右歸丸干預相關疾病的分子信號通路研究進展

魯莎 譚從娥

右歸丸源自于中醫(yī)經典《景岳全書》中的補腎名方，以“益火之源”培右腎元陽為制方根本，以“陰中求陽”為立方理論[1]。該方由熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、鹿角膠、菟絲子、杜仲、當歸、肉桂、制附子十味中藥組成，方中肉桂、附子與鹿角膠合用溫補腎陽、填精益髓，熟地黃、山茱萸、山藥、菟絲子、枸杞子、杜仲合用滋腎陰、補肝脾，當歸養(yǎng)肝補血，十藥合用溫補腎陽，補血填精[2]?，F代藥理研究發(fā)現右歸丸具有調節(jié)免疫功能、骨代謝、神經系統(tǒng)等多方面作用，在臨床上治療膝骨關節(jié)炎、卵巢早衰、骨質疏松等疾病效果顯著[3]。右歸丸的臨床療效雖已得到證實，然其療效機制目前仍未完全闡明。信號通路是細胞信息傳遞及其功能發(fā)揮的基本途徑，研究證明右歸丸可能通過調控某些特定功能的分子通路而發(fā)揮治療作用。因此，本文對近年來右歸丸具有調控作用的主要分子信號通路進行綜述。

1 核轉錄因子相關通路

核轉錄因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)是在B淋巴細胞中發(fā)現的核轉錄因子，因為它與免疫球蛋白κ輕鏈的增強子B序列特異性結合并促進表達而得名。NF-κB通常與抑制蛋白IKB結合成三聚體復合物，存在于未受刺激的細胞質中，可以迅速釋放進人細胞核而不需要重新合成蛋白。該轉錄因子由Rel蛋白家族不同成員組成，如p65蛋白 (RelA)、p50蛋白、p52蛋白、c-Rel蛋白和RelB蛋白等，可激活參與應激反應、炎癥和程序性細胞死亡(凋亡)的多種基因。NF-κB/IKB復合體被磷酸化和泛素化后，NF-κB暴露出其核定位序列并從細胞質中進入到細胞核中，與核內DNA上的特異性序列相結合，繼而啟動或增強相關基因的轉錄[4]。NF-κB轉錄因子控制著影響免疫反應的基因表達[5]。研究發(fā)現，右歸丸對腎陽虛證的調控與NF-κB信號通路相關。譚從娥等[6]研究發(fā)現腎陽虛證引起的免疫紊亂狀態(tài)患者服用右歸丸治療后，其在Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)介導的髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)/NF-κB信號通路中，MyD88,NF-κB的mRNA表達明顯上調，證明右歸丸通過該通路糾正腎陽虛證免疫紊亂狀態(tài)。

NF-κB通路同時也是一種促炎通路，主要基于NF-κB在促炎基因表達中的作用，包括細胞因子、趨化因子、黏附分子[7]。白細胞介素-6(interleukin-6 ，IL-6)和基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinase，MMPs)在磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinases B,PKB/Akt)/NF-κB信號通路中可能作為該通路的下游調控分子，與炎癥反應有關[8]。動物實驗表明，右歸丸可抑制膝骨關節(jié)炎大鼠炎癥反應，表現為降低PI3K/Akt/NF-κB信號通路中的PI3K和pAkt及MMP-14蛋白和IL-6的表達，從而改善膝骨關節(jié)炎病變[9]。右歸丸還可通過干預NF-κB/SREBPs通路減少炎癥因子釋放，表現為抑制血清中白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的炎性因子含量，使主動脈組織 TLR4、NF-κB p65、膽固醇調節(jié)元件結合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)-1c和三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)mRNA的表達下降[10]。此外，在右歸丸含藥血清干預經脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的單核細胞(THP-1)源性泡沫細胞制備的高膽固醇模型中，發(fā)現右歸丸可能通過抑制NF-κB通路中NF-κB 、p65和SREBP-1c的表達調節(jié)血脂，并且通過降低炎癥因子的釋放預防動脈粥樣硬化[11]。

上述研究表明右歸丸通過增強NF-κB通路免疫基因的轉錄調控腎陽虛證免疫功能，抑制該通路的促炎基因表達減少炎癥因子釋放緩解炎癥反應。表明右歸丸在NF-κB通路存在雙向調節(jié)作用，且在緩解炎癥反應方面是通過多條通道發(fā)揮療效，展現了右歸丸多靶點、多通道的特點，提示右歸丸可能對NF-κB通路相關免疫類、炎癥類的疾病發(fā)揮治療作用。

