胞紅蛋白、HMGB1在血塞通干預(yù)大鼠心臟停搏后的表達(dá)機(jī)制

陽生光?向春?馬華林?郭晶晶?顏石新

【摘要】目的 通過建立大鼠心臟停搏復(fù)蘇模型和原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元模型，探討在血塞通治療大鼠心臟驟停后，胞紅蛋白、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）發(fā)揮的作用機(jī)制。方法 將實(shí)驗(yàn)大鼠分為假手術(shù)（SO）組、心肺復(fù)蘇（CPR）組和干預(yù)治療（IVT）組。在大鼠心臟停搏/CPR后3、12、24、48和72 h分別采用免疫組織化學(xué)法、蛋白免疫印跡法及實(shí)時熒光定量（qRT）-PCR法檢測海馬 CA1區(qū)胞紅蛋白、HMGB1的平均光密度值及其蛋白和基因的表達(dá)，ELISA法檢測外周血清中胞紅蛋白、HMGB1的濃度。在細(xì)胞上，通過原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元并建立缺氧缺糖（OGD/R）模型。結(jié)果 在5個時間點(diǎn)，SO組中胞紅蛋白、HMGB1的血清濃度，海馬CA1區(qū)胞紅蛋白和HMGB1的mRNA表達(dá)，體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中胞紅蛋白、HMGB1蛋白表達(dá)及其基因表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05）;CPR組與SO組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.01）;干預(yù)治療組的表達(dá)水平與CPR組比較，各時間點(diǎn)差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.01）。在48 h觀察點(diǎn)，與SO組或?qū)φ战M（未經(jīng)OGD/R治療）比較，CPR組中胞紅蛋白的陽性表達(dá)降低而HMGB1蛋白的陽性表達(dá)增強(qiáng)，OGD/R組（經(jīng)OGD/R治療）海馬神經(jīng)元的凋亡率升高;與CPR組或OGD/R組比較，干預(yù)治療組中胞紅蛋白的陽性表達(dá)增強(qiáng)，而HMGB1蛋白的陽性表達(dá)減弱，OGD/R組海馬神經(jīng)元的凋亡率明顯降低。結(jié)論 血塞通在干預(yù)治療大鼠心臟停搏后，細(xì)胞中胞紅蛋白的表達(dá)上調(diào)，HMGB1的表達(dá)下調(diào)，抑制多條信號途徑，從而抑制其他炎癥因子釋放而抗炎、抗凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】胞紅蛋白;高遷移率族蛋白B1;血塞通;心臟停搏;腦保護(hù)

Mechanism of CyGB and HMGB1 expression after Xuesaitong intervention in rats with cardiac arrest Yang Shengguang， Xiang Chun， Ma Hualin， Guo Jingjing， Yan Shixin. Department of Emergency， the Second People’s Hospital of Futian District Shenzhen， Shenzhen 518049，China

