羥丙基-β-環(huán)糊精包合對右旋龍腦性質(zhì)的影響*

蘇健裕 陳建平 陳玲 李琳 朱良 徐振波

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

右旋龍腦(d-borneol)又名天然冰片、梅片，分子式為C10H18O.自古以來，右旋龍腦就是一種名貴的珍稀藥材，在醫(yī)藥、化妝品、香料、食品工業(yè)上應(yīng)用廣泛［1-2］.中醫(yī)認(rèn)為，右旋龍腦具有去翳明目、開竅醒神、消腫止痛等功效［3］;現(xiàn)代藥理表明，右旋龍腦具有促進(jìn)血腦屏障開放、促進(jìn)其他藥物透過血腦屏障等作用［4］;因而，右旋龍腦在心腦血管疾病方面具有廣闊的應(yīng)用前景.但由于右旋龍腦水溶性差，且沸點(diǎn)較低，室溫即升華，制備的成藥在貯存期內(nèi)極不穩(wěn)定，從而嚴(yán)重影響了其功效的發(fā)揮［5］，應(yīng)用范圍受到很大的限制.

環(huán)糊精(CD)是由6個或6個以上的D-吡喃葡萄糖單元環(huán)狀排列而成的一組低聚糖的總稱，分子為略呈錐形的圓筒形，分子空腔的外側(cè)為親水性基團(tuán)，內(nèi)側(cè)為疏水性基團(tuán)，腔內(nèi)有微弱的極性［6］.羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)作為環(huán)糊精的衍生物，常溫下在水中的溶解程度一般超過50%，且在人體內(nèi)基本上不被分解代謝，也不累積，非腸道給藥時基本上全部隨尿液排出體外，且可促使被包合物質(zhì)迅速釋放，表面活性和溶血活性低，使用更安全［7］.目前研究認(rèn)為，難溶性藥物與HP-β-CD形成包合物后，可顯著改善藥物的穩(wěn)定性、溶解度和生物利用度等藥劑學(xué)性質(zhì)，因此，將藥物制成包合物具有重要的臨床意義［8］.鑒于 HP-β-CD 包合物具有增加藥物穩(wěn)定性、防止揮發(fā)、降低藥物刺激性、增大藥物溶解度等作用［5］，且目前國內(nèi)對右旋龍腦/HP-β-CD 包合物的研究未見報道，文中將右旋龍腦與HP-β-CD制成包合物，并通過揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性、抗光解性以及相溶解度實(shí)驗(yàn)考察右旋龍腦/HP-β-CD包合物的穩(wěn)定性和溶解性，以期為右旋龍腦/HP-β-CD包合物在臨床上的合理應(yīng)用、給藥方案的優(yōu)化、藥物劑型的改進(jìn)以及質(zhì)量控制等提供理論指導(dǎo).

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器

主要實(shí)驗(yàn)材料如下:右旋龍腦，純度≥98%，廣東嘉應(yīng)制藥股份有限公司產(chǎn)品;右旋龍腦對照品，純度為99.9%，中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品，批號111688-200501;HP-β-CD，山東新大精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品，食品級;無水乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純.

主要實(shí)驗(yàn)儀器如下:Agilent 6890N氣相色譜儀，美國Agilent公司生產(chǎn);Advantage真空冷凍干燥機(jī)，美國 VirTis公司生產(chǎn);BS224S電子天平，德國Sartorius公司生產(chǎn);DHG-9123電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);GXZ智能光照培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司生產(chǎn);DSCQ100差示熱掃描量熱儀(DSC)，美國TA公司生產(chǎn);SB3200超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn);D8 ADVANCE X-射線衍射儀(XRD)，德國Bruker公司生產(chǎn).

1.2 方法

1.2.1 右旋龍腦含量的測定

首先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.精密稱取右旋龍腦對照品250mg置于50mL容量瓶中，加無水乙醇定容;分別吸取上述溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于10mL容量瓶中，加無水乙醇定容;用微孔濾膜過濾，取1μL注入氣相色譜儀中測定;以右旋龍腦濃度(x)為橫坐標(biāo)，右旋龍腦峰面積(y)為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程 y=1307x+10.14，r2=0.9998.這表明在0.25～1.75mol/L范圍內(nèi)右旋龍腦的峰面積與其濃度的線性關(guān)系良好.

接著進(jìn)行供試品溶液的制備.取包合物樣品100mg，精密稱定，置具塞離心管中，精密加入無水乙醇20mL，密塞，搖勻，超聲處理30 min.2500 r/min下離心10min，吸取上清液，用微孔濾膜過濾，即得供試品溶液.

