兒童耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥機(jī)制綜述

劉慧，張妮，徐曉楠，山國棟

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 小兒消化科，甘肅 蘭州 730000；2.白銀市第二人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，甘肅 白銀 730900)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)于1961年首次被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)主要的致病菌。近年來，我國MRSA感染情況較為嚴(yán)峻：2019年CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測的結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌占所有革蘭陽性菌株的32.2%，其中MRSA檢出率31.4%，且耐藥率及多重耐藥率較高[1]。在兒童患者中MRSA的感染率及預(yù)后不容樂觀：2018年我國ISPED監(jiān)測的兒童感染菌中MRSA占金黃色葡萄球菌株的34.9%，且常用抗生素耐藥率高[2]。吳霞等[3]的研究顯示感染MRSA的452例患兒中，預(yù)后不良及病死率分別為9.5%、2.7%?，F(xiàn)因MRSA的高耐藥性使得臨床上只能選用特定藥物(萬古霉素、達(dá)托霉素和利奈唑胺等)進(jìn)行替代治療。因此，尋找及研究新的治療方法十分重要。金黃色葡萄球菌因其對抗生素的耐藥性，具有較高的適應(yīng)宿主能力。金黃色葡萄球菌的耐藥性主要包括固有性耐藥和獲得性耐藥。固有性耐藥即自身染色體攜帶耐藥基因，獲得性耐藥是從其他葡萄球菌菌株甚至其他菌屬獲得耐藥基因，移動遺傳元件(mobile genetic elements，MGE)在其中起核心作用。金黃色葡萄球菌通過MGE的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合等多種方式獲得染色體外的DNA片段從而適應(yīng)不同宿主環(huán)境及抗生素。金黃色葡萄球菌的MGE包括金葡菌盒式染色體(staphylococcal cassette chromosomemes，SCCs)、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、噬菌體、插入序列、致病島、整合性接合元件和整合子等，其中除噬菌體不能攜帶基因外，其他MGE均可攜帶基因[4]。這些MGE主要通過產(chǎn)生細(xì)菌滅活酶和修飾酶、改變抗生素作用靶位、主動外排等方式使金黃色葡萄球菌耐藥。本文主要就這3種機(jī)制進(jìn)行分別綜述。

1 細(xì)菌滅活酶及修飾酶的產(chǎn)生

MRSA幾乎100%對甲氧西林、β-內(nèi)酰胺類抗生素及與β-內(nèi)酰胺類結(jié)構(gòu)相似的頭孢類藥物耐藥，其耐藥機(jī)制之一就是β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生。β-內(nèi)酰胺酶屬于誘導(dǎo)酶，可水解破壞含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素，使這類抗生素失活而耐藥。金黃色葡萄球菌通過結(jié)合或者轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒獲得β-內(nèi)酰胺酶的編碼基因，參與的調(diào)控基因有結(jié)構(gòu)基因、阻遏蛋白和抗阻遏蛋白等。阻遏蛋白對β-內(nèi)酰胺酶主要起負(fù)調(diào)節(jié)作用，抗阻遏蛋白在感受到β-內(nèi)酰胺類藥物時會產(chǎn)生信號使阻遏蛋白開始轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶破壞β-內(nèi)酰胺類抗生素，使其失去作用[5]。Hashizume等[6]研究發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性可以被其他藥物所逆轉(zhuǎn)，如天然脂肽抗生素三肽C在單獨或與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合治療MRSA時，天然脂肽抗生素三肽C可以通過降低結(jié)構(gòu)基因和MecA基因的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性。

