• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    煙曲霉Cyp51A和Cyp51B生物學(xué)功能差異性分析

    2021-12-30 02:26:54房凌旭梁海王鵬遠(yuǎn)盧中一陳芳艷韓黎
    中國(guó)真菌學(xué)雜志 2021年6期
    關(guān)鍵詞:蠟螟麥角甾醇

    房凌旭 梁海 王鵬遠(yuǎn) 盧中一 陳芳艷 韓黎

    (1.深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院口腔科,深圳 518067;2.深圳大學(xué)高等研究院深圳市海洋微生物組工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060;3.中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制中心消毒與感染控制科,北京 100071)

    煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是自然界中廣泛存在的曲霉屬真菌,其對(duì)化療患者、血液干細(xì)胞和器官移植患者等免疫力低下人群具有條件致病性?,F(xiàn)有研究顯示,由煙曲霉感染引起的患者死亡率較高,例如侵襲性肺曲霉病致死率超過(guò)30%[1-2]。唑類藥物是臨床上治療煙曲霉感染的一線藥物,其作用機(jī)制是通過(guò)自身的唑環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合煙曲霉麥角甾醇合成通路中關(guān)鍵催化酶——羊毛甾醇14-α-脫甲基酶(sterol 14 α-demethylase,Cyp51)活性中心的血紅素,從而抑制該酶對(duì)底物的催化作用,一方面導(dǎo)致煙曲霉細(xì)胞膜中麥角甾醇含量下降,另一方面導(dǎo)致麥角甾醇合成通路中有毒性的中間產(chǎn)物積累,最終抑制煙曲霉生長(zhǎng)[2]。然而,由于Cyp51(及其在酵母等屬中的直系同源蛋白Erg11)是抗人類及植物多種致病真菌藥物的主要靶點(diǎn),臨床和農(nóng)業(yè)中唑類藥物被廣泛應(yīng)用,這導(dǎo)致煙曲霉對(duì)唑類藥物的耐受水平不斷升高,且產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要機(jī)制與Cyp51有關(guān)[3]。

    Cyp51的兩個(gè)旁系同源蛋白Cyp51A和Cyp51B是煙曲霉的兩個(gè)保守蛋白[4]。其中,煙曲霉Cyp51A的功能研究較為詳細(xì),例如該蛋白氨基酸位點(diǎn)G54、L98、Y121、G138、M220和G448的突變可導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)變化,從而降低該蛋白與唑類藥物的結(jié)合能力,最終導(dǎo)致煙曲霉對(duì)唑類藥物耐受水平的升高[5]。特別是煙曲霉Cyp51A的TR34/L98H突變型和TR46/Y121F/T289A突變型被認(rèn)為是臨床和環(huán)境中煙曲霉的重要耐藥機(jī)制[6-7]。此外,轉(zhuǎn)錄調(diào)控子SREBP和蛋白酶RbdB等關(guān)鍵調(diào)控蛋白的突變可引起煙曲霉cyp51A表達(dá)水平升高,進(jìn)而導(dǎo)致菌株對(duì)唑類藥物產(chǎn)生耐受性[8-9]。然而,煙曲霉Cyp51B的生物學(xué)功能研究卻鮮有報(bào)道[10-11]。通常認(rèn)為,煙曲霉Cyp51B具有脫甲基酶的功能,可能是一種功能冗余蛋白[12]。然而, Cyp51B在曲霉屬真菌中廣泛存在,這提示在曲霉屬最近共同祖先中Cyp51B可能已存在;另一方面,鐮刀菌屬等真菌中存在多個(gè)Cyp51旁系同源蛋白,且這些蛋白已出現(xiàn)功能分化[12]。因此,煙曲霉Cyp51A和Cyp51B在長(zhǎng)期演化過(guò)程中可能產(chǎn)生功能差異,但是目前為止對(duì)煙曲霉Cyp51A和Cyp51B功能比較的研究仍鮮有報(bào)道。

    本研究通過(guò)系統(tǒng)發(fā)生分析、基因編輯技術(shù)、唑類藥物敏感性檢測(cè)、高溫敏感性檢測(cè)和大蠟螟幼蟲(chóng)致病力實(shí)驗(yàn)等綜合分析煙曲霉Cyp51A和Cyp51B功能的差異性,為解析這些重要藥物靶點(diǎn)生物學(xué)功能,進(jìn)而科學(xué)防控?zé)熐垢腥竞湍退幪峁├碚撘罁?jù)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