Corresponding author， Ma Hualin， E-mail： mahualin0796@sina.com

【Abstract】Objective To investigate the mechanism of CyGB and HMGB1 expression after Xuesaitong intervention in rats with cardiac arrest by establishing rat models of cardiac arrest/resuscitation and primary cultured hippocampal neurons. Methods All rats were divided into the sham operation （SO）， cardiopulmonary resuscitation （CPR） and intervention therapy （IVT） groups. At 3， 12， 24， 48 and 72 h after cardiac arrest/CPR， the average optical density values and the expression levels of CyGB and HMGB1 protein and gene in the hippocampal CA1 area were detected by immunohistochemical staining， Western blot and qRT-PCR， respectively. The concentrations of CyGB and HMGB1 in the peripheral serum were determined by ELISA. At the cellular level， primary hippocampal neurons were cultured， and an oxygen and glucose deprivation/reperfusion （OGD/R） model was established. Results SABC， ELISA， Western blot and qRT-PCR demonstrated that the serum concentrations of CyGB and HMGB1， the expression levels of CyGB and HMGB1 mRNA in the hippocampal CA1 area， and the expression levels of CyGB and HMGB1 protein and gene in the cultured hippocampal neurons did not significantly differ at five time points in the SO group （all P > 0.05）. Statistical significance was noted between the CPR and SO groups （P < 0.01）. Compared with the CPR group， the expression level at each time point was significantly different in the IVT group （all P < 0.01）. Compared with the SO or control group， the positive expression of CyGB protein at 48 h was down-regulated， whereas that of HMGB1 protein was up-regulated in the CPR group. In the OGD/R group （after OGD/R treatment）， the apoptosis rate of hippocampal neurons was significantly increased. Compared with the CPR or OGD/R group， the positive expression of CyGB protein was up-regulated， whereas that of HMGB1 protein was down-regulated in the IVT group. The apoptosis rate of hippocampal neurons was significantly reduced in the OGD/R group. Conclusion The expression level of CyGB in the cells is up-regulated and that of HMGB1 is down-regulated after Xuesaitong intervention in the treatment of cardiac arrest in rat models， which suppresses multiple signaling pathways， thereby inhibiting the release of other inflammatory cytokines， exerting anti-inflammatory and anti-apoptotic effects and playing a role in brain protection.

【Key words】Cytoglobin; High mobility group protein B1; Xuesaitong; Cardiac arrest;

Brain protection

心臟停搏患者的病死率較高，僅有25%的患者能自然恢復(fù)，10%以下的患者存活至出院[1]。 這對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，并給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)[2]。對于心臟停搏患者來說，心肺復(fù)蘇（CPR）是一種挽救生命的有效技術(shù)[3]。而大腦是復(fù)蘇后對缺氧和炎癥反應(yīng)最敏感的器官，缺氧缺血性腦病（HIE）和全身缺血再灌注與過度炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[4]。大腦也是人的生命中樞所在，因此盡快恢復(fù)大腦供氧供血，減輕因缺血引起再灌注損傷是CPR的目的與關(guān)鍵。以下通過對胞紅蛋白和高遷移率族蛋白B1（HMGB1）2個指標(biāo)的檢測、分析，從而探討其在血塞通干預(yù)治療心臟停搏患者后的作用機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

90只健康 SD大鼠（購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心），體質(zhì)量410～ 490 g，在室溫條件下飼養(yǎng)，定期光照。動物可以隨意獲得食物和水。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（SO）組、CPR組和干預(yù)治療（IVT）組。3組大鼠分別設(shè)心臟停搏/CPR后3、12、24、48和72 h的5個觀察時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)6只大鼠，并且動物模型完成后在每個時間點(diǎn)給予安樂死。在實(shí)驗(yàn)中盡一切努力減少動物死亡及痛苦。另有6只新生SD小鼠用作神經(jīng)元體外培養(yǎng)、確認(rèn)。本研究經(jīng)深圳市福田區(qū)第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并按照國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動物使用指南進(jìn)行。

二、動物模型制作

心臟停搏/CPR模型：通過夾閉氣管插管后的氣管導(dǎo)管建立大鼠窒息性心臟停搏/ CPR模型，具體步驟、要求、標(biāo)準(zhǔn)參照謝彪等[5]的實(shí)驗(yàn)方法。

IVT及SO模型：先成功制作心臟停搏/CPR模型，然后在模型成功當(dāng)時腹腔注射血塞通凍干粉針劑（昆明藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：12JB09）干預(yù)治療（注射前用血塞通自帶的專用溶劑加以溶解），以后每8 h 1次，每次劑量為6 mg/kg。而SO組大鼠則不做心臟停搏/CPR，其余一樣。

三、標(biāo)本采集與制作

分別于復(fù)蘇后3、12 、24、48及72 h共5個時間點(diǎn)，各抽取鼠尾靜脈血2 mL，非抗凝管保存，室溫靜置半小時后置入離心器以2000 r/min離心10 min，取上層血清置于-80℃冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆?。然后腹腔注?0%水合氯醛作深度麻醉（麻醉方法參照文獻(xiàn)[6]），剪開胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室先予100 mL生理鹽水灌注，然后用4%多聚甲醛200 mL灌注固定肝臟變白，肢體僵硬，斷頭取腦，在大腦海馬回CA1區(qū)連續(xù)切片，厚度為5 μm，制作石蠟切片以備觀察。

