無創(chuàng)產(chǎn)前檢測10號染色體異常結(jié)果分析

李怡?蔡嬋慧?盧建?郭芳芳?侯亞萍?楊潔霞

【摘要】目的 探討無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（NIPT）技術(shù)在篩查胎兒10號染色體非整倍體和片段性非整倍體的臨床應(yīng)用價值。方法 收集NIPT提示為10號染色體非整倍體和片段性非整倍體異常的孕婦共24例，其中有21 例孕婦接受介入性產(chǎn)前診斷，進(jìn)行染色體核型分析和（或）染色體微陣列分析。根據(jù)臨床資料，結(jié)合血清學(xué)唐氏綜合征篩查、介入性產(chǎn)前診斷、妊娠結(jié)局隨訪等結(jié)果對所有病例進(jìn)行綜合分析。結(jié)果 21例的介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果中，10號染色體異常6例，陽性預(yù)測值為29%（6/21）。6例確診的10號染色體異常病例中，1例失訪，1例產(chǎn)后拒訪，3例引產(chǎn)終止妊娠，1例經(jīng)剖腹產(chǎn)生育一2.8 kg女孩，隨訪發(fā)育正常。結(jié)論 NIPT在篩查胎兒10號染色體異常方面有一定的價值，但需要進(jìn)一步的染色體核型分析和（或）染色體微陣列分析驗證。

【關(guān)鍵詞】無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測;10號染色體;單親二體

Application of non-invasive prenatal testing in screening of fetal chromosome 10 abnormalities： a report of 24 cases Li Yi， Cai Chanhui， Lu Jian， Guo Fangfang， Hou Yaping， Yang Jiexia. Medical Genetics Center， Guangdong Women and Children Hospital， Guangzhou 511400， China

Corresponding author， Yang Jiexia， E-mail：? yixfimmu@126.com

【Abstract】Objective To investigate the clinical application of non-invasive prenatal testing （NIPT） in the screening of fetal chromosome 10 aneuploidy and fragmented aneuploidy. Methods A total of 24 pregnant women with chromosome 10 aneuploidy and fragmented aneuploidy by NIPT were recruited in this study. Among them， 21 pregnant women received interventional prenatal diagnosis for chromosome karyotype analysis and/or chromosome microarray analysis. Comprehensive analyses of all cases were conducted according to the clinical data combined with the results of serological Down’s syndrome screening， interventional prenatal diagnosis， and pregnancy outcome follow-up. Results Among the 24 cases with chromosome 10 abnormalities indicated by NIPT， 21 of them received interventional prenatal diagnosis. Prenatal diagnosis results showed that 6 of them were diagnosed with chromosome 10 abnormalities， and the positive predictive value was 29% （6/21）. Among the 6 confirmed cases with chromosome 10 abnormalities， one case was lost to follow-up， one case refused follow-up after delivery， three cases were induced to terminate pregnancy. And one case delivered a girl weighed 2.8 kg by cesarean section and normal development was reported during subsequent follow-up. Conclusion NIPT has certain value in the screening of fetal chromosome 10 abnormalities， whereas further karyotype analysis and/or chromosome microarray analysis are required for verification.

【Key words】Non-invasive prenatal testing; Chromosome 10; Uniparental disomy

我國是出生缺陷的高發(fā)國家，《中國出生缺陷防治報告（2012）》統(tǒng)計顯示，我國出生缺陷的發(fā)生率約為5.6%。染色體異常是導(dǎo)致出生缺陷重要原因，目前尚無有效治療手段。近年來，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（NIPT）在臨床的應(yīng)用發(fā)展迅速，該技術(shù)相比于介入性產(chǎn)前診斷具有無創(chuàng)的優(yōu)勢。目前多項研究已表明，NIPT對于21-三體 、18-三體和13-三體綜合征具有良好的檢測效能，而對于性染色體異常及其他常染色體異常也具有一定的檢測價值，但仍需積累足夠的臨床數(shù)據(jù)及進(jìn)一步的介入性產(chǎn)前診斷驗證[1]。目前國內(nèi)外針對NIPT其他染色體異常罕有大數(shù)據(jù)分析，因此臨床上對于NIPT提示其他染色體異常病例的處理頗為棘手[2]。10號染色體異?？赡軙?dǎo)致發(fā)育遲緩、特殊面容等，少見多病例報道。本研究通過數(shù)據(jù)積累總結(jié)24例經(jīng)NIPT提示為10號染色體異常的孕婦，以探討NIPT技術(shù)在篩查胎兒10號染色體非整倍體和片段性非整倍體中的臨床應(yīng)用價值，現(xiàn)報告如下。