    實(shí)驗(yàn)菌株 煙曲霉菌株CEA17ΔKu80由法國(guó)巴斯德研究所Jean Paul Latgé教授惠贈(zèng)。本研究中將該菌株定義為野生株(WT);此外,本研究在該菌株基礎(chǔ)上分別敲除cyp51A和cyp51B的編碼基因獲得突變株Δcyp51A和Δcyp51B。

    培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)和沙堡弱培養(yǎng)基(SDA)購(gòu)買(mǎi)自青島海博生物公司?;A(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(MM)由本實(shí)驗(yàn)室配制,主要成分包括微量元素溶液、20×鹽溶液、葡萄糖和瓊脂[13]。

    實(shí)驗(yàn)儀器 9700型PCR擴(kuò)增儀(ABI公司);A2型二級(jí)生物安全柜(Thermo公司);HNY-200B振蕩搖床(歐諾公司);凝膠成像儀(天呈科技公司);恒溫培養(yǎng)箱(黃石器械廠);5804R和5417R型臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf公司);DYY-7C型轉(zhuǎn)印電泳儀電源及配套電泳槽(北京六一公司)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù) 本研究中Cyp51A、Cyp51B和Erg11序列均從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取。在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)時(shí)使用MUSCLE(V3.8.1551)對(duì)蛋白序列進(jìn)行序列對(duì)齊[14];隨后使用TrimAI(V1.4)進(jìn)行序列剪切[15];最后利用IQ-Tree(V1.6.5)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)[16],系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建模型為L(zhǎng)G+G4。

    構(gòu)建突變盒 采用Overlap PCR技術(shù)構(gòu)建含潮霉素突變盒,使用的高保真酶Prime STAR GXL購(gòu)自于大連寶生物公司。PCR體系為:1 μL Prime STAR GXL DNA Polymerase;4 μL dNTP Mixture;10 μL 5×Primer STAR GXL Buffer;1.5 μL正向引物(10 μmol/L);1.5 μL反向引物(10 μmol/L);30 μL滅菌去離子水;1 μL DNA模板(2.5~10 ng)。PCR反應(yīng)條件:98℃ 5 min;(98℃ 10 s,60℃15 s,68℃ 1 kb/min)30循環(huán);68℃ 4 min。使用的相關(guān)引物見(jiàn)表1。

    表1 本研究中構(gòu)建突變盒的引物Tab.1 Primers used to construct mutant cassette in this study

    煙曲霉原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化 煙曲霉原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化的方法參考前人報(bào)道[13]。具體實(shí)驗(yàn)步驟為,將約106個(gè)煙曲霉CEA17ΔKu80的孢子接種至PDA液體培養(yǎng)基,經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后,用滅菌紗布收集菌絲。隨后在30℃下將菌絲在細(xì)胞壁消化體系中孵育3 h,并使用40 μm孔徑細(xì)胞網(wǎng)篩去除未消化菌絲后獲得煙曲霉原生質(zhì)體。用洗脫液將上述原生質(zhì)體洗脫至1.5 mL離心管離心收集,隨后用200 μL儲(chǔ)存液重懸原生質(zhì)體,并加入構(gòu)建的突變盒,置于冰上孵育25 min。最后,在上述孵育物中加入1 mL PEG6000溶液和篩選高滲培養(yǎng)基,經(jīng)37℃培養(yǎng)96 h后,挑取單菌落驗(yàn)證基因敲除情況。

    大蠟螟幼蟲(chóng)致病力實(shí)驗(yàn) 選取重量為0.3~0.35 g大蠟螟幼蟲(chóng)進(jìn)行分組,每組16只。使用含有0.01% Tween 20的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液將5×107個(gè)/mL煙曲霉孢子重懸。使用微量注射器將10 μL上述孢子懸液注射入大蠟螟左排最下端腹足。同時(shí)設(shè)置兩個(gè)對(duì)照組,其中一組大蠟螟被注射10 μL含有0.01% Tween 20的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBST),另一組大蠟螟不做任何處理。注射完成后置于37℃遮光培養(yǎng),每12 h記錄大蠟螟存活情況。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析

    本研究中數(shù)據(jù)經(jīng)GraphPad Prism(V 5.01)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,One-way ANOVA比較多組數(shù)據(jù),P<0.05時(shí),表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果和分析

    2.1 分析煙曲霉Cyp51A和Cyp51B的進(jìn)化關(guān)系

    為分析煙曲霉Cyp51A和Cyp51B的進(jìn)化關(guān)系,本研究選取曲霉屬和鐮刀屬真菌的Cyp51A和Cyp51B,以及酵母屬和念珠菌屬真菌的Erg11(作為外支)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。如圖1結(jié)果顯示,雖然煙曲霉Cyp51A和Cyp51B氨基酸序列相似度高達(dá)69.9%,但兩者分別分布于真菌Cyp51A和Cyp51B聚成的兩大分支,并且Cyp51A和Cyp51B與Erg11存在較遠(yuǎn)進(jìn)化距離,提示Cyp51與Erg11親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。以上結(jié)果提示Cyp51A和Cyp51B分化有可能早于曲霉屬等真菌最近共同祖先的出現(xiàn)。