四、檢測項目與方法

通過HE染色觀察各個模型中大腦海馬回CA1區(qū)神經(jīng)元復(fù)蘇后3、12、24、48和72 h 5個時間點(diǎn)的形態(tài)改變情況;用免疫熒光TUNEL標(biāo)記染色方法觀察上述神經(jīng)元復(fù)蘇后3、12、24、48和72 h各個時間點(diǎn)的凋亡情況;用免疫組織化學(xué)SABC法按試劑盒操作步驟檢測上述神經(jīng)元復(fù)蘇后各個時間點(diǎn)的平均光密度（D）值。以上項目在自帶刻度的光鏡下觀察，倍數(shù)皆為40×10。

ELISA檢測：復(fù)蘇后3、12、24、48和72 h，取大鼠尾靜脈血2 ml，置于非抗凝管內(nèi)保存。在室溫下靜置半小時后，以2000 r/min離心10 min，吸入上部血清，在-80℃下保持。采用ELISA試劑盒（中國武漢） 測定血清胞紅蛋白、HMGB1水平。

qRT-PCR分析：用Invitrogen設(shè)計并合成了特異性引物qRT-PCR，檢測海馬CA1區(qū)的胞紅蛋白和HMGB1表達(dá)水平（見表1）。所有的qRT-PCR分析均通過Light-Cycler?480實(shí)時PCR系統(tǒng)（羅氏）來執(zhí)行。 以GAPDH作為內(nèi)部控制。熱循環(huán)條件如下：在95 ℃下10 min，在95 ℃下40個10 s周期，在60 ℃下40個60 s周期。數(shù)據(jù)用相對定量（2-△△Ct）法進(jìn)行分析。

海馬神經(jīng)元的體外培養(yǎng)及確認(rèn)：除了常規(guī)培養(yǎng)外，整個過程都要在冰上進(jìn)行無菌操作。 新生小鼠出生后24 h內(nèi)的6只SD哺乳小鼠被分解并斬首，然后置于預(yù)冷的DMEM 溶液中。在顯微鏡下分離，只有海馬體被保留。將海馬切成約1.3 mm

大小，清洗D-Hank’s溶液，1000 r/min離心5 min，

去除上清液，重復(fù)2次。用0.125%胰蛋白酶消化，在37℃水浴中搖動15 ～ 30 min，消化結(jié)束后，用200目篩過濾。將細(xì)胞密度調(diào)整到1×106/mL，接種到涂有聚賴氨酸的6孔板（每孔2 ml）或96孔板（每孔100 μL）中，在二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后，神經(jīng)基底培養(yǎng)基完全交換48 h，給予10 mmol/L阿糖胞苷。之后，每隔1日換1次培養(yǎng)液，經(jīng)過7 d 的培養(yǎng)，取出細(xì)胞膜來鑒定神經(jīng)元細(xì)胞的純度。然后，用免疫熒光對體外培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。

缺氧缺糖（OGD/R）模型及海馬神經(jīng)元凋亡檢測：將培養(yǎng)7 d的原代海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為對照組（無OGD/R治療）、OGD/R組（經(jīng)OGD/R治療）和干預(yù)組（經(jīng)OGD/R治療同時用血塞通注射）。預(yù)暖PBS在37℃洗滌3次，加入神經(jīng)元缺血液，置于缺氧室。用95%氮?dú)夂?% CO2的混合物連續(xù)通風(fēng)20 min，將入口流量控制在20 L/min。隨后，將出口閥夾緊，將該腔室放置在37℃的CO2培養(yǎng)箱中4 h。缺氧4 h后，氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)完成，細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱（37℃，95%空氣和5%CO2）中常規(guī)培養(yǎng)。同時用血塞通注射液處理細(xì)胞，復(fù)氧時間分別為3、12、24、48和72 h。收集各組神經(jīng)元，于2000 r/min離心5 min，棄上清液。用冰PBS洗脫后，將細(xì)胞重新懸浮在1∶1×106/mL細(xì)胞懸液中結(jié)合緩沖液（pH = 7.3）。用AnnexinV-FITC和PI在黑暗環(huán)境中染色15 min后，用流式細(xì)胞儀測定凋亡和死亡細(xì)胞的數(shù)量。

