53)和(1.88±0.64),各組間損傷評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=32.510,P<0.001)。

    3 討論

    脂肪干細胞由ZUK 等[6]于2001年首次在脂肪組織中分離獲得,近年來逐漸成為間充質(zhì)干細胞的研究熱點,在再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域如器官損傷修復(fù)方面呈現(xiàn)出較好的應(yīng)用研究前景。

    結(jié)合既往腎缺血再灌注的建模方法及預(yù)實驗結(jié)果,本研究最終采用夾閉雙側(cè)腎動脈40 min 的方案。通過觀察造模后腎臟顏色的典型改變(由紅變蒼白后呈黑紫)及結(jié)合顯微鏡下腎臟病理改變及相關(guān)腎功能指標,驗證建模成功。參考既往的研究報道[7-8],探索有關(guān)注射ADSCs 的細胞量、時間及途徑,本文選擇ADSCs 的實驗細胞量為1×106,并選擇注射時間為腎缺血再灌注后4 h;既往ADSCs 研究中,關(guān)于注射途徑的有經(jīng)腎動脈、尾靜脈或者局部注射等方法,本研究采用簡便易行的尾靜脈注射方法,以確保實驗的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

    有關(guān)右旋美托咪定對器官缺血再灌注損傷保護作用的研究報道,其給藥途徑和濃度均有一定差異。有研究采用右旋美托咪定1、10 μg/kg 兩種濃度靜脈注射的方法,結(jié)果表明缺血前預(yù)先靜脈注射1 μg/kg,比缺血后注射10 μg/kg,具有更佳的腎缺血再灌注損傷的保護作用[9],也有研究采用持續(xù)靜脈輸注的方法也取得了一定的腎保護作用[10]。既往有關(guān)右旋美托咪定腹腔內(nèi)注射的劑量在10 ~100 μg/kg 之間,缺血前1 h 給藥對器官缺血再灌注的保護作用更為顯著。結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果,確定試驗給藥方案為腎缺血再灌注損傷前30 min、腹腔注射25 μg/kg。

    為減少評價者主觀偏倚的發(fā)生,本研究選擇雙盲條件下,由病理科醫(yī)生對各組大鼠腎組織病理損傷情況進行顯微鏡下評估。本研究結(jié)果顯示,IR 組腎臟病理損傷最為嚴重,多數(shù)顯示腎小管管腔重度擴張,上皮細胞大量凋亡壞死,腎小管內(nèi)出現(xiàn)顆粒管型、大量紅細胞管型等,同時有多數(shù)腎間質(zhì)出血、水腫等。IR+DEX、IR+ADSCs 組腎臟病理損傷均得到顯著的緩解;而IR+DEX+ADSCs組則進一步顯著改善。因此,右旋美托咪定和ADSCs 聯(lián)合使用具有更好的腎缺血再灌注組織損傷保護作用。

    血肌酐及尿素氮能較客觀地反映腎小球濾過率,是腎臟功能評價的常用指標。尿蛋白/肌酐比值相對于單純的尿蛋白檢測,能更加靈敏地反映腎小管損傷程度。本研究采用上述三種指標能更全面評估腎臟損傷的程度。IR+DEX 組的三項指標均比IR 組明顯降低,同時在腎病理損傷上也有顯著的改善,該結(jié)果與既往多項研究中右旋美托咪定減輕腎損傷結(jié)果是較為一致的[9-12]。在24 h時,三項指標水平更低,且在處理72 h 下降最為顯著,但96 h 后上述指標未進一步顯著下降,其趨勢與多項報道結(jié)果接近。與IR 組比較,IR+ADSCs 組在腎功能和病理組織損傷均有一定程度改善,和既往ADSCs 減輕AKI 的研究結(jié)果相符[8,13],但各實驗中ADSCs 的用量、給予途徑及評價時間點有所不同,因此在一致的研究方案的對比需進一步探索。本研究中,與處理前比較(0 h),ADSCs 組處理后24 h,血肌酐、尿素氮及尿蛋白/肌酐比值均大幅降低,至96 h 后仍然有小幅度下降;腎臟病理損傷評分結(jié)果也有顯著改善,該結(jié)果與SHEASHAA等[8]報道的結(jié)果變化趨勢吻合;此外有報道[13-15]觀察1 周以上的評價結(jié)果,表明ADSCs 同樣具有改善腎功能并可減輕腎臟纖維化等作用,表明其具有較長期的腎保護作用。