    圖1 根據(jù)Cyp51B、Cyp51A和Erg11氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.1 Phylogenetic analysis of Cyp51B, Cyp51A, and Erg11

    2.2 構(gòu)建和驗(yàn)證煙曲霉cyp51A和cyp51B基因敲除菌株

    為研究煙曲霉Cyp51A和Cyp51B生物學(xué)功能差異,本研究利用同源重組原理敲除煙曲霉菌株CEA17ΔKu80的cyp51A和cyp51B的編碼基因,原理如下:通過(guò)Overlap PCR技術(shù)構(gòu)建含潮霉素篩選標(biāo)記的突變盒,該突變盒包括靶基因(本研究中為煙曲霉cyp51A或cyp51B)上游同源臂、下游同源臂和潮霉素耐藥基因(見(jiàn)圖2A);再將該突變盒轉(zhuǎn)化至煙曲霉原生質(zhì)體,該突變盒將有一定幾率原位替換靶基因。如圖2B和2C顯示,本研究成功構(gòu)建了用于煙曲霉cyp51A和cyp51B基因敲除的突變盒,并分別轉(zhuǎn)化至用煙曲霉CEA17ΔKu80制備的原生質(zhì)體中,應(yīng)用潮霉素篩選培養(yǎng)基初篩轉(zhuǎn)化子,再進(jìn)行PCR驗(yàn)證。在成功敲除cyp51A或cyp51B編碼基因的突變株中未檢測(cè)到cyp51A或cyp51B編碼基因的片段(見(jiàn)圖2Ca),但可檢測(cè)到潮霉素基因片段(見(jiàn)圖2Cb)。研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn),無(wú)法獲得cyp51A和cyp51B雙基因敲除株,可能是同時(shí)敲除會(huì)導(dǎo)致菌株死亡,提示煙曲霉Cyp51A和Cyp51B在麥角甾醇合成通路中功能具有重疊性。

    圖2 利用同源重組原理敲除煙曲霉cyp51A和cyp51B. a中hph指潮霉素耐藥基因,5’ flanking fragment和3’ flanking fragment分別指靶基因上游同源臂和下游同源臂; Ba中泳道1~4分別為Cyp51A編碼基因的上游同源臂、潮霉素耐藥基因和下游同源臂,以及這些片段拼接后的突變盒; Bb中泳道1~4分別為敲除cyp51B編碼基因擴(kuò)增的上游同源臂、潮霉素耐藥基因和下游同源臂,以及這些片段拼接后的突變盒; Ca中泳道1~12是檢測(cè)轉(zhuǎn)化子中的cyp51A編碼基因,泳道13是陽(yáng)性對(duì)照;泳道14~24是檢測(cè)轉(zhuǎn)化子中的cyp51B編碼基因,泳道25是陽(yáng)性對(duì)照; Cb中泳道1~6是檢測(cè)轉(zhuǎn)化子中是否存在潮霉素耐藥基因,泳道7是陽(yáng)性對(duì)照,泳道8是陰性對(duì)照?qǐng)D3 Δcyp51A和Δcyp51B生物學(xué)功能差異性分析. A.檢測(cè)Δcyp51A和Δcyp51B對(duì)伏立康唑的敏感性,VOR:伏立康唑; B.檢測(cè)Δcyp51A和Δcyp51B對(duì)溫度的敏感性; C.檢測(cè)Δcyp51A和Δcyp51B對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的致病力Fig.2 Knockout of cyp51A and cyp51B in Aspergillus fumigates by homologous recombination technology. A. hph refers to the hygromycin resistance cassette; 5’ flanking fragment and 3’ flanking fragment refer to the upstream and downstream homology arms of target gene, respectively; Ba. panel 1-4 refer to the upstream homology arm, hygromycin resistance cassette, downstream homology arm, and mutant cassette, respectively, for construction of Δcyp51A mutant; Bb. panel 1-4 refer to the upstream homology arm, hygromycin resistance cassette, downstream homology arm, and mutant cassette, respectively, for construction of Δcyp51B mutant; Ca. cyp51A and cyp51B fragments were detected in the Δcyp51A (panel 1-12) and Δcyp51B (panel 14-24) mutants, respectively; panel 13 and 25 are positive controls; Cb. fragments of the hygromycin resistance cassette were detected in Δcyp51A and Δcyp51B mutants (panel 1-6); panel 7 and 8 refer to the positive and negative controls, respectively Fig.3 Functional analysis of Δcyp51A and Δcyp51B in Aspergillus fumigatus. A. voriconazole susceptibility of the Δcyp51A and Δcyp51B mutants; B. high temperature susceptibility of the Δcyp51A and Δcyp51B mutants; C. virulence characterization of the Δcyp51A and Δcyp51B mutants in the Galleria mellonella infection model