采用蛋白免疫印跡法檢測培養(yǎng)海馬神經(jīng)元胞紅蛋白和HMGB1的表達(dá)：5個復(fù)蘇時間點(diǎn)培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞總蛋白的提取。用Bio-Rad蛋白測定系統(tǒng)（Hercules，美國）測定蛋白質(zhì)濃度，然后用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜（Millipore）上。膜在室溫下用5%脫脂奶粉堵塞1 h，與初級抗體孵育一夜。膜與HRP標(biāo)記的次級抗體孵育室溫下1 h，在三乙醇胺緩沖鹽水與吐溫中洗滌3 ～ 10 min。含有這些蛋白質(zhì)的膜用適當(dāng)?shù)目贵w進(jìn)行免疫印跡。蛋白條帶進(jìn)行掃描定量。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

利用彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光鏡和定量分析。數(shù)據(jù)處理與圖象采集則應(yīng)用GraphPad Prism 6和Excel 2016進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以? 表示，應(yīng)用方差分析（多樣本均數(shù)的兩兩比較采用SNK法）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胞紅蛋白和HMGB1的含量與表達(dá)

SO組在5個時間點(diǎn)血清和海馬 CA1區(qū)中胞紅蛋白的含量與表達(dá)的D值較高，HMGB1的含量與D值較低，但各時間點(diǎn)無差異（P均> 0.05）。CPR組各時間點(diǎn)與SO組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.01），其中胞紅蛋白的含量與D值在3 h是明顯降低的，但隨CPR時間延長逐漸提高，到24 h達(dá)高峰，48 h又下降，72 h略有下降，但仍處于高峰;HMGB1的含量與D值，在3 h就明顯增高，且隨CPR時間延長逐漸提高，到48 h達(dá)高峰，72 h處于平臺期。IVT組在5個時間點(diǎn)血清和海馬 CA1區(qū)中胞紅蛋白的含量和D值，隨CPR時間延長而增高，HMGB1的含量與D值則隨CPR時間延長而降低，但與CPR組比較，各時間點(diǎn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.01），見表2、3和圖1、2。

二、海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元檢測

48 h觀察時間點(diǎn)HE染色（圖3A）顯示，SO組無神經(jīng)元形態(tài)學(xué)異常，而 CPR組細(xì)胞體萎縮和核固縮最多。與SO組相比，CPR組活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而干預(yù)組活細(xì)胞數(shù)量明顯增加。48 h觀察時間點(diǎn)TUNEL免疫熒光染色結(jié)果（圖3B、C）顯示SO組幾乎未見凋亡神經(jīng)元，而CPR組神經(jīng)元凋亡陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于SO組，而且凋亡率也明顯增高。IVT組與CPR組相比，凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，凋亡率也明顯降低。

三、體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的鑒定及其凋亡率

用 FITC標(biāo)記的MAP2抗體對培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元進(jìn)行免疫熒光染色。如圖4A 所示，除了海馬神經(jīng)元，幾乎沒有其他細(xì)胞。海馬神經(jīng)元生長良好，神經(jīng)纖維交織成網(wǎng)。圖4B～D所示，OGD/R組海馬神經(jīng)元凋亡明顯增加，凋亡率為42.40%，與對照組（11.16%）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <

0.01）。與OGD/ R模型組相比，干預(yù)組（21.36%）海馬神經(jīng)元凋亡率降低（P < 0.01）。

四、體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中胞紅蛋白和HMGB1的表達(dá)