對象與方法

一、研究對象

選取2016年1月至2018年12月在廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心就診，且自愿接受NIPT檢測的妊娠12周以上的孕婦共33 368例（近期未接受異體輸血、細(xì)胞治療和移植手術(shù)等，體質(zhì)量< 100 kg），將其中12例經(jīng)NIPT結(jié)果提示為10號染色體異常的孕婦及其他12例在外院行NIPT提示為10號染色體異常的病例共24例作為研究對象。所有孕婦均已簽署知情同意書。

二、方 法

1. NIPT

采集孕婦外周血10 mL于EDTA-K2抗凝管中，按照Magen磁珠法核酸提取試劑盒說明書提取血漿中游離DNA;以博奧晶芯@胎兒染色體非整倍體（21-三體 、18-三體和13-三體）檢測試劑盒對提取的游離DNA構(gòu)建文庫;用Throme Fisher公司 Ion proton平臺半導(dǎo)體芯片測序法對血漿中游離DNA樣本進(jìn)行低深度全基因組測序，將測序結(jié)果與人類參考基因組堿基序列進(jìn)行比對，通過博奧木華公司的無創(chuàng)產(chǎn)前數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行生物信息分析，分析受檢樣本中目標(biāo)染色體相對比例的變化，以判斷待測樣本是否存在染色體非整倍體及拷貝數(shù)變異。采用基于二元假設(shè)的Z值判斷某條染色體是否有拷貝數(shù)的異常，主要判斷標(biāo)準(zhǔn)：若Z值≥3，結(jié)果提示為非整倍體高風(fēng)險或重復(fù);若Z值為-2.9～2.9，結(jié)果提示為非整倍體低風(fēng)險;若Z值≤-3，提示為單體可能或缺失[3]。

2. 染色體核型G顯帶檢測

經(jīng)知情同意，抽取胎兒臍血（病例14、24）或羊水（除病例14、24）行細(xì)胞接種、培養(yǎng)、收獲、制備染色體玻片，顯微鏡下分析核型，計數(shù)20個染色體核型，分析 5 個核型。G顯帶分辨率為350～420條帶。根據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ ISCN 2016）分析染色體核型。

3. 染色體微陣列分析（CMA）

使用美國 Affymetrix公司的 CytoScan750k細(xì)胞遺傳學(xué)檢測芯片：抽取胎兒臍血（病例14、24）或羊水（除病例14、24）經(jīng)DNA提取、酶切、連接、PCR擴(kuò)增純化、濃度測定、產(chǎn)物片段化、標(biāo)記、雜交、將雜交后的芯片用洗染工作站洗染、最后將芯片放入掃描儀掃描。拷貝數(shù)變異的認(rèn)定：結(jié)果判讀參照 OMIM、DGV、ClinGen、ECIPHER等數(shù)據(jù)庫，參照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（ACMG）的指南對所檢拷貝數(shù)變異（CNV）按致病性、可能致病性、臨床意義不明、可能良性和良性進(jìn)行分類。

4. 隨 訪

收集研究病例的臨床資料，并追蹤隨訪其妊娠結(jié)局。在本院就診及分娩的孕婦通過查閱本院臨床記錄隨訪;在外院分娩的孕婦，通過電話隨訪。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 20.0 處理數(shù)據(jù)。所有計數(shù)資料用頻數(shù)和頻率表示。NIPT、核型或CMA結(jié)果通過陽性預(yù)測值 （PPV）進(jìn)行評估，PPV=真陽性病例數(shù)/（真陽性病例+假陽性病例）。