    2.3 研究煙曲霉cyp51A和cyp51B生物學(xué)功能差異性

    鑒于真菌Cyp51是唑類藥物的靶點(diǎn),本研究首先檢測(cè)了Δcyp51A和Δcyp51B對(duì)唑類藥物敏感性。如圖3A顯示,雖然在無(wú)藥時(shí)Δcyp51A、Δcyp51B與WT相比,宏觀菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速率無(wú)顯著性差異,但是Δcyp51A對(duì)0.15 mg/L伏立康唑的耐受水平顯著低于WT和Δcyp51B;而與WT相比,Δcyp51B對(duì)伏立康唑的耐受水平略有下降。本研究還發(fā)現(xiàn)在50℃下Δcyp51B在SDA、PDA和MM上的生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯弱于WT和Δcyp51A,而Δcyp51A與WT的生長(zhǎng)能力無(wú)明顯差異,提示Cyp51B在煙曲霉對(duì)高溫環(huán)境耐受中具有重要作用(見(jiàn)圖3B)。鑒于高溫耐受性是煙曲霉有別于其他曲霉的關(guān)鍵特征,且該能力可能與煙曲霉的致病力有關(guān),本研究隨后以大蠟螟幼蟲(chóng)模型檢測(cè)了Δcyp51A和Δcyp51B的致病力,結(jié)果顯示,與WT相比,Δcyp51A(P=0.327)和Δcyp51B(P=0.2589)對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的致病力差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;此外,Δcyp51A和Δcyp51B之間的致病力差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.9127)。

    3 討 論

    Cyp51是保守存在于真菌麥角甾醇合成通路中的關(guān)鍵限速酶,其作為重要的抗真菌藥物靶點(diǎn)長(zhǎng)久以來(lái)得到學(xué)者廣泛關(guān)注[17]?,F(xiàn)已知多種真菌基因組中存在Cyp51旁系同源蛋白,例如指狀青霉(Penicilliumdigitatum)中保守存在Cyp51A和Cyp51B,禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)中甚至存在Cyp51A、Cyp51B和Cyp51C 3個(gè)旁系同源蛋白[12]。一般認(rèn)為,這些Cyp51的同源蛋白由基因復(fù)制產(chǎn)生,并在漫長(zhǎng)演化過(guò)程中在種群中固定和擴(kuò)散。系統(tǒng)發(fā)生分析顯示,包括煙曲霉在內(nèi)的真菌Cyp51A和Cyp51B聚成兩個(gè)主要分支,呈現(xiàn)明顯進(jìn)化距離,提示這兩類旁系同源蛋白在曲霉屬等真菌演化時(shí)間較長(zhǎng),因而生物學(xué)功能可能產(chǎn)生分化。

    本研究成功構(gòu)建煙曲霉cyp51A和cyp51B的單個(gè)基因敲除菌株,但無(wú)法獲得上述兩個(gè)基因的雙敲菌株,提示Cyp51A和Cyp51B在煙曲霉麥角甾醇合成通路中均可行使羊毛甾醇催化活性;其他研究也顯示,禾谷鐮刀菌被單獨(dú)敲除cyp51A、cyp51B或cyp51C基因后,其麥角甾醇的含量無(wú)顯著性差異[12],以上結(jié)果共同說(shuō)明真菌Cyp51同源蛋白在麥角甾醇合成通路中具有功能冗余性。本研究發(fā)現(xiàn),與WT相比,Δcyp51A和Δcyp51B對(duì)伏立康唑耐受水平下降,產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與Cyp51總表達(dá)量下降有關(guān)[18]。此外,Δcyp51A對(duì)伏立康唑耐受的下降程度顯著高于Δcyp51B,暗示伏立康唑?qū)熐笴yp51B的結(jié)合能力可能高于Cyp51A。Andrew等[19]研究中也發(fā)現(xiàn),體外純化后的煙曲霉Cyp51B結(jié)合伏立康唑能力顯著高于Cyp51A。然而,看似矛盾的是,臨床和環(huán)境中分離到的唑類耐藥煙曲霉往往與自身Cyp51A的氨基酸位點(diǎn)突變有關(guān)[20]。對(duì)此矛盾的一種解釋是,煙曲霉Cyp51B是麥角甾醇合成通路中主要催化酶,對(duì)非同義突變的容錯(cuò)率較低,而Cyp51A則是煙曲霉適應(yīng)環(huán)境條件的可調(diào)控蛋白;因此,當(dāng)唑類藥物優(yōu)先與煙曲霉Cyp51B結(jié)合后,藥物篩選壓力更易導(dǎo)致Cyp51A可彈性的表達(dá)和突變。實(shí)際上,其他研究中發(fā)現(xiàn)cyp51B的編碼基因在煙曲霉中是持續(xù)性表達(dá),而cyp51A的編碼基因是誘導(dǎo)性表達(dá),這也從側(cè)面支持了本研究的這一解釋[21]。