SO組、CPR組和IVT組分別表示對照組、OGD/R組和血塞通+OGD/R組，見圖5B、C。在5個時間點(diǎn)，HMGB1在對照組、OGD/R組和血塞

通+OGD/R組的蛋白表達(dá)趨勢一致，且在CPR組中表達(dá)最高，IVT組明顯低于CPR組，SO組中則表達(dá)最低;胞紅蛋白表達(dá)在CPR組中3 h表達(dá)最低，但隨時間延長有所增高，48 h達(dá)高峰，72 h略有降低，與SO組、IVT組表達(dá)趨勢基本一致，且在CPR組中表達(dá)最低，IVT組明顯高于CPR組，SO組中表達(dá)最高。

五、各組胞紅蛋白 mRNA和HMGB1 mRNA表達(dá)水平比較

胞紅蛋白 mRNA和HMGB1 mRNA在每組腦組織中均有表達(dá)，CPR組及IVT組HMGB1表達(dá)明顯強(qiáng)于SO組，在3 h時間點(diǎn)，CPR組HMGB1表達(dá)水平明顯高于IVT組。與CPR組相比，IVT組明顯減少。在其他4個時間點(diǎn)，3組HMGB1的表達(dá)趨勢與3 h后的趨勢一致。而CPR和IVT組中的胞紅蛋白表達(dá)是下降的。在3 h 時間點(diǎn)，CPR組胞紅蛋白表達(dá)水平明顯低于SO組;與CPR組相比，IVT組顯著增加，其他4個時間點(diǎn)胞紅蛋白的表達(dá)趨勢與3 h后趨勢一致，見圖6、7。

討 論

心臟停搏是一種以心臟機(jī)械活動突然停止，致全身血流突然中止為特征的突發(fā)事件，隨后導(dǎo)致心源性猝死[7]。CPR作為心臟停搏患者最有效的急救技術(shù)，雖然有了明顯的提高和廣泛的普及，但此類患者的預(yù)后并未見顯著改善。美國心臟學(xué)會最近的數(shù)據(jù)顯示，美國居民每年心臟停搏發(fā)生率約達(dá)0.111%，總體存活率僅為10% ～ 20%，顯然還是很低的[8]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測大鼠心臟停搏/CPR后胞紅蛋白和HMGB1在大腦海馬回CA1區(qū)神經(jīng)元中表達(dá)及在外周血清中含量，來研究其與腦損傷的關(guān)系，然后用血塞通干預(yù)治療以觀察其在心臟停搏/CPR中的作用與機(jī)制，從而為提高CPR率提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

海馬對缺血高度敏感，是心臟驟停期間受損最嚴(yán)重的腦區(qū)之一，故很多動物實(shí)驗(yàn)都選大鼠大腦海馬回作為檢測區(qū)。Neigh等[9]的研究表明，接受心臟停搏/CPR后的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元總數(shù)比SO組明顯減少。而本實(shí)驗(yàn)中，HE染色和TUNEL免疫熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，在48 h觀察點(diǎn)，與SO組比較，CPR組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，神經(jīng)元凋亡率明顯增高，這也與前人實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，而血塞通治療后能顯著降低神經(jīng)元凋亡率，增加活細(xì)胞數(shù)量，因此我們的實(shí)驗(yàn)動物模型制作是成功的，這就為整個實(shí)驗(yàn)的成功奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。

胞紅蛋白具備球蛋白的生物特性，能可逆結(jié)合O2、CO2等氣體配體，參與體內(nèi)氧氣運(yùn)輸[10]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)胞紅蛋白可促進(jìn)氧在組織中的擴(kuò)散，清除一氧化氮或活性氧，并在細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時起保護(hù)作用，且與體內(nèi)一氧化氮的代謝有關(guān)，有研究證實(shí)胞紅蛋白還具有抗炎癥、抗凋亡、修復(fù)、再生的作用等[11-13]?？梢姲t蛋白對哺乳動物來說是一個有保護(hù)作用的蛋白。細(xì)胞外釋放HMGB1，是一種危險信號，通過激活各種免疫相關(guān)細(xì)胞，與細(xì)胞外多種受體（主要為RAGE和TLRs）結(jié)合，啟動多條信號傳導(dǎo)途徑，尤其激活NF-κB介導(dǎo)的炎癥樞紐，從而激發(fā)其他炎癥因子如TNF-α、IL-6和IL-1β等釋放，引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，炎癥反應(yīng)放大，可見HMGB1在炎癥反應(yīng)的發(fā)生、啟動中起到了關(guān)鍵作用[14] 。