氨基糖苷類抗生素的耐藥機(jī)制也與修飾酶的產(chǎn)生相關(guān)。在兒童感染的MRSA菌株中對氨基糖苷類抗生素的耐藥率較高，如董方等[7]的研究顯示2009—2015年北京兒童醫(yī)院分離的425例MRSA菌株中慶大霉素的耐藥率為24.2%。氨基糖苷類修飾酶(aminoglycoside-modifying enzymes，AME)的產(chǎn)生及作用是主要耐藥機(jī)制。編碼AME的基因多數(shù)以轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和整合子等MGE介導(dǎo)，易于傳播。AME使氨基糖苷類藥物的氨基或羥基被修飾，影響抗生素與細(xì)菌核糖體的結(jié)合，使抗菌中斷而耐藥。AME主要包括乙?；D(zhuǎn)移酶(aminoglycoside acetyltransferases，AAC)、磷酸轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside phosphotrans-ferase，APH)及核苷酸轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside nucletidyltransferase，ANT)[8]。MRSA對慶大霉素、妥布霉素和卡那霉素的耐藥性均由具有AAC和APH活性的雙功能酶AAC(6’)/APH(2’’)介導(dǎo)，此修飾酶為最常見的AME，由aac(6’)/aph(2’’)基因在復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn4001上編碼而成[9]。ant(4’)-Ⅰa基因編碼的ANT(4’)-I酶可介導(dǎo)新霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素和卡那霉素等對MRSA產(chǎn)生耐藥性，該基因通常攜帶在小質(zhì)粒上，然后整合到較大的結(jié)合質(zhì)粒(如pSK41)中，最后再整合到某些金黃色葡萄球菌分離株的盒式染色體上的(staphylococcal cassette chromosome mec，SCC mec)。另外APH(3’)-Ⅲ酶活性在MRSA對新霉素和卡那霉素的耐藥性中也有相關(guān)描述，負(fù)責(zé)此表型的APH(3’)-Ⅲa基因在轉(zhuǎn)座子Tn5405上攜帶，此轉(zhuǎn)座子可能位于染色體和質(zhì)粒上。鏈霉素抗性的遺傳學(xué)較為復(fù)雜，考慮與ant(6)-Ⅰa基因、染色體突變(strA)、aph(3’)-Ⅲ基因和ant(4’)-Ⅰa基因等基因相關(guān)[10]?，F(xiàn)氨基糖苷類抗生素耐藥性高，針對其耐藥機(jī)制，可以通過研發(fā)氨基糖苷類修飾酶的抑制劑來影響MRSA對氨基糖苷類藥物的耐藥性，如反義寡核苷酸類似物等[11]。

2 抗生素作用靶位的改變

MRSA對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的另一種耐藥機(jī)制即獲得與β內(nèi)酰胺類抗生素親和力低的青霉素結(jié)合蛋白2a(penicillin binding protein 2a，PBP2a)。PBP2a是一種獨特的單功能DD-轉(zhuǎn)肽酶，與金黃色葡萄球菌中含有的青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)活性相同，可以催化細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成，而PBPs卻為β-內(nèi)酰胺類抗生素對細(xì)菌的致死靶標(biāo)。β-內(nèi)酰胺類抗生素使細(xì)菌PBPs活性位點絲氨酸發(fā)生不可逆?；饔?，使其功能喪失。相反，MRSA獲得的PBP2a可成功催化完成細(xì)胞壁所必需的DD轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，卻不能被β-內(nèi)酰胺類抗生素?；瑥亩退嶽12]。PBP2a由mecA基因編碼產(chǎn)生。mecA基因由MGE的SCCs攜帶，SCCmec是插入在金黃色葡萄球菌orfX基因上的相對較大的MGE，21～67 kb，是MRSA耐藥的基因結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。目前，從MRSA分離株中已發(fā)現(xiàn)13種SCCmec，人源MRSA菌株中主要攜帶SCCmec Ⅰ～Ⅷ型，其中Ⅰ～Ⅴ型較為常見，占分離株的90%以上[13-14]。我國兒童MRSA菌株以SCCmec Ⅳ型為主，其次為Ⅴ和Ⅲ型[15]。SCCmec主要由mec基因復(fù)合體、ccr基因重組復(fù)合體以及J區(qū)的一些耐藥基因組成。mec基因復(fù)合體主要由編碼PBP2a的結(jié)構(gòu)基因mecA和誘導(dǎo)基因mecR1、抑制基因mecI組成[16]。針對兒童的多項研究顯示mecA基因是MRSA耐藥性表達(dá)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[17-18]。Ccr復(fù)合體位于SCCmec基因的近中部，該復(fù)合體主要負(fù)責(zé)編碼耐藥基因的位點和特定的切除，將外緣的耐藥基因重組到SCCmec基因盒上，也可以識別相對應(yīng)的SCCmec元件，通過切離、轉(zhuǎn)移、整合等方式達(dá)到耐藥性在不同葡萄球菌間的轉(zhuǎn)移，使MRSA擁有多重耐藥性，最終將SCCmec基因盒重組到orfX上[19]。SCCmec基因盒的3個J區(qū)通常還攜帶抗生素耐藥決定簇，可賦予SCCmec元件表達(dá)更多的耐藥表型。祝強(qiáng)強(qiáng)等[20]的研究顯示，研究出抗mecA基因的硫代寡聚脫氧核苷酸，可有效抑制mecA的表達(dá)。Otero等[21]的研究顯示，頭孢洛林可以觸發(fā)PBP2a活性位點的構(gòu)象變化，獲得頭孢洛林的結(jié)合位點，增加與PBP2a的親和力，并使PBP2a快速失活，從而使MRSA失去耐藥性。這為基于β-內(nèi)酰胺抗生素結(jié)構(gòu)的設(shè)計開辟新的方向，為以后研究更多針對MRSA的抗生素提供方向。