    與通常的認(rèn)識(shí)不同,本研究首次發(fā)現(xiàn)Cyp51B并非僅是Cyp51A的功能冗余蛋白,而是在漫長(zhǎng)的演化過(guò)程中分化出獨(dú)特的功能。我們發(fā)現(xiàn)Δcyp51B的高溫耐受性在多種培養(yǎng)基中均顯著低于Δcyp51A和WT,顯示Cyp51B可能在煙曲霉適應(yīng)高溫環(huán)境的抗逆性中具有重要作用。煙曲霉的高溫耐受能力是其區(qū)別于其他曲霉的重要鑒定指標(biāo)。有研究顯示,煙曲霉耐熱能力可能與其致病力有關(guān)[22];此外,煙曲霉的耐熱能力也可能是其在農(nóng)業(yè)堆肥中獲得種群優(yōu)勢(shì),進(jìn)而得到播散的重要原因[23]。因此,對(duì)于煙曲霉高溫耐受基因和調(diào)控信號(hào)通路的研究在尋找藥物靶點(diǎn)和防治煙曲霉相關(guān)疾病等領(lǐng)域有重要前景。有趣的是,在其他研究中顯示,釀酒酵母麥角甾醇合成通路中多個(gè)基因的缺失也可顯著改變突變株對(duì)溫度的適應(yīng)能力[24]。這些結(jié)果暗示真菌的麥角甾醇合成通路可能與其溫度敏感性有重要聯(lián)系,但該假設(shè)仍需在鐮刀菌屬等其他真菌中進(jìn)行驗(yàn)證。本研究推測(cè)cyp51B編碼基因的缺失可能通過(guò)影響煙曲霉麥角甾醇合成通路中間代謝產(chǎn)物含量,進(jìn)而改變了煙曲霉對(duì)高溫的適應(yīng)能力。另一種可能是,煙曲霉Cyp51A與Cyp51B相比,其酶活性在高溫下降低,進(jìn)而干擾了麥角甾醇合成通路,造成煙曲霉生長(zhǎng)減弱。此外,雖然前人認(rèn)為真菌的耐熱能力可能與其致病力有關(guān)[23,25],但本研究在大蠟螟幼蟲(chóng)致病力模型中未發(fā)現(xiàn)Δcyp51B與Δcyp51A和WT相比在致病力上有顯著區(qū)別,因此煙曲霉高溫耐受性與其致病力的聯(lián)系仍需進(jìn)一步研究。

    綜上所述,雖然煙曲霉Cyp51A和Cyp51B在麥角甾醇合成通路功能具有冗余性,但煙曲霉Cyp51A與Cyp51B具有明顯的進(jìn)化距離,提示在漫長(zhǎng)演化過(guò)程中兩種蛋白功能已分化。此外,Cyp51A和Cyp51B在煙曲霉對(duì)唑類藥物耐受性和高溫耐受性等方面均有功能差異性。