本實(shí)驗(yàn)通過ELISA法、免疫組化SABC法和qRT-PCR法定量結(jié)果表明，與SO組相比，CPR組大鼠血清和海馬中對應(yīng)的胞紅蛋白濃度、D值和基因表達(dá)是降低的，但隨時間延長而增加，24 h達(dá)高峰，48 h開始稍降低;而HMGB1濃度、D值和基因表達(dá)是增加的，并隨時間延長而增加，48 h達(dá)高峰。血塞通干預(yù)治療后，血清和海馬中對應(yīng)的胞紅蛋白濃度、D值和基因表達(dá)與CPR組比較均明顯增加，而HMGB1濃度、D值和基因表達(dá)則均明顯降低。本實(shí)驗(yàn)中胞紅蛋白和HMGB1在SO組和CPR組的表達(dá)趨勢與前期研究是基本一致的。 雖然胞紅蛋白和HMGB1在缺血再灌注過程中都有表達(dá)增強(qiáng)，但它們的意義不同。胞紅蛋白的表達(dá)增強(qiáng)以保護(hù)組織免受缺氧為目的，而HMGB1則是負(fù)責(zé)啟動細(xì)胞或組織的炎癥反應(yīng)。這可能因?yàn)槿毖毖鹾?，活化HIF-1，啟動胞紅蛋白出現(xiàn)應(yīng)激表達(dá)，同時激活一氧化氮合成酶參與一氧化氮的清除，從而代償性增加胞紅蛋白輸氧、運(yùn)氧、儲氧功能，以保證腦及周圍組織的供氧，起到腦及周圍組織的保護(hù)作用[15]。通過血塞通干預(yù)治療后大腦和外周血清中胞紅蛋白的表達(dá)和含量都是增加的，這就可抑制NF-κB促炎因子的表達(dá)，炎癥反應(yīng)的樞紐受抑，因此級聯(lián)反應(yīng)就不會發(fā)生，從而可降低缺血/再灌注損傷，神經(jīng)元凋亡也明顯下降，可見其與神經(jīng)及其他組織的修復(fù)與保護(hù)是一致的。但是心臟停搏/ CPR后48 h時，胞紅蛋白的表達(dá)與含量反而減弱/降低了，其原因可能是氧的消耗與儲備減少到一定程度時，與胞紅蛋白結(jié)合減少，甚至沒有結(jié)合，這時胞紅蛋白在神經(jīng)元中的表達(dá)就會減弱，血中的含量也就相應(yīng)地減少。但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。由此可見，通過本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)胞紅蛋白具有抗凋亡、攜氧、儲氧的功能，而血塞通可通過提高胞紅蛋白對缺血缺氧的應(yīng)答，在一定時間內(nèi)參與周圍細(xì)胞及神經(jīng)元的保護(hù)作用。HMGB1可能具有多效性，其作用可能是缺血缺氧，刺激相關(guān)細(xì)胞遷移、固定及釋放一些炎癥介質(zhì)，從而激活NF-κB介導(dǎo)的炎癥樞紐，HMGB1在接受炎癥信號后由細(xì)胞內(nèi)移到細(xì)胞外，并與多種受體（主要為RAGE和TLRs）結(jié)合，啟動多條信號傳導(dǎo)途徑，發(fā)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，這就解釋了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果[16]。有研究表明，HMGB1在心臟停搏患者復(fù)蘇后，其腦脊液和血液中含量增高明顯，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是一致的[17]。而通過血塞通治療后，HMGB1在大腦中的表達(dá)明顯減弱，血清中含量也明顯降低，從而達(dá)到對周圍細(xì)胞及神經(jīng)元的保護(hù)作用。