糖肽類抗生素的作用機(jī)制是與細(xì)胞壁黏肽合成中的D-丙氨酰-D-丙氨酸殘基形成復(fù)合物，抑制細(xì)胞壁的合成。治療兒童MRSA主要的糖肽類抗生素有萬古霉素和替考拉寧[22]。萬古霉素因其良好的治療效果被廣泛應(yīng)用于臨床，因為臨床的使用率的增加導(dǎo)致出現(xiàn)了對萬古霉素敏感性降低的MRSA菌株(VISA株)及耐萬古霉素的MRSA菌株(VRSA株)，國外已有了關(guān)于VISA菌株及VRSA菌株的研究[23]，我國有VISA菌株的相關(guān)研究，但尚無VRSA菌株相關(guān)報道[24]。萬古霉素的耐藥機(jī)制主要是：位于質(zhì)粒Tn1546內(nèi)的van操縱子編碼合成低親和力的肽聚糖前體D-丙氨酸-D-乳酸，改變了菌株的肽聚糖鏈末端成分，使萬古霉素結(jié)合的靶位消失，從而耐藥[25]。研究發(fā)現(xiàn)VISA菌株的脂質(zhì)Ⅱ帶有終止于D-丙氨酸-D-乳酸殘基的細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)單元，可能將過量的D-丙氨酸-D-乳酸終止細(xì)胞壁鏈引入VISA分離物的成熟細(xì)胞壁中，這些終止細(xì)胞壁鏈可能會作為抗生素的錯誤靶點捕獲部分萬古霉素，使萬古霉素與真正靶位的結(jié)合減少，降低萬古霉素敏感性。在VISA菌株中可能還存在一些控制細(xì)菌細(xì)胞壁生物合成的決定簇的基因突變和/或核糖體基因突變，如walkR、vraSR和rpoB基因等，以及細(xì)胞包膜應(yīng)答基因vraSR和mprF的表達(dá)上調(diào)，可改變細(xì)菌的細(xì)胞包膜以適應(yīng)萬古霉素的抗菌作用，使萬古霉素的敏感性降低[26]。金黃色葡萄球菌還具有一些遺傳調(diào)節(jié)因子也與萬古霉素的敏感性相關(guān)，如agr基因等[27]。雖然兒童中少有萬古霉素治療失敗的病例，但是對于VISA或者VRSA臨床中可選擇替代藥物或者根據(jù)藥敏結(jié)果選擇用藥，替代藥物有達(dá)托霉素、利奈唑胺、頭孢洛林等[28]，也可選擇聯(lián)合用藥，如β-內(nèi)酰胺類藥。Dilworth等[29]的研究顯示β-內(nèi)酰胺類藥物和萬古霉素對MRSA有協(xié)同作用。