    猜你喜歡
    蠟螟麥角甾醇
    麥角硫因治療認(rèn)知衰弱的研究進(jìn)展
    高甾醇植物油研究現(xiàn)狀
    麥角新堿聯(lián)合縮宮素在高危妊娠剖宮產(chǎn)術(shù)中的應(yīng)用
    尼麥角林治療卒中后認(rèn)知障礙的臨床研究
    大蠟螟的非凡聽(tīng)力
    知識(shí)窗(2019年9期)2019-10-09 03:28:34
    巧用寄生蜂防控中蜂巢蟲(chóng)
    蜜蜂雜志(2019年12期)2019-06-16 06:17:00
    大蠟螟營(yíng)養(yǎng)成分分析與評(píng)價(jià)
    石杉?jí)A甲聯(lián)合尼麥角林治療血管性癡呆的效果觀察
    山西中蜂群中發(fā)現(xiàn)蠟螟洼頭小蜂
    微波輔助植物甾醇油酸酯的酶促催化合成
    亚洲av.av天堂| 美女大奶头黄色视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 黑丝袜美女国产一区| 乱人伦中国视频| 免费大片18禁| 街头女战士在线观看网站| 亚洲性久久影院| 在线观看www视频免费| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 成人免费观看视频高清| 另类精品久久| 在线 av 中文字幕| 黄色怎么调成土黄色| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 精品人妻熟女毛片av久久网站| www日本在线高清视频| 日本av免费视频播放| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 91aial.com中文字幕在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 婷婷成人精品国产| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产在线一区二区三区精| 午夜福利影视在线免费观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲天堂av无毛| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产色爽女视频免费观看| 少妇熟女欧美另类| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 中文欧美无线码| 九九在线视频观看精品| 赤兔流量卡办理| 中文字幕制服av| 男男h啪啪无遮挡| 国产一区亚洲一区在线观看| 大香蕉久久成人网| 岛国毛片在线播放| 久久久久久人妻| 亚洲精品国产av成人精品| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 黑人高潮一二区| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 九九爱精品视频在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 99热国产这里只有精品6| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品人妻久久久久久| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲av中文av极速乱| 国产精品不卡视频一区二区| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲欧洲国产日韩| 国产成人精品福利久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 青春草国产在线视频| av在线播放精品| 精品午夜福利在线看| 久久久久久久久久久久大奶| 色94色欧美一区二区| 国产深夜福利视频在线观看| 咕卡用的链子| 国产精品免费大片| 我的女老师完整版在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 人妻一区二区av| 久久这里有精品视频免费| 美女视频免费永久观看网站| 免费日韩欧美在线观看| 伦理电影免费视频| 香蕉国产在线看| 国产高清不卡午夜福利| 18禁国产床啪视频网站| 自线自在国产av| 乱人伦中国视频| 久久久久久久久久成人| 考比视频在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放| videossex国产| 制服人妻中文乱码| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产黄色免费在线视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 精品午夜福利在线看| 国产黄频视频在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产欧美亚洲国产| 免费看光身美女| www.av在线官网国产| 人妻 亚洲 视频| 十八禁高潮呻吟视频| 中文字幕免费在线视频6| 999精品在线视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美日韩亚洲高清精品| 在线观看www视频免费| 成人二区视频| 国产精品一二三区在线看| 一级黄片播放器| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久久久网色| 亚洲四区av| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲精品国产色婷婷电影| 桃花免费在线播放| 人人妻人人澡人人看| 一区在线观看完整版| 亚洲一区二区三区欧美精品| 熟女电影av网| 国产一区二区三区综合在线观看 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久久久精品人妻al黑| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 日韩欧美一区视频在线观看| 丝袜喷水一区| 国产精品久久久久久精品古装| 国产乱来视频区| 精品一区二区三区视频在线| 老司机影院成人| 在现免费观看毛片| 18禁动态无遮挡网站| 国产在视频线精品| 久久综合国产亚洲精品| 观看美女的网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲av男天堂| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品成人在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲精品乱久久久久久| 精品一区二区免费观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 视频区图区小说| av福利片在线| av播播在线观看一区| 男人操女人黄网站| 国产麻豆69| 久久这里只有精品19| 亚洲av.av天堂| 最黄视频免费看| av免费观看日本| 69精品国产乱码久久久| 哪个播放器可以免费观看大片| 制服诱惑二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产在线视频一区二区| 欧美人与善性xxx| 精品少妇黑人巨大在线播放| 考比视频在线观看| 久久狼人影院| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久人人爽人人片av| 国产精品99久久99久久久不卡 | 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲伊人色综图| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 青春草国产在线视频| 亚洲五月色婷婷综合| 欧美成人午夜精品| 自线自在国产av| 九九爱精品视频在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品国产三级国产专区5o| 免费黄网站久久成人精品| 免费黄网站久久成人精品| 精品亚洲成国产av| 午夜福利乱码中文字幕| 日韩制服骚丝袜av| 各种免费的搞黄视频| 久久久久视频综合| 久久人人爽人人爽人人片va| 