結(jié) 果

一、NIPT、染色體核型分析及CMA結(jié)果

本院NIPT共檢出12例10號染色體異常，異常率為0.036%（12/33 368）。24例NIPT提示10號染色體異常的孕婦中，有21例接受進(jìn)一步介入性產(chǎn)前診斷。其中 6例10號染色體核型分析及CMA結(jié)果異常，陽性預(yù)測值（PPV）為 29% （6/21）。6例中，10號染色體單親二體2例、致病性CNV 3例、臨床不明意義CNV 1例，見表1。

二、24例NIPT提示10號染色體陽性的臨床診斷和妊娠結(jié)局

24例的臨床診斷及妊娠結(jié)局見表2。經(jīng)遺傳咨詢，CMA產(chǎn)前檢測為致病性CNV的病例3、病例6、病例23，孕婦均選擇終止妊娠，其檢測結(jié)果見圖1～3。

討 論

自2011年以來，基于孕婦外周血胎兒游離DNA（cffDNA）的NIPT技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床，主要用于分析胎兒患21、13、18染色體非整倍體的風(fēng)險，因相對于侵入性產(chǎn)前診斷具有無創(chuàng)的優(yōu)點，廣為孕婦接受。由于檢測技術(shù)為低深度高通量測序，且目前認(rèn)為cffDNA主要來源于母體胎盤滋養(yǎng)層凋亡或壞死后釋放，在孕10周后至分娩期間，cffDNA濃度平均約為10%～30%，其準(zhǔn)確度仍需進(jìn)一步提高。為提高cffDNA的檢出水平，Hu等[4]開發(fā)了富集cffDNA，將胎兒游離DNA檢出水平提高1.5～4倍，明顯提高了檢測成功率，減少假陰性概率。國際產(chǎn)前診斷學(xué)會（ISPD）認(rèn)為，NIPT擴(kuò)展檢測應(yīng)局限于研究微缺失/微重復(fù)綜合征范圍內(nèi)，檢測結(jié)果需結(jié)合臨床評價[5]。

本研究對NIPT提示的21例10號染色體異常結(jié)果進(jìn)一步行介入性產(chǎn)前診斷驗證，以期為臨床對該類病例的遺傳咨詢及處理提供參考。UPD指的是同一條染色體或者部分染色體均由同一個親本產(chǎn)生的，隨后另一個親本相應(yīng)拷貝缺失。UPD可形成于整個染色體或染色體的部分區(qū)域，11%的UPD病例為節(jié)段性。UPD最可能形成機(jī)制是三體自救和單體自救[6]。本研究檢出2例UPD（10），目前UPD（10）致病性不明確，但UPD本身會增加隱性遺傳病的患病風(fēng)險。NIPT檢測的主要是cffDNA，胎盤可能存在10號染色體三體細(xì)胞系，因此顯示為10號染色體偏多。胎盤存在三體可能會引起胎盤功能不良，需嚴(yán)格監(jiān)測胎兒發(fā)育情況。10號染色體三體是致死性的，本研究未檢測出胎兒為10號染色體三體，提示胎兒本身是10號染色體三體的可能性較低，但10號染色體可能以UPD形式存在，雖然檢測結(jié)果顯示僅有2例，可能實際更多，這為臨床對于NIPT提示10號染色體偏多病例的遺傳咨詢及處理提供參考。