然后進(jìn)行精密度、重復(fù)性和加樣回收率實(shí)驗(yàn).精密度實(shí)驗(yàn):精密吸取同一包合物供試品溶液1μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定右旋龍腦的峰面積，計(jì)算得其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.72%.重復(fù)性實(shí)驗(yàn):精密稱取同一包合物樣品5份，制備供試品溶液，制樣，測定右旋龍腦的峰面積，計(jì)算得其RSD=0.76%.加樣回收率實(shí)驗(yàn):取含右旋龍腦127.5mg/g的包合物樣品5份，每份約100mg，精密稱定，分別加入右旋龍腦對照品10mg，制備供試品溶液，制樣，測定右旋龍腦的峰面積，計(jì)算得加樣回收率為102.94%，RSD為 1.86%.

最后取1 μL供試品溶液注入氣相色譜儀中進(jìn)行測定，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出包合物中右旋龍腦的含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，余同).

色譜條件如下:色譜柱為HP-5MS彈性石英毛細(xì)柱管(長30m，內(nèi)徑 0.25mm，膜厚約 0.25mm);氫火焰離子化檢測器，檢測溫度為270℃;采用程序升溫，柱溫條件為100℃恒溫1 min后，以10℃/min的速率升溫至170℃，保持5 min;進(jìn)樣口溫度為250℃;檢測溫度為270℃;載氣為氮?dú)?，流速?.8mL/min.

1.2.2 右旋龍腦包合物的制備

［9］制備右旋龍腦包合物.稱取右旋龍腦0.589g溶于20mL無水乙醇中，即得右旋龍腦乙醇溶液.按照右旋龍腦與HP-β-CD 1∶6的質(zhì)量比稱取HP-β-CD 3.534g溶于100 mL 蒸餾水中，即得HP-β-CD水溶液.將右旋龍腦乙醇溶液緩慢滴入HP-β-CD水溶液中，40℃下超聲60min.取出放入冰箱冷藏24h，真空抽濾，取濾液放入-20℃的冰箱中凍干后，再放入真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48h，研碎，過80目篩得白色膨松狀粉末包合物.根據(jù)如下包合物包合率的計(jì)算公式，得到實(shí)驗(yàn)制得的包合物的包合率為91.88%:

1.2.3 右旋龍腦包合物的鑒定

用差示掃描量熱法和X-射線衍射法測試樣品的形成.DSC測試條件:樣品量為2～5 mg，氣氛為氮?dú)?，流速?40 mL/min，鋁質(zhì)坩堝，升溫速率為10.0℃ /min，取右旋龍腦、HP-β-CD、兩者的物理混合物(與投料比一致)以及包合物各適量，按上述條件進(jìn)行測試.XRD測試條件:Cu-Kα輻射，LynxExe陣列探測器，管電壓40kV，管電流40 mA，掃描步長0.02°，掃描速度 17.7s/步，掃描范圍 5°～55°.取右旋龍腦、HP-β-CD、兩者的物理混合物(與投料比一致)以及包合物各適量，根據(jù)上述條件進(jìn)行測試.

1.2.4 右旋龍腦包合物的穩(wěn)定性測試

揮發(fā)性實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行.分別稱取2 g右旋龍腦包合物以及右旋龍腦與HP-β-CD的物理混合物(按右旋龍腦與HP-β-CD質(zhì)量比1∶6混合)于培養(yǎng)皿中，于25℃恒溫干燥箱中放置5 d，分別于第0、1、2、3、4、5d 時取樣，按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定包合物中的右旋龍腦含量.

熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［5，10］進(jìn)行.分別稱取2g右旋龍腦包合物以及右旋龍腦與β-環(huán)糊精的物理混合物(按右旋龍腦與 HP-β-CD質(zhì)量比1∶6混合)于培養(yǎng)皿中，分別在37和60℃恒溫干燥箱內(nèi)放置5d，于第 0、1、2、3、4、5d 時取樣，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定右旋龍腦含量.

抗光解性實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［5，10］進(jìn)行.分別稱取2g右旋龍腦包合物以及右旋龍腦與β-環(huán)糊精的物理混合物(按右旋龍腦與 HP-β-CD質(zhì)量比1∶6混合)于培養(yǎng)皿中，放進(jìn)光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在光照強(qiáng)度3000lx 的條件下放置 5 d，分別于第 0、1、2、3、4、5 d時取樣，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定右旋龍腦含量.