在线观看美女被高潮喷水网站| 热re99久久国产66热| 九色亚洲精品在线播放| 51国产日韩欧美| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 97人妻天天添夜夜摸| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 成年av动漫网址| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久精品国产a三级三级三级| 三上悠亚av全集在线观看| 飞空精品影院首页| 老熟女久久久| 国产精品久久久av美女十八| 精品一区二区三卡| 国产不卡av网站在线观看| 国产欧美亚洲国产| 夫妻性生交免费视频一级片| 在线看a的网站| 超色免费av| 观看av在线不卡| 桃花免费在线播放| 亚洲国产精品专区欧美| 日日撸夜夜添| 伦理电影免费视频| xxx大片免费视频| 大片电影免费在线观看免费| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲国产欧美在线一区| 男女国产视频网站| 亚洲,一卡二卡三卡| 91精品国产国语对白视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 性色avwww在线观看| 久久人人爽人人片av| 日日啪夜夜爽| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 亚洲第一av免费看| 久久久久久久久久成人| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美精品一区二区免费开放| 美女国产视频在线观看| 男女国产视频网站| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 少妇 在线观看| 丁香六月天网| 国产成人精品在线电影| freevideosex欧美| 精品一区二区免费观看| 成人影院久久| 大片免费播放器 马上看| a级毛片黄视频| 香蕉精品网在线| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美日本中文国产一区发布| 国产精品久久久久久久电影| 美女大奶头黄色视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美性感艳星| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲精品第二区| 日韩一区二区三区影片| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲伊人色综图| 美女中出高潮动态图| 在线精品无人区一区二区三| 九九在线视频观看精品| 五月伊人婷婷丁香| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产视频首页在线观看| 久久精品国产综合久久久 | 精品人妻一区二区三区麻豆| 日韩电影二区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 一区二区日韩欧美中文字幕 | 免费少妇av软件| 欧美精品一区二区免费开放| 蜜臀久久99精品久久宅男| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 最近的中文字幕免费完整| 自线自在国产av| 日韩视频在线欧美| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲成人av在线免费| 亚洲一区二区三区欧美精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 黑人高潮一二区| 久久久精品94久久精品| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 新久久久久国产一级毛片| 深夜精品福利| 亚洲欧美精品自产自拍| 日本av免费视频播放| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产精品.久久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 2018国产大陆天天弄谢| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产激情久久老熟女| 亚洲国产最新在线播放| 香蕉精品网在线| 另类亚洲欧美激情| 日韩av在线免费看完整版不卡| 啦啦啦在线观看免费高清www| 91精品国产国语对白视频| 亚洲av综合色区一区| 成年女人在线观看亚洲视频| 人体艺术视频欧美日本| 午夜av观看不卡| 多毛熟女@视频| a级毛片黄视频| 老女人水多毛片| 色94色欧美一区二区| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品一品国产午夜福利视频| 看免费成人av毛片| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美日韩av久久| 国产成人精品一,二区| 久久久久久久久久人人人人人人| 波多野结衣一区麻豆| 精品第一国产精品| 三级国产精品片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产免费一级a男人的天堂| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 伦理电影免费视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品一区二区三卡| 熟女电影av网| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产视频首页在线观看| 9热在线视频观看99| 在线观看人妻少妇| 亚洲成人av在线免费| 久久久亚洲精品成人影院| 各种免费的搞黄视频| 在线观看免费高清a一片| 亚洲人与动物交配视频| 国产免费又黄又爽又色| 色94色欧美一区二区| 观看av在线不卡| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲综合精品二区| 久久精品国产亚洲av天美| 国产成人一区二区在线| 日韩av不卡免费在线播放| 国产亚洲欧美精品永久| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产一级毛片在线| 久久鲁丝午夜福利片| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产片内射在线| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲国产看品久久| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 最新中文字幕久久久久| av天堂久久9| 久久国内精品自在自线图片| 伊人久久国产一区二区| 免费av不卡在线播放| 26uuu在线亚洲综合色| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 激情视频va一区二区三区| 黄色一级大片看看| 人人妻人人澡人人看| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 亚洲国产欧美日韩在线播放| 91精品三级在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产精品久久久av美女十八| 大话2 男鬼变身卡| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲国产精品成人久久小说| h视频一区二区三区| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲情色 制服丝袜| 麻豆乱淫一区二区| 91精品三级在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 看免费av毛片| 成年av动漫网址| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 黑人高潮一二区| 国产亚洲精品久久久com| 日韩电影二区| 久热久热在线精品观看| 