此外，本研究經(jīng)NIPT及CMA和（或）染色體核型驗證確診4例10號染色體片段性非整倍體異常，其中3例10號染色體微缺失（致病性CNV），1例10號染色體微重復(fù)（臨床意義不明）。病例3在10號染色體10q22.3-q23.2位置發(fā)生缺失，該區(qū)域缺失可導(dǎo)致“10q22.3-q23.2缺失綜合征”（OMIM #612242），主要表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、語言延遲及特殊面容（眼距寬、低位耳等）等[7]。病例23 在10號染色體10q25.3-q26.3位置發(fā)生缺失，該區(qū)域缺失可導(dǎo)致“10q26缺失綜合征”（OMIM #609625），該綜合征主要表現(xiàn)為面部異常、精神發(fā)育遲滯等[8]。曾有研究報道一患兒智力低下及發(fā)育異常，可能是18號染色體 18p11.32-p11.22發(fā)生10 Mb的缺失及18p11.22-18qter 低比例三體嵌合的共同作用，患兒未表現(xiàn)出 18p 缺失綜合征、18 部分三體綜合征嚴(yán)重缺陷的臨床癥狀，可能由嵌合性核型所致[7]。本研究NIPT提示病例6的10號染色體存在24 Mb的重復(fù)，經(jīng)染色體核型及CMA檢測顯示10p15.3微缺失，涉及ZMYND11基因（OMIM #608668）單倍型不足，可能引起胎兒智力發(fā)育遲緩，且合并18號染色體嵌合（比例33%）[8]。該例父母染色體正常，胎兒染色體異常為新生突變，超聲提示胎盤呈球拍狀聲像，其NIPT結(jié)果與CMA結(jié)果不一致，可能是限制性胎盤嵌合體導(dǎo)致未能檢測出胎兒18號染色體異常，提示可能NIPT也存在假陰性。本研究檢測出3例10號染色體片段性非整倍體（致病性CNV），經(jīng)遺傳咨詢，孕婦均選擇終止妊娠，表明NIPT對遺傳優(yōu)生優(yōu)育具有指導(dǎo)意義。病例7發(fā)現(xiàn)1例10號染色體發(fā)生8 Mb的重復(fù)，CMA顯示10q21.1q21.2位置發(fā)生重復(fù)，數(shù)據(jù)庫表示臨床意義不明，該例隨訪顯示發(fā)育正常，為臨床提供參考意義。

本研究通過NIPT對10號染色體異常結(jié)果進(jìn)行分析，陽性預(yù)測值為29%。有報道14例NIPT提示7號染色體異常病例中，2例CMA顯示基因拷貝數(shù)異常;且從35例NIPT提示7號染色體異常病例中選取10例行下一代測序驗證均為限制性胎盤嵌合[9]。本研究不足之處在于未能對假陽性標(biāo)本的胎盤進(jìn)行高通量測序驗證是否是由于CPM導(dǎo)致的。NIPT可在一定程度上篩查出10號染色體非整倍體和片段性非整倍體的異常胎兒，主要用于分析13、18、21非整倍體，對于其他染色體檢測尚未有統(tǒng)一指導(dǎo)意見，僅用于臨床研究，其臨床應(yīng)用價值尚需進(jìn)一步的數(shù)據(jù)積累。ACOG關(guān)于NIPT的臨床指南目前并不推薦將NIPT作為其他染色體微缺失的篩查方法，對于了解胎兒是否存在染色體微缺失或者微重復(fù)，最好的確認(rèn)方式仍為絨毛或羊膜穿刺術(shù)行CMA[10]。NIPT僅為篩查方法，對于其他染色體陽性結(jié)果以補(bǔ)充報告形式發(fā)放，需進(jìn)一步遺傳咨詢，知情選擇介入性產(chǎn)前診斷分析。對于產(chǎn)前檢測結(jié)果未見異常者，建議定期超聲監(jiān)測胎兒發(fā)育情況;對于產(chǎn)前檢測結(jié)果異常，需遺傳咨詢，分析胎兒預(yù)后，由孕婦自主選擇胎兒去留。2016年美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會認(rèn)為，所有孕婦均可選擇NIPT，并對具有臨床意義的染色體拷貝數(shù)變異行CMA[11]。CMA對于染色體微缺失/微重復(fù)等拷貝數(shù)變異具有分辨率高、定位精準(zhǔn)、檢測周期短的獨特優(yōu)勢。但CMA不能檢測出染色體平衡易位、倒位以及低水平異常嵌合，仍需結(jié)合染色體核型綜合分析[12]。應(yīng)用CMA可檢出染色體不平衡的拷貝數(shù)變異，對染色體微缺失、微重復(fù)綜合征定位精準(zhǔn)，且分辨率高，而傳統(tǒng)染色體核型分析可分析平衡易位，兩者相輔相成，從基因水平指導(dǎo)臨床遺傳咨詢。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-11-04）

（本文編輯：林燕薇）