利奈唑胺現(xiàn)已成為治療MRSA感染的主要藥物之一，2011年美國發(fā)布的兒童MRSA感染治療指南[30]中，利奈唑胺作為A級證據(jù)用于兒童MRSA感染的治療，其耐藥機(jī)制產(chǎn)生的主要有：細(xì)菌核糖體23S rRNA的點突變、核糖體L3或L4蛋白的氨基酸突變及甲基轉(zhuǎn)移酶基因cfr介導(dǎo)的核糖體被甲基化等[31]。MRSA核糖體23SrRNA的點位突變改變了利奈唑胺的靶位，而且核糖體23SrRNA的點位突變是自發(fā)形成的基因突變，是長期使用利奈唑胺產(chǎn)生的結(jié)果，不能在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，其中G2576T突變是最常見的突變位點[32]。2015年Cafini等[33]報道了國內(nèi)攜帶cfr基因的MRSA對利奈唑胺耐藥，而cfr基因主要是編碼產(chǎn)生RNA甲基化酶，導(dǎo)致大部分核糖體在23S rRNA的A2503處被甲基化，使MRSA對以核糖體為靶位的利奈唑胺產(chǎn)生耐藥，質(zhì)粒pSCFS7作為該基因的載體可以有效地在不同MRSA中轉(zhuǎn)移。根據(jù)利奈唑胺的耐藥機(jī)制，建議嚴(yán)格利奈唑胺的使用指征及利奈唑胺使用時間，減少耐藥性產(chǎn)生。

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對MRSA的耐藥機(jī)制之一也是靶位的改變。目前針對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的臨床耐藥率相對較高，尤其是紅霉素。2011年美國發(fā)布的兒童MRSA感染診治指南中多次提到在克林霉素耐藥率低的地區(qū)可經(jīng)驗性給予克林霉素治療，可見克林霉素對于MRSA的治療價值[30]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的主要耐藥基因是erm基因，主要有emrA、emrB、emrC以及emrF4種，其中rmA和ermC最常見[34]。erm基因編碼甲基轉(zhuǎn)移酶使23S rRNA的特定腺嘌呤殘基甲基化，使大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的作用靶位減少而耐藥，該基因主要由質(zhì)粒pMS97攜帶，此質(zhì)粒上還表達(dá)其他兩種大環(huán)內(nèi)酯抗性基因msr(A)和mph(C)，其中mph(C)基因考慮與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素失活相關(guān)[35-36]。

喹諾酮類抗生素作為MRSA的替代藥物治療，主要是通過抑制細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶即DNA促旋酶(細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ)和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ發(fā)揮其抗菌作用。喹諾酮類抗生素與DNA回旋酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ之間結(jié)合形成復(fù)合物之后，喹諾酮類藥物誘導(dǎo)酶的構(gòu)象變化，使DNA被破壞，而且喹諾酮可以阻止斷裂的DNA鏈的重新連接，從而發(fā)揮抗菌作用。喹諾酮類抗生素的耐藥機(jī)制之一是拓?fù)洚悩?gòu)酶的基因發(fā)生突變，使喹諾酮類藥物不能與細(xì)菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合。金黃色葡萄球菌主要是在拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的gyrA和gyrB基因的突變，使氟喹諾酮類藥物對該酶的抑制作用降低[37]。因喹諾酮類抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)可修飾的位點較多，近年來，研究者篩選出眾多喹諾酮衍生物，可在體內(nèi)外抗MRSA活性，如2-喹諾酮類化合物、4-喹諾酮衍生物、4-喹諾酮雜合體等[38]，為抗MRSA藥物的研究提供新的方向。

四環(huán)素是用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的廣譜抗生素，可用于治療金黃色葡萄球菌引起的感染，例如皮膚和軟組織感染。這類抗生素通過防止氨?；?tRNA分子與30S核糖體亞基結(jié)合而抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成發(fā)揮抗菌作用。四環(huán)素耐藥機(jī)制之一就是編碼核糖體保護(hù)蛋白，由位于轉(zhuǎn)座子或染色體上的tetM、tetO、tetQ和tetW等基因合成核糖體保護(hù)蛋白將四環(huán)素從30S亞基上釋放，使四環(huán)素與靶位分離，不能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成而耐藥[39]，此機(jī)制是四環(huán)素類抗生素主要的耐藥機(jī)制。