通過建立OGD/R模型，體外培養(yǎng)新生小鼠原代海馬神經(jīng)元，證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與體外培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，而OGD/R模型是一種在細(xì)胞水平模擬缺血再灌注的體外模型，能全面反映缺氧缺血再灌注過程中的細(xì)胞狀態(tài)，廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中的體內(nèi)外模型，因此建立OGD/R模型，從細(xì)胞水平來證實(shí)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是可靠的[18]。有研究表明，OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡率明顯高于正常組，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，而且也證實(shí)本實(shí)驗(yàn)中血塞通對大鼠大腦缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用[19-20]。經(jīng)上述分析可知，血塞通可能通過上調(diào)胞紅蛋白 mRNA和下調(diào)HMGB1 mRNA的蛋白，從而抑制炎癥反應(yīng)，減少海馬神經(jīng)元的凋亡，達(dá)到腦保護(hù)的效果。

綜上所述，血塞通在干預(yù)治療大鼠心臟停搏中，細(xì)胞中胞紅蛋白的表達(dá)上調(diào)，HMGB1的表達(dá)則下調(diào)，抑制多條信號途徑，從而抑制其他炎癥因子釋放而抗炎、抗凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Jentzer J C， Clements C M， Wright R S， White R D， Jaffe A S. Improving survival from cardiac arrest： a review of contemporary practice and challenges. Ann Emerg Med，2016，68（6）：678-689.

[2] Fan J， Cai S， Zhong H， Cao L， Hui K， Xu M， Duan M， Xu J. Therapeutic hypothermia attenuates global cerebral reperfusion-induced mitochondrial damage by suppressing dynamin-related protein 1 activation and mitochondria-mediated apoptosis in a cardiac arrest rat model. Neurosci Lett，2017，647：45-52.

[3] Kleinman M E， Goldberger Z D， Rea T， Swor R A， Bobrow B J， Brennan E E， Terry M， Hemphill R， Gazmuri R J， Hazinski M F， Travers A H. 2017 American Heart Association Focused Update on Adult Basic Life Support and Cardiopulmonary Resuscitation Quality： An Update to the American Heart Association Guidelines for Cardiopulmonary Resuscitation and Emergency Cardiovascular Care. Circulation，2018，137（1）：e7-e13.

[4] Shi X， Li M， Huang K， Zhou S， Hu Y， Pan S， Gu Y. HMGB1 binding heptamer peptide improves survival and ameliorates brain injury in rats after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation. Neuroscience， 2017， 360：128-138.

[5] 謝彪，黃洋，周翔，譚智天，朱水波.大鼠窒息性心跳驟停心肺復(fù)蘇后腦組織自噬水平的變化. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2019，36（2）：282-285.

[6] Zhang W，? Wang T，? Zhang Z. Improvement and evaluation of the rat model of myocardial ischemia reperfusion injury. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica， 2018，26（3）：311-316.

[7] Oda Y， Tsuruta R， Fujita M， Kaneda K， Kawamura Y， Izumi T， Kasaoka S， Maruyama I， Maekawa T. Prediction of the neurological outcome with intrathecal high mobility group box 1 and S100B in cardiac arrest victims： a pilot study. Resuscitation，2012，83（8）：1006-1012.

[8] Benjamin E J， Virani S S， Callaway C W， Chamberlain A M， Chang A R， Cheng S， Chiuve S E， Cushman M， Delling F N， Deo R， de Ferranti S D， Ferguson J F， Fornage M， Gillespie C， Isasi C R， Jiménez M C， Jordan L C， Judd S E， Lackland D， Lichtman J H， Lisabeth L， Liu S， Longenecker C T， Lutsey P L， Mackey J S， Matchar D B， Matsushita K， Mussolino M E， Nasir K， O’Flaherty M， Palaniappan L P， Pandey A， Pandey D K， Reeves M J， Ritchey M D， Rodriguez C J， Roth G A， Rosamond W D， Sampson U K A， Satou G M， Shah S H， Spartano N L， Tirschwell D L， Tsao C W， Voeks J H， Willey J Z， Wilkins J T， Wu J H， Alger H M， Wong S S， Muntner P; American Heart Association Council on Epidemiology and Prevention Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.Heart disease and stroke statistics-2018 Update： a report from the american heart association. Circulation，2018，137（12）：e67-e492.