1.2.5 右旋龍腦/HP-β-CD包合物的相溶解度測定

右旋龍腦/HP-β-CD包合物的相溶解度測定參照文獻(xiàn)［11］進(jìn)行.取右旋龍腦20 mg溶于適量無水乙醇中，分別加入濃度為 1、2、4、6、8、10、12、14、16、18mol/L的 HP-β-CD溶液 20 mL，在超聲溫度為40℃條件下超聲60 min，放入 -4℃冰箱中冷藏24h，過濾，取濾液在-20℃下凍干后放入真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48 h，精密稱定所得包合物的質(zhì)量，再取包合物適量，采用氣相色譜法按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定包合物中右旋龍腦的含量.以右旋龍腦的濃度對HP-β-CD的濃度作圖，得到相溶解度曲線.

2 結(jié)果與分析

2.1 右旋龍腦/HP-β-CD包合物的鑒定

2.1.1 DSC 分析

右旋龍腦、HP-β-CD、兩者的物理混合物和包合物的DSC曲線如圖1所示.從圖1中可以看出:HP-β-CD大約在90.02℃處出現(xiàn)一個寬的吸收峰，表明其是非晶態(tài)物質(zhì)，該峰可能是由于HP-β-CD分子間脫水所形成的吸收峰［12-13］;物理混合物在90.11℃也出現(xiàn)相似的HP-β-CD的寬吸收峰，說明物理混合物中HP-β-CD的晶型和熔點(diǎn)沒有發(fā)生改變，同時，在約72.17℃處出現(xiàn)跟右旋龍腦圖譜相近的吸收峰，表明物理混合物的吸收峰實(shí)際上是右旋龍腦和HP-β-CD吸收峰的疊加;而在包合物中卻表現(xiàn)出了不同的峰型，HP-β-CD在90.02℃處的吸收峰被削弱，出現(xiàn)在74.29℃處，原因可能是右旋龍腦與HP-β-CD形成了很強(qiáng)的分子間作用力.右旋龍腦的吸收峰在包合物中并沒有出現(xiàn)，原因可能是右旋龍腦的吸收峰被HP-β-CD屏蔽，這表明右旋龍腦已經(jīng)包含在HP-β-CD空腔中，即包合物已形成.

圖1 右旋龍腦、HP-β-CD、兩者的物理混合物和包合物的DSC曲線Fig.1 DSC curves of d-borneol，HP-β-CD，as well as physical mixture and inclusion complex of d-borneol and HP-β-CD

2.1.2 XRD 分析

圖2 右旋龍腦、HP-β-CD、兩者的物理混合物和包合物的XRD譜圖Fig.2 XRD patterns of d-borneol，HP-β-CD，as well as physical mixture and inclusion complex of d-borneol and HP-β-CD

右旋龍腦、HP-β-CD、兩者的物理混合物和包合物的XRD譜圖如圖2所示.由XRD譜圖可以看出:右旋龍腦在 2θ=7.63°，8.53°，15.28°，17.66°，30.75°處出現(xiàn)衍射峰，表明右旋龍腦是一種結(jié)晶態(tài)物質(zhì);而 HP-β-CD 在2θ為 5°～15°和 15°～25°處出現(xiàn)兩個寬的衍射峰，表明HP-β-CD是一種非晶態(tài)物質(zhì);在混合物的衍射圖中可以看出有右旋龍腦和HP-β-CD衍射峰的存在，這說明物理混合物的衍射峰為右旋龍腦和HP-β-CD衍射峰的疊加，可見，右旋龍腦與HP-β-CD直接混合后，其晶型沒有改變，仍保持各自的晶型特點(diǎn);包合物的譜圖則不再是兩者的簡單疊加，其在5°～15°和15°～25°處表現(xiàn)出跟HP-β-CD類似的兩個寬的衍射峰帶，而右旋龍腦原來的衍射峰在包合物中消失或減弱，證明右旋龍腦與HP-β-CD形成了包合物，且晶型發(fā)生了顯著變化，同時也表明包合物的形成不是簡單的物理混合，而是形成了一種新的物相.

2.2 包合物的穩(wěn)定性分析

2.2.1 揮發(fā)性

圖3所示為包合物的揮發(fā)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果.由圖3可以看出:包合物和混合物在25℃下放置5d后，右旋龍腦的揮發(fā)率分別為0.42%和15.98%，可見右旋龍腦被包合后，在常溫下其揮發(fā)性得到了明顯的抑制，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單純的右旋龍腦.