    IR+DEX 組和IR+ADSCs 組在實驗處理后24 h的組間比較,兩者對腎臟缺血再灌注損傷后的保護作用是大致接近。值得關(guān)注的是:與上述兩組比較,IR+DEX+ADSCs 組,盡管在24 h 在血肌酐、尿素氮方面無明顯差異,但其處理后96 h 的血肌酐、尿素氮、尿蛋白/肌酐比值及腎損傷評分在都顯著優(yōu)于上述兩組,其中96 h 的尿蛋白/肌酐比值與同組缺血-再灌注處理前(0 h)的水平無明顯差異,說明其對腎小管損傷的修復(fù)作用顯著。

    本研究不足之處在于未能進一步探討其保護作用的具體機制,根據(jù)既往報道可能與兩者對腎缺血再灌注后損傷的抑制炎癥、抗氧化應(yīng)激等作用相關(guān)[16-21]。

    總之,雖然單獨使用右旋美托咪定或ADSCs,對改善腎缺血再灌注損傷后的腎功能及腎組織損傷均有一定作用,但聯(lián)合使用比單獨使用其中之一,具有更顯著的腎臟保護作用。

    猜你喜歡
    右旋尿素氮肌酐
    急性上消化道出血時尿素氮變化、變化規(guī)律及變化的意義分析
    淺談自然界的左右旋現(xiàn)象
    血肌酐水平對慢性心力衰竭患者預(yù)后判斷的臨床意義
    肌酐-胱抑素C公式在糖尿病腎病超濾過檢出中的作用
    右旋美托咪定靜脈泵注治療麻醉誘導(dǎo)后陰莖勃起的效果分析
    右旋美托咪啶增強局麻藥對坐骨神經(jīng)的阻滯作用
    判斷腎功能的可靠旨標血肌酐
    血肌酐、胱抑素C、簡化MDRD和Le Bricon公式在評估腎移植術(shù)后腎功能中的作用
    羥丙基-β-環(huán)糊精包合對右旋龍腦性質(zhì)的影響*
    脲酶/硝化抑制劑對尿素氮在白漿土中轉(zhuǎn)化的影響
    中文字幕制服av| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 青青草视频在线视频观看| av女优亚洲男人天堂| 亚洲精品一区蜜桃| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品一区二区免费观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产精品一区二区精品视频观看| 91成人精品电影| 伦理电影大哥的女人| 男人操女人黄网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 一级爰片在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 我的亚洲天堂| 国产一级毛片在线| 赤兔流量卡办理| 高清黄色对白视频在线免费看| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 午夜久久久在线观看| 超碰成人久久| 国产淫语在线视频| 日韩人妻精品一区2区三区| xxx大片免费视频| 咕卡用的链子| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 免费观看av网站的网址| 99热国产这里只有精品6| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产成人系列免费观看| 久热这里只有精品99| 精品人妻在线不人妻| 亚洲精品一二三| 大陆偷拍与自拍| 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品蜜桃在线观看| 91精品三级在线观看| 久久性视频一级片| 亚洲,一卡二卡三卡| 蜜桃国产av成人99| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产极品粉嫩免费观看在线| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 日日啪夜夜爽| 国产成人精品久久久久久| 久久久久视频综合| 水蜜桃什么品种好| 亚洲久久久国产精品| 青草久久国产| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产乱人偷精品视频| 国产精品一区二区在线观看99| 操出白浆在线播放| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美激情高清一区二区三区 | 亚洲国产精品成人久久小说| 国产一卡二卡三卡精品 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 少妇精品久久久久久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品一区二区在线不卡| 飞空精品影院首页| 天天添夜夜摸| 2018国产大陆天天弄谢| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲,欧美精品.| 国产黄频视频在线观看| 国产免费视频播放在线视频| av线在线观看网站| 制服丝袜香蕉在线| 丰满迷人的少妇在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 看十八女毛片水多多多| 啦啦啦在线观看免费高清www| av不卡在线播放| 久久久国产欧美日韩av| 久久免费观看电影| 久久青草综合色| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品.久久久| 亚洲国产av影院在线观看| netflix在线观看网站| 日日啪夜夜爽| 人成视频在线观看免费观看| 久久久久久久久免费视频了| 秋霞在线观看毛片| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人手机av| 最新的欧美精品一区二区| 黄色 视频免费看| 大片电影免费在线观看免费| 成人漫画全彩无遮挡| 国产在视频线精品| 国产精品久久久人人做人人爽| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美精品av麻豆av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 在线精品无人区一区二区三| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产成人av激情在线播放| 美女视频免费永久观看网站| 免费观看av网站的网址| 少妇的丰满在线观看| 五月天丁香电影| 热99久久久久精品小说推荐| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲欧美清纯卡通| 熟女av电影| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 嫩草影院入口| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产精品一国产av| 