[9] Neigh G N， Glasper E R， Kofler J， Traystman R J， Mervis R F， Bachstetter A， DeVries A C. Cardiac arrest with cardiopulmonary resuscitation reduces dendritic spine density in CA1 pyramidal cells and selectively alters acquisition of spatial memory. Eur J Neurosci，2004，20（7）：1865-1872.

[10] Zhou D， Hemann C， Boslett J， Luo A， Zweier J L， Liu X. Oxygen binding and nitric oxide dioxygenase activity of cytoglobin are altered to different extents by cysteine modification. FEBS Open Bio，2017，7（6）：845-853.

[11] Tian S F， Yang H H， Xiao D P， Huang Y J， He G Y， Ma H R， Xia F， Shi X C. Mechanisms of neuroprotection from hypoxia-ischemia （HI） brain injury by up-regulation of cytoglobin （CyGB） in a neonatal rat model. J Biol Chem，2013，288（22）：15988-6003.

[12] Gomes B R B， de Sousa G L S， Ott D， Murgott J， de Sousa M V， de Souza P E N， Roth J， Veiga-Souza F H. Cytoglobin attenuates neuroinflammation in lipopolysaccharide-activated primary preoptic area cells via NF-κB pathway inhibition. Front Mol Neurosci，2019，12：307.

[13] Singh S， Canseco D C， Manda S M， Shelton J M， Chirumamilla R R， Goetsch S C， Ye Q， Gerard R D， Schneider J W， Richardson J A， Rothermel B A， Mammen P P. Cytoglobin modulates myogenic progenitor cell viability and muscle regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（1）：E129-E138.

[14] Wang H， Ward M F， Sama A E. Novel HMGB1-inhibiting therapeutic agents for experimental sepsis. Shock，2009，32（4）：348-357.

[15] Mathai C， Jourd’heuil F L， Lopez-Soler R I， Jourd’heuil D. Emerging perspectives on cytoglobin， beyond NO dioxygenase and peroxidase. Redox Biol，2020，32：101468.

[16] 王思儀，黎潔瑤，于濤，許稷豪，陳其奎，夏忠勝.丁酸通過下調(diào)HMGB1抑制高糖誘導(dǎo)下結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460的異常增殖.新醫(yī)學(xué)，2018，49（4）：234-240.

[17] Oda Y， Tsuruta R， Fujita M， Kaneda K， Kawamura Y， Izumi T， Kasaoka S， Maruyama I， Maekawa T. Prediction of the neurological outcome with intrathecal high mobility group box 1 and S100B in cardiac arrest victims： a pilot study. Resuscitation，2012，83（8）：1006-1012.

[18] Hossmann K A. Cerebral ischemia： models， methods and outcomes. Neuropharmacology，2008，55（3）：257-270.

[19] Wang C P， Shi Y W， Tang M， Zhang X C， Gu Y， Liang X M， Wang Z W， Ding F. Isoquercetin ameliorates cerebral impairment in focal ischemia through anti-oxidative， anti-inflammatory， and anti-apoptotic affects in primary culture of rat hippocampal neurons and hippocampal CA1 region of rats. Mol Neurobiol，2017，54（3）：2126-2142.

[20] Cao Y， Zhang L， Sun S， Yi Z， Jiang X， Jia D. Neuroprotective effects of syringic acid against OGD/R-induced injury in cultured hippocampal neuronal cells. Int J Mol Med，2016，38（2）：567-573.

（收稿日期：2021-04-05）

（本文編輯：楊江瑜）