2 WNT/β-Catenin經典信號通路

WNT是一類高度不溶蛋白，其通過與細胞膜上的受體結合繼而引發(fā)下游一系列信號轉導。WNT通路分為β-Catenin蛋白依賴性經典通路和非依賴性通路(本文主要介紹經典通路)[12]。該通路控制著大量與生長和代謝相關的基因表達，同時，WNT通路與小腸組織穩(wěn)定性、毛囊發(fā)生、骨密度、造血干細胞分化等生理功能有密切關系[13]。

在WNT/β-Catenin經典通路中，WNT蛋白與受體結合，膜上信號通過Dsh蛋白解體APC蛋白，β-Catenin的濃度不斷升高，進入細胞核，啟動下游基因轉錄[14]。經典的 WNT/β-Catenin通路被認為與成骨細胞的形成有關[13]，成骨細胞功能下降是導致骨質疏松癥的主要病理基礎[15]。近年研究發(fā)現，右歸丸通過干預WNT/β-Catenin通路提高成骨細胞功能達到治療骨質疏松癥的作用。如章建華[16]等對腎陽虛證骨質疏松癥大鼠服用右歸丸藥液，發(fā)現右歸丸含藥血清組相較空白血清組可增強細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2、WNT/β-catenin信號通路相關因子β-catenin、ERK1蛋白、ERK2蛋白的表達進而促進成骨細胞增殖；李玲慧等[17]研究發(fā)現右歸丸可以使糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3β)表達水平降低、β-Catenin表達水平升高，激活WNT/β-Catenin通路，提高成骨細胞分泌ALP蛋白的能力；付小衛(wèi)等[18]研究表明右歸丸可以激活WNT/β-Catenin通路調控成骨細胞發(fā)育、分化和增值。但目前對右歸丸干預WNT/β-Catenin通路治療骨質疏松癥發(fā)揮的作用認識尚淺，與之相關的具體下游機制尚未闡明，今后需加強WNT/β-Catenin通路的右歸丸基礎和臨床研究。

此外，有研究發(fā)現WNT經典通路異常激活有可能是導致膝骨關節(jié)炎滑膜損傷、軟骨破壞的主要原因，而右歸丸可以抑制WNT經典通路中的WNT1-誘導信號通路蛋白-1 (WNT1-inducible signaling pathway protein 1,WISP1)、WNT1、β-catenin和低密度脂蛋白受體相關蛋白5(lowdensitylipoproteinreceptor-relatedprotein5，LRP5)mRNA的蛋白質表達從而緩解減輕膝骨關節(jié)炎的病變[19]。有文獻報道，WNT/β-Catenin通路具有抗炎和促炎功能，該功能是由于抑制或增強NF-κB通路[20]。研究人員在膝骨關節(jié)炎模型鼠軟骨組織中發(fā)現信號傳導及轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)和IL-6表達明顯上升，經右歸丸干預后STAT3和IL-6的表達明顯降低[21]。而IL-6為NF-κB的下游調控分子并與炎癥反應有關[8]。本篇第一節(jié)已詳細闡述右歸丸通過干預NF-κB通路減少炎癥反應，結合上述兩項研究表明右歸丸治療膝骨關節(jié)炎是通過WNT/β-Catenin通路和NF-κB通路共同發(fā)揮作用，但二者的關聯研究目前尚無進展。

3 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶相關通路

3.1 絲裂原活化蛋白激酶信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一類能被不同細胞外信號如神經遞質、細胞因子、激素等刺激的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK的激活是以三級激酶的形式進行，MAPKKK、MAPkk、和MAPK依次磷酸化激活，MAPK進而進入核內參與介導細胞生長、發(fā)育、分裂和分化等多種生理病理過程[22]。 JNK蛋白和P38蛋白同屬于MAPK家族，但來自于不同的激活途徑，JNK/P38通路與許多病理條件相關，包括癌癥、中風和炎癥性疾病等，所以抑制JNK/P38的藥物可能對治療有積極作用[23]。近年研究中發(fā)現，右歸丸對于MAPK通路的調控存在雙向調節(jié)的作用，并且主要集中在JNK/P38途徑。NADPH氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)是腎臟活性氧(reactive oxygen species,ROS)的關鍵調節(jié)因子之一，受NOX4調控的ROS、P38/MAPK在激素抵抗型腎病綜合征(steroid-resistant nephrotic syndrome,SRNS)患者腎小球中的表達水平較高[24]。王新斌[25]等建立SRNS大鼠給予右歸丸治療發(fā)現大鼠腎組織中JNK、P38蛋白磷酸化水平明顯降低，而模型組大鼠腎組織的JNK、P38蛋白磷酸化水平明顯升高，提示右歸丸通過抑制JNK/P38信號通路達到治療SRNS作用。此外，在對右歸丸干預慢性腎功能大鼠的實驗中發(fā)現，右歸丸可降低P38磷酸化水平，抑制細胞凋亡保護腎功能；同時可使MAPkk磷酸化水平升高，激活迷走神經，使交感神經活性相對降低繼而抑制左心室肥厚[26]。綜上右歸丸在MAPK通路中的雙向調節(jié)作用可能是由于增強或抑制MAPK家族不同亞族，并為JNK/P38途徑相關的疾病治療提供新選擇，其具體機制有待進一步研究。