日韩欧美精品免费久久| 午夜免费观看性视频| 两性夫妻黄色片| 在线观看免费高清a一片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 综合色丁香网| 久久久久久人妻| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 在线观看国产h片| 老司机靠b影院| 国产成人精品在线电影| √禁漫天堂资源中文www| 久久精品久久久久久久性| av有码第一页| 日韩av免费高清视频| 韩国av在线不卡| 久久久久精品人妻al黑| 精品久久蜜臀av无| 蜜桃国产av成人99| 永久免费av网站大全| 两个人看的免费小视频| 免费黄频网站在线观看国产| 免费人妻精品一区二区三区视频| 看免费av毛片| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品无大码| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲天堂av无毛| 丰满少妇做爰视频| 亚洲,欧美,日韩| 少妇人妻久久综合中文| 一级黄片播放器| 国产成人精品福利久久| av网站在线播放免费| 久久精品久久久久久久性| 亚洲av电影在线进入| 777米奇影视久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精品美女久久av网站| 中国三级夫妇交换| 婷婷成人精品国产| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日日爽夜夜爽网站| h视频一区二区三区| 两性夫妻黄色片| 一区二区三区乱码不卡18| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产欧美亚洲国产| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 在线免费观看不下载黄p国产| 看免费成人av毛片| av一本久久久久| 18禁动态无遮挡网站| 欧美激情高清一区二区三区 | 久久女婷五月综合色啪小说| 国产激情久久老熟女| 亚洲精品中文字幕在线视频| 制服丝袜香蕉在线| 久久 成人 亚洲| 在线观看一区二区三区激情| 一区在线观看完整版| av不卡在线播放| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日本wwww免费看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产精品.久久久| 国产激情久久老熟女| 欧美成人精品欧美一级黄| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 在线观看国产h片| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲美女黄色视频免费看| 婷婷色综合www| 亚洲成人国产一区在线观看 | 一本久久精品| 在线天堂中文资源库| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产熟女欧美一区二区| 免费观看性生交大片5| 免费少妇av软件| 观看av在线不卡| 亚洲国产精品成人久久小说| 叶爱在线成人免费视频播放| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美精品高潮呻吟av久久| 街头女战士在线观看网站| 一本久久精品| 女人久久www免费人成看片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久99精品国语久久久| 99久国产av精品国产电影| 十八禁网站网址无遮挡| 久久ye,这里只有精品| 亚洲美女搞黄在线观看| 青草久久国产| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产成人精品久久久久久| 国产99久久九九免费精品| 男人添女人高潮全过程视频| av片东京热男人的天堂| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品 国内视频| 免费观看性生交大片5| 美女中出高潮动态图| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 下体分泌物呈黄色| 国产精品av久久久久免费| 久久热在线av| 欧美av亚洲av综合av国产av | 免费少妇av软件| 精品国产乱码久久久久久小说| 九色亚洲精品在线播放| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品人妻在线不人妻| 色婷婷av一区二区三区视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 一级,二级,三级黄色视频| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲精品国产av蜜桃| 电影成人av| 国产亚洲欧美精品永久| 蜜桃国产av成人99| 国产精品国产三级专区第一集| 一本大道久久a久久精品| 亚洲国产日韩一区二区| 中国国产av一级| 国产日韩欧美在线精品| 精品久久久久久电影网| 免费看av在线观看网站| 久久免费观看电影| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 我的亚洲天堂| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久久精品国产欧美久久久 | 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲久久久国产精品| 国产男女内射视频| 97在线人人人人妻| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲精品在线美女| 国产精品国产三级专区第一集| 国产精品熟女久久久久浪| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 尾随美女入室| av天堂久久9| 国产一区有黄有色的免费视频| 免费在线观看黄色视频的| 一级黄片播放器| 在线看a的网站| 男男h啪啪无遮挡| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲av福利一区| 十八禁高潮呻吟视频| 制服诱惑二区| 激情视频va一区二区三区| 男女免费视频国产| 欧美乱码精品一区二区三区| 黑丝袜美女国产一区| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲男人天堂网一区| 欧美中文综合在线视频| 美女午夜性视频免费| 亚洲美女视频黄频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产在视频线精品| 