圖3 包合物和混合物在25℃下的揮發(fā)性結(jié)果Fig.3 Results of volatility tests of inclusion complex and mixture at 25℃

2.2.2 熱穩(wěn)定性

圖4給出了包合物的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果.由圖4可以看出:包合物和混合物在37℃下放置5 d后，其揮發(fā)率分別為6.94%和22.89%;60℃下放置5 d后，則分別達(dá)到24.29%和60.68%;說明混合物中右旋龍腦的揮發(fā)速率明顯快于包合物中.隨著溫度的升高，包合物的揮發(fā)率和揮發(fā)速率均增大，這說明右旋龍腦被β-環(huán)糊精包合之后，包合物的熱穩(wěn)定性雖然有所增加，但過高的溫度依然不利于右旋龍腦包合物的儲存.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一定的溫度范圍內(nèi)，右旋龍腦被包合后，其熱穩(wěn)定性顯著增強(qiáng).

圖4 包合物和混合物在37和60℃下的揮發(fā)性結(jié)果Fig.4 Results of volatility tests of inclusion complex and mixture at 37 and 60℃

2.2.3 抗光解性

圖5給出了包合物的抗光解性實(shí)驗(yàn)結(jié)果.由圖5可以看出，在3000lx下放置5d后，包合物和混合物的揮發(fā)率分別為16.06%和52.29%，且混合物中的右旋龍腦揮發(fā)速率明顯比包合物快.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，右旋龍腦制成包合物之后，其抗光解性明顯增強(qiáng).

圖5 包合物和混合物在3000lx下的揮發(fā)性結(jié)果Fig.5 Results of volatility tests of inclusion complex and mixture at 3000lx

2.3 右旋龍腦/HP-β-CD包合物的相溶解度分析

圖6所示為包合物的相溶解度圖.從圖6可以看出，隨著HP-β-CD濃度的增加，右旋龍腦在水中的濃度也增加，當(dāng)HP-β-CD濃度高于8mol/L時，右旋龍腦的濃度不再明顯增加，原因可能是HP-β-CD的濃度已達(dá)到足以包合全部投入的右旋龍腦的程度［11］.根據(jù) Higuchi等［14］提出的原理，該相溶解度曲線符合AL型，即HP-β-CD和右旋龍腦形成了1∶1的包合物.對HP-β-CD在0～8 mol/L濃度范圍內(nèi)做擬合曲線，得到線性方程為:Y=0.6566X+0.0140，r2=0.9959.包合物的包合常數(shù)可按照公式K=k/S0(1-k)［15］來計(jì)算(S0為包合物的起始濃度，k為斜率)，得到包合常數(shù)K為136.58 L/mol，表明右旋龍腦與 HP-β-CD之間形成了很強(qiáng)的分子間作用力［16］，右旋龍腦已經(jīng)與 HP-β-CD 形成了包合物，且右旋龍腦被包合后，相比右旋龍腦的固有溶解度(0.014mol/L)，溶解性提高了近 376.2 倍.

圖6 右旋龍腦/HP-β-CD包合物的相溶解度曲線Fig.6 Phase solubility curve of d-borneol/HP-β-CD inclusion complex

3 結(jié)語

環(huán)糊精包合法可以提高難溶性藥物的溶解度，目前國內(nèi)外已經(jīng)有一些關(guān)于環(huán)糊精包合難溶性藥物的報道，包合后的難溶性藥物水溶性及穩(wěn)定性等均有不同程度的提高.已有研究表明，HP-β-CD作為一種環(huán)糊精衍生物，在水溶性及穩(wěn)定性上優(yōu)于環(huán)糊精，更適合作包合材料.文中采用最佳的HP-β-CD包合右旋龍腦的工藝，即采用40℃下超聲60 min(相關(guān)數(shù)據(jù)將另文發(fā)表)制得包合物，并通過DSC和XRD進(jìn)行了驗(yàn)證.經(jīng)過揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性和抗光解性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了右旋龍腦經(jīng)HP-β-CD包合后，穩(wěn)定性得到了明顯的提高.這不僅能較大程度上延長右旋龍腦制備成成藥之后的貯存時間，并且也有助于藥效的發(fā)揮.相溶解度實(shí)驗(yàn)表明，右旋龍腦被包合后，溶解性得到了明顯的提高.因此，采用HP-β-CD增溶可以解決右旋龍腦制劑研發(fā)、生產(chǎn)、應(yīng)用中的許多難題.

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