欧美人与善性xxx| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美成人午夜精品| 国产午夜精品一二区理论片| 街头女战士在线观看网站| 日日爽夜夜爽网站| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 成人无遮挡网站| 国产成人精品一,二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久精品国产亚洲av天美| 国产免费一级a男人的天堂| 午夜免费鲁丝| 久久人人97超碰香蕉20202| 在线天堂最新版资源| 欧美精品国产亚洲| 在线观看www视频免费| 99re6热这里在线精品视频| 看非洲黑人一级黄片| 丝袜美足系列| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲精品视频女| 人人澡人人妻人| 自线自在国产av| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 免费观看a级毛片全部| 亚洲成人手机| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲av国产av综合av卡| 国产av国产精品国产| 久久精品国产a三级三级三级| 午夜福利网站1000一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 久久久久久人人人人人| av有码第一页| 一级片'在线观看视频| 青春草国产在线视频| 看十八女毛片水多多多| 亚洲国产av影院在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美 日韩 精品 国产| 黄色配什么色好看| 日韩制服骚丝袜av| 视频中文字幕在线观看| 日日啪夜夜爽| 一区在线观看完整版| 国产亚洲精品久久久com| 日韩在线高清观看一区二区三区| 制服诱惑二区| 日韩免费高清中文字幕av| 免费在线观看完整版高清| 久久这里只有精品19| 男人爽女人下面视频在线观看| 免费在线观看完整版高清| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 亚洲欧洲国产日韩| 2021少妇久久久久久久久久久| 热99久久久久精品小说推荐| 久久这里只有精品19| 成年人午夜在线观看视频| 免费在线观看完整版高清| 搡女人真爽免费视频火全软件| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产av一区二区精品久久| 美女主播在线视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 少妇的逼水好多| av福利片在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 99视频精品全部免费 在线| 一级毛片电影观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产日韩欧美在线精品| 久久精品国产自在天天线| a级毛片黄视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产男人的电影天堂91| 欧美3d第一页| av.在线天堂| 午夜免费鲁丝| av在线老鸭窝| 两性夫妻黄色片 | 国产精品久久久久久久久免| 精品熟女少妇av免费看| 午夜免费鲁丝| 久久狼人影院| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美日本中文国产一区发布| 久久久久久久精品精品| 久久亚洲国产成人精品v| 五月玫瑰六月丁香| 国产成人精品一,二区| 成人国语在线视频| 老熟女久久久| 黄片无遮挡物在线观看| 久久久久精品性色| 看十八女毛片水多多多| 一级a做视频免费观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 2022亚洲国产成人精品| 高清欧美精品videossex| 深夜精品福利| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲,欧美精品.| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 飞空精品影院首页| 亚洲精品自拍成人| 一本大道久久a久久精品| 在线天堂中文资源库| 欧美精品av麻豆av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 午夜av观看不卡| 精品国产国语对白av| a级片在线免费高清观看视频| 七月丁香在线播放| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品国产三级专区第一集| 国产老妇伦熟女老妇高清| 99精国产麻豆久久婷婷| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲精品一二三| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 欧美成人午夜免费资源| 国产 一区精品| 亚洲av综合色区一区| 大香蕉久久成人网| 在线免费观看不下载黄p国产| 寂寞人妻少妇视频99o| 大片免费播放器 马上看| 欧美日本中文国产一区发布| 男女国产视频网站| 少妇精品久久久久久久| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 韩国av在线不卡| 国产永久视频网站| 免费日韩欧美在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 黄片播放在线免费| 青春草视频在线免费观看| www.色视频.com| 男人舔女人的私密视频| 黄片无遮挡物在线观看| 51国产日韩欧美| 欧美精品一区二区大全| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 女性生殖器流出的白浆| 观看美女的网站| 国产伦理片在线播放av一区| 一级片'在线观看视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲精品456在线播放app| 免费高清在线观看视频在线观看| 99久国产av精品国产电影| 老司机影院毛片| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲国产日韩一区二区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产av一区二区精品久久| 国产男人的电影天堂91| 精品亚洲成国产av| 亚洲综合色惰| 亚洲国产精品国产精品| 精品一区二区免费观看| 新久久久久国产一级毛片| 人人妻人人澡人人看| 国产极品天堂在线| 欧美性感艳星| 午夜免费男女啪啪视频观看| 少妇人妻 视频| 亚洲国产色片| 永久免费av网站大全| 亚洲av免费高清在线观看| 免费观看在线日韩| 国产在视频线精品| 免费av不卡在线播放| 91精品伊人久久大香线蕉| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 日韩中字成人| 国产深夜福利视频在线观看| 成人国产麻豆网| 国产深夜福利视频在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 中文字幕制服av| 波多野结衣一区麻豆| 18禁动态无遮挡网站| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 丝袜喷水一区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产成人精品一,二区| 国产精品人妻久久久影院| 国产又爽黄色视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 久久99热6这里只有精品| 日本与韩国留学比较| 韩国高清视频一区二区三区| 两性夫妻黄色片 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 久久影院123| 国产探花极品一区二区| 日日爽夜夜爽网站| videosex国产| 嫩草影院入口| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 午夜91福利影院|