3.2 雷帕霉素靶蛋白信號通路

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于P13K激酶家族，參與mTORC1和mTORC2兩種多亞基蛋白復合物。mTOR是該通路的重要細胞信號中樞，其上游有多條通路匯聚到mTOR調控下游分子，包括生長控制、蛋白質合成、基因表達和代謝平衡[27-28]。收集近年文獻研究發(fā)現右歸丸干預mTOR通路主要表現在兩個方面，一是激活mTOR蛋白發(fā)揮抗抑郁效應和促進成骨細胞形成；二是抑制mTOR蛋白治療慢性關節(jié)退行性疾病。孕酮是mTOR通路在海馬體的重要調節(jié)因子[29]，而抑郁癥與海馬體的減少有關[30]。研究發(fā)現通過對抑郁模型大鼠海馬腦區(qū)自噬水平觀察、選用糖水偏好率作為指標，發(fā)現右歸丸給藥組的糖水偏好率較模型組顯著升高且海馬CA3區(qū)LC3蛋白免疫熒光強度較模型組減弱[31]。這是由于右歸丸可以增強AKT、mTOR1蛋白磷酸化水平激活mTOR通路，從而對抑郁癥模型大鼠發(fā)揮抗抑郁效應有積極作用[32]。另有研究發(fā)現腺苷酸活化蛋白激酶(AMPactivated proteinkinase，AMPK)/mTOR信號通路中AMPK蛋白異常激活導致mTOR蛋白異常抑制，是絕經后骨質疏松癥大鼠的機制之一；右歸丸通過減少AMPKα基因與磷酸化的p-AMPKα蛋白表達、增加mTOR基因和磷酸化的p-mTOR蛋白表達干預AMPK/mTOR信號通路促進成骨細胞形成[33-34]。此外，骨關節(jié)炎是一種常見的慢性關節(jié)退行性疾病，其特征是關節(jié)破壞和關節(jié)炎癥[35]。IL-1β是促進骨關節(jié)炎軟骨降解的主要炎癥細胞因子，IL-1β的產生是通過P13/AKT/mTOR通路的激活[36]。研究表明右歸丸治療慢性關節(jié)退行性疾病是通過抑制該通路P13K、AKT、mTOR的蛋白磷酸化水平表達[37]。

4 轉化生長因子-β相關通路

轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGf-β)是TGF蛋白家族中的一員，它是一種雙功能調節(jié)因子，既可以刺激細胞增殖，也可以抑制細胞增殖[38]。并且TGF-β是一個細胞因子超家族，包括TGF-(β1、β2,和β3)、激活素、抑制素、抗髓質激素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長分化因子、結節(jié)和膠質源性神經營養(yǎng)因子，TGF-β信號通路在調節(jié)細胞生長、分化、凋亡、血管生成和免疫反應等重要細胞活動中發(fā)揮重要作用[39-40]。骨髓間充質干細胞主要分化方向為成骨細胞和脂肪細胞，但骨髓間充質干細胞會隨著年齡的增長而逐漸老化，導致成骨細胞生成減少[41]，而TGF家族中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白是成骨細胞形成所必須的信號[42]。有研究表明右歸丸含藥血清可以上調TGF-β通路中的TGF-β、BMP-7、血清骨鈣素的蛋白濃度，促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，對于骨質疏松癥的防治有積極意義[43]。另有實驗結果同樣表明右歸丸通過TGF-β1/Smad2/3/4通路促進骨髓基質干細胞向成骨細胞誘導分化[44-45]。

5 分析與展望

綜上，右歸丸通過調控NF-κB信號通路、WNT/β-Catenin經典信號通路、MAPK信號通路、mTOR信號通路和TGF-β信號通路發(fā)揮治療作用，這些成果有助于解釋右歸丸的療效機制，也為臨床應用提供更多的參考。但筆者也發(fā)現，目前右歸丸調控信號通路的基礎研究較少，并且右歸丸藥物成分十分復雜，治療靶點多、途徑多。近年來，生物信息學的分析方法和高通量檢測技術已應用于中醫(yī)藥復雜問題的研究中，可為明確右歸丸的靶點提供依據，有助于更深入地研究右歸丸發(fā)揮療效的具體途徑。此外，進一步深入研究右歸丸的作用機制，將有助于擴大右歸丸臨床使用范圍。