3 外排泵作用

MRSA的耐藥機(jī)制還可能與膜的外排蛋白的活性即外排泵有關(guān)。金黃色葡萄球菌中鑒定出的外排泵主要分為6類：主要促進(jìn)者超家族、小型多藥耐藥性家族、多藥和毒素擠出家族、ATP結(jié)合盒超家族、藥物代謝物轉(zhuǎn)運蛋白超家族和抵抗結(jié)節(jié)科超家族。其中主要促進(jìn)者超家族、小型多藥耐藥性家族和多藥和毒素擠出家族轉(zhuǎn)運藥物的能量由ATP水解提供，ATP結(jié)合盒超家族主要利用離子濃度梯度(H+或Na+)或者化學(xué)濃度將藥物轉(zhuǎn)運通過細(xì)胞膜。在金黃色葡萄球菌中鑒定了7個編碼的染色體外排系統(tǒng)(NorA、NorB、NorC、MdeA、SepA、MepA和SdrM)和2種質(zhì)粒編碼系統(tǒng)QacA/B和Smr。NorA、NorB、NorC、MdeA和SdrM蛋白是促進(jìn)者超家族的成員，而MepA是多藥和有毒擠出家族的一部分。QacA/B和Smr分別屬于促進(jìn)者超家族和小型多藥耐藥性家族[40]。Hashem等[41]的研究顯示，在中國，人源金黃色葡萄球菌中QacA/B和Smr質(zhì)粒編碼系統(tǒng)發(fā)生率分別為85%和79.2%；在染色體外排系統(tǒng)中，NorA、NorB、NorC和MepA的發(fā)生率分別為46%、15%、10.2%和6.3%，而且這類基因存在于全球大多數(shù)耐環(huán)丙沙星的金黃色葡萄球菌中。

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的主動外排耐藥機(jī)制：由Msr(A)基因介導(dǎo)的大環(huán)內(nèi)酯類特異性外排機(jī)制產(chǎn)生，該基因?qū)儆贏TP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白家族，利用離子濃度梯度(H+或Na+)或者電化學(xué)濃度將藥物轉(zhuǎn)運通過細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的抗生素濃度明顯降低從而耐藥[40]。

喹諾酮類抗生素的外排泵耐藥機(jī)制主要與NorA、NorB、NorC和MepA等基因相關(guān)[36]。其中NorA基因的過度表達(dá)，使NorA蛋白過度產(chǎn)生，NorA蛋白泵吸各種有毒化合物，包括從細(xì)菌細(xì)胞到外部介質(zhì)的氟喹諾酮類藥物，因此降低了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的藥物濃度而產(chǎn)生耐藥[42]。研究發(fā)現(xiàn)膜質(zhì)子泵抑制劑(如奧美拉唑)和競爭性抑制劑(如利血平)可抑制NorA泵的活性，將抗生素與中和耐藥性的抑制劑共同使用，可降低抗生素的耐藥性。Fontaine等[43]研究提到6-取代吡啶-3-硼酸衍生物可作為NorA外排泵的潛在抑制劑。

四環(huán)素獲取位于質(zhì)粒上的tetK和tetL基因通過膜蛋白介導(dǎo)，將藥物泵出膜外，使藥物濃度降低，即主動外排機(jī)制耐藥。研究表明帶有tetK基因的金黃色葡萄球菌對四環(huán)素具有抗性，對米諾環(huán)素則無抗性，而tetM基因則對兩者都具有抗性[44]。而且tetM/tetK基因組合在耐四環(huán)素的MRSA分離物中的發(fā)生率比耐四環(huán)素的MSSA分離株大約高10倍，同時攜帶tetK和tetM基因的分離株比僅包含1種基因的分離株顯示更高的MIC值。與MSSA菌株相比，tetM基因在MRSA中對四環(huán)素抗生素的耐藥性中可能起重要作用[45]。

綜上所述，MRSA的耐藥機(jī)制及涉及耐藥基因十分復(fù)雜，多重耐藥造成用藥困難，治療效果差。萬古霉素雖然現(xiàn)在仍作為抗MRSA的有效藥物，但也逐漸出現(xiàn)了敏感性下降及耐藥，需要進(jìn)一步研究、開發(fā)新的抗生素及新的方法治療多重耐藥的MRSA，改變多重耐藥的現(xiàn)狀，及時有效地控制MRSA的感染。