久久国产精品大桥未久av| 综合色丁香网| 亚洲在久久综合| 久久ye,这里只有精品| 日韩电影二区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日韩电影二区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 男人添女人高潮全过程视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 日韩一区二区三区影片| 老鸭窝网址在线观看| 高清欧美精品videossex| 90打野战视频偷拍视频| 色播在线永久视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 人人澡人人妻人| 成人午夜精彩视频在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 熟女av电影| 欧美少妇被猛烈插入视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 99久久人妻综合| 少妇被粗大猛烈的视频| 999久久久国产精品视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 韩国av在线不卡| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲一区中文字幕在线| 香蕉丝袜av| 咕卡用的链子| 国产精品av久久久久免费| 午夜日韩欧美国产| 国产高清不卡午夜福利| 日韩成人av中文字幕在线观看| 1024香蕉在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久久视频综合| 亚洲国产看品久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲第一av免费看| xxx大片免费视频| av在线老鸭窝| 各种免费的搞黄视频| 99久久人妻综合| 一区二区av电影网| 十八禁高潮呻吟视频| 精品国产一区二区久久| 新久久久久国产一级毛片| 极品人妻少妇av视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 街头女战士在线观看网站| 99热全是精品| 国产精品无大码| 另类精品久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 悠悠久久av| 国产黄频视频在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 日本av免费视频播放| 秋霞在线观看毛片| 欧美精品一区二区免费开放| 在线观看www视频免费| 国产极品天堂在线| 一级黄片播放器| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 啦啦啦啦在线视频资源| 69精品国产乱码久久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 美女主播在线视频| 男人舔女人的私密视频| 国产成人免费观看mmmm| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产一区亚洲一区在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 久久影院123| 亚洲国产精品999| 国产精品女同一区二区软件| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久久久久久久久久免费av| netflix在线观看网站| 人体艺术视频欧美日本| 久久久久网色| 精品福利永久在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 国产黄色免费在线视频| 999精品在线视频| av福利片在线| 熟妇人妻不卡中文字幕| 成人国语在线视频| 精品视频人人做人人爽| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲,欧美,日韩| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产成人精品福利久久| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲第一区二区三区不卡| 在现免费观看毛片| 午夜日本视频在线| 亚洲精品国产区一区二| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 免费不卡黄色视频| 国产淫语在线视频| 久久热在线av| 国产精品.久久久| 99九九在线精品视频| 国产有黄有色有爽视频| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 在线观看www视频免费| 观看av在线不卡| 乱人伦中国视频| 各种免费的搞黄视频| 亚洲国产看品久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 热re99久久国产66热| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 五月天丁香电影| 最近中文字幕2019免费版| 高清不卡的av网站| 高清视频免费观看一区二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一级毛片 在线播放| 亚洲在久久综合| √禁漫天堂资源中文www| av线在线观看网站| 国产精品偷伦视频观看了| 不卡av一区二区三区| 90打野战视频偷拍视频| 天堂8中文在线网| 1024香蕉在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 无遮挡黄片免费观看| 人人妻人人澡人人看| 亚洲五月色婷婷综合| 国产精品av久久久久免费| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 美女中出高潮动态图| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 99热全是精品| 精品福利永久在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 电影成人av| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 老司机影院毛片| 日日爽夜夜爽网站| 99re6热这里在线精品视频| 国产视频首页在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 久久久久视频综合| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 日韩中文字幕欧美一区二区 | 嫩草影院入口| 国产成人精品无人区| 亚洲三区欧美一区| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产成人一区二区在线| 国产99久久九九免费精品| 最近中文字幕2019免费版| 久久久久精品性色| 日本色播在线视频| 日本91视频免费播放| 高清av免费在线| 国产成人一区二区在线| 久久精品国产综合久久久| 人成视频在线观看免费观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日本vs欧美在线观看视频| 国产色婷婷99| 黄片播放在线免费| 精品酒店卫生间| av在线播放精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 午夜91福利影院| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 欧美激情高清一区二区三区 | 日韩不卡一区二区三区视频在线| 男人添女人高潮全过程视频| 日本av手机在线免费观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 一级黄片播放器| 视频区图区小说| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 人人澡人人妻人| 最近中文字幕2019免费版| 国产黄色视频一区二区在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 男女国产视频网站| 色94色欧美一区二区| 精品久久久精品久久久| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 免费黄网站久久成人精品| 大片电影免费在线观看免费| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 成年动漫av网址| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩电影二区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品一二三区在线看| 成人国产麻豆网| 伊人久久国产一区二区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久久国产欧美日韩av| av片东京热男人的天堂| 搡老岳熟女国产| 成年女人毛片免费观看观看9 | 婷婷色综合大香蕉| 国产爽快片一区二区三区| 又大又黄又爽视频免费| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 香蕉国产在线看| 悠悠久久av| 99久久精品国产亚洲精品| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧洲日产国产| 男女无遮挡免费网站观看| svipshipincom国产片| 国产精品国产av在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久久国产精品麻豆| 日本欧美国产在线视频| 这个男人来自地球电影免费观看 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产精品国产三级国产专区5o| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 嫩草影视91久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久天堂一区二区三区四区| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲,欧美,日韩| av国产精品久久久久影院| 黄色视频不卡| 国产成人免费无遮挡视频| 男女之事视频高清在线观看 | 啦啦啦视频在线资源免费观看| 伦理电影大哥的女人| 国产在视频线精品| 国产成人精品无人区| 下体分泌物呈黄色| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产精品一区二区精品视频观看| 香蕉国产在线看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 免费av中文字幕在线| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久久亚洲精品成人影院| 美女视频免费永久观看网站| 日本av免费视频播放| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产国语露脸激情在线看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 美女扒开内裤让男人捅视频| kizo精华| 9色porny在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 在线观看国产h片| 在线天堂中文资源库| 精品久久久精品久久久| 欧美在线一区亚洲| 久久精品久久久久久久性| 99热国产这里只有精品6| 91成人精品电影| 欧美中文综合在线视频| 亚洲男人天堂网一区| 男男h啪啪无遮挡| 满18在线观看网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲av国产av综合av卡| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品亚洲av一区麻豆 | av一本久久久久| 亚洲国产日韩一区二区| 日韩免费高清中文字幕av| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 操美女的视频在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产99久久九九免费精品| 99精国产麻豆久久婷婷| av女优亚洲男人天堂| 日本午夜av视频| 国产av一区二区精品久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲天堂av无毛| 久久毛片免费看一区二区三区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 男人操女人黄网站| av视频免费观看在线观看| 我要看黄色一级片免费的| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲成人国产一区在线观看 | 日韩欧美一区视频在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 69精品国产乱码久久久| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日本欧美国产在线视频| 亚洲av成人精品一二三区|