定量PCR檢測聯(lián)合G試驗及GM試驗對侵襲性真菌感染早期診斷的價值

尚元元 李可心 馬春梅 李莎莎 扈容英 楊文君

(1.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004)

侵襲性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)是真菌侵入人體組織、器官或血液，并進行生長和繁殖久之造成機體組織及器官損傷、功能障礙的真菌感染性疾病，常發(fā)生于ICU、呼吸科及燒傷科的重癥疾病中[1]。近年來，IFI呈逐年上升趨勢，由于不同真菌感染其潛伏期及發(fā)病狀態(tài)不同，早期易被基礎疾病掩蓋，加之IFI早期快速診斷方法尚未完善，常規(guī)組織病理取材及實施難度較大且有創(chuàng)，病原微生物培養(yǎng)周期較長，且敏感度易受培養(yǎng)環(huán)境等多方面的影響，易延誤病情，錯失最佳治療時間[2]。IFI病死率居高不下，尤其對免疫力低下患者的生命造成嚴重威脅，早診斷、早治療具有重要的臨床意義，探究具有高靈敏度和特異性的診斷檢測方法是IFI臨床研究的重點。目前，IFI的臨床診斷中以G試驗和GM試驗應用最為廣泛，具有早期診斷和判斷療效的作用，但臨床實踐[3]表明，G試驗及GM試驗結(jié)果中假陽性及假陰性無法規(guī)避，因此對其臨床應用有一定的限制。隨著分子生物學技術(shù)的進步，IFI早期診斷有了新的思路和方向，實時熒光定量(realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ-PCR)檢測具有較高的敏感性和特異性,可以克服現(xiàn)有診斷中的多種難題，為初步探討RTFQ-PCR檢測聯(lián)合G試驗及GM試驗對IFI早期診斷價值，筆者對寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院60例IFI高?；颊哌M行臨床分析，旨在為定量RTFQ-PCR應用于IFI的早期診斷提供客觀依據(jù)?，F(xiàn)匯報如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

納入2014年4月—2015年10月我院(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院)ICU、呼吸科及燒傷科等IFI高發(fā)科室中60例IFI高?；颊?，所有IFI高危患者均按照《重癥患者侵襲性真菌感染診斷與治療指南》(2007 版本)[4]進行診斷及治療。

1.2 診斷標準

參照歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組和美國國立變態(tài)反應和感染病研究院真菌病研究組(EORTC/MSG)共識組制訂的侵襲性真菌感染的修訂定義及中華醫(yī)學會重癥醫(yī)學分會制定的《重癥患者侵襲性真菌感染診斷與治療指南》[5]，制定的IFI診斷標準分為4種：確診、臨床診斷、擬診及排除IFI組，其中以確診、臨床診斷及擬診IFI組為陽性病例，排除IFI組作為陰性對照病例。

1.3 納入及排除標準

納入標準 ①IFI高?；颊撸虎卺t(yī)院倫理委員會知情同意批準者；③家屬及其委托代理人知情同意并自愿參與者；④自主配合且對研究相關步驟及項目無異議者；⑤基礎疾病病情穩(wěn)定無生命威脅者。

排除標準 ①不屬于納入標準條件范圍內(nèi)者；②入組前未進行相關針對性治療者；③入組前使用可能影響實驗結(jié)果的藥物或治療者；④病歷資料不全者；⑤中途退出或轉(zhuǎn)院者。

1.4 樣本采集

按RTFQ-PCR檢測、GM試驗和G試驗要求分別采取血清和肝素抗凝的血漿標本各2 mL，離心后取其血清保存在-80℃冰箱，以留備進一步試驗，實驗前將血清4℃解凍。同時對60例患者的痰、血、支氣管肺泡灌洗液等進行真菌培養(yǎng)及真菌涂片，真菌培養(yǎng)樣本于我院真菌和真菌病研究中心和臨床檢驗室根據(jù)形態(tài)、生理生化特性及分子生物學進行鑒定。

1.5 主要試劑與儀器

Platelia曲霉診斷試劑盒購自美國Bio-Rad公司，GKT25M Set 動態(tài)真菌檢測試劑盒購自北京金山川科技發(fā)展公司，QIAamp DNA Blood Mini Kit 試劑盒、引物和探針購自生工公司，白念珠菌核酸檢測試劑盒購自泰普生物科學有限公司，ABI7500熒光定量 RTFQ-PCR儀 (美國ABI公司)，MB-80微生物動態(tài)快速檢測系統(tǒng)(北京金山川公司)，T01- JSQ24-D12T01智能恒溫儀(美國DU PONT公司)， ELX808細菌內(nèi)毒素檢測儀(廈門鱟試劑生物科技股份有限公司)。

1.6 方法

真菌培養(yǎng) 根據(jù)標本種類的不同接種在不同培養(yǎng)基上，25℃、37℃培養(yǎng)，每24 h觀察1次結(jié)果，根據(jù)菌落生長的形態(tài)，生長特點及色素進行初級鑒別，如果生長為酵母菌的，進一步將酵母菌接種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上進行分離鑒定，不能顯色的酵母類及非酵母類真菌根據(jù)其鏡下菌絲、孢子特征或進一步小培養(yǎng)的生長特點進行鑒定，仍不能確定的采用全自動微生物分析儀(VITEK 2 COMPACT)進行鑒定。

RTFQ-PCR檢測 釆用定量RTFQ-PCR Taq Man探針法，以真菌高度保守的18S rRNA為目的基因，設計合成相應特異性引物和探針，上游引物:5＇-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3＇;下游引物:5＇-TCCTC-CGCTTATTGATATGC-3＇;TapMan探針:5＇-FAM-ATTGCTTGCG-GCGGTAACGTCC-TAMRA-3＇，探針特異性很高，可特異性的結(jié)合目的基因，陽性對照品為含目的基因質(zhì)粒，目的基因來自美國菌種保藏中心(ATCC)的原始菌株。反應程序為:37 ℃ 2 min;94 ℃ 2 min;94 ℃ 20 s，55 ℃ 45 s，10個循環(huán);94 ℃20 s，55 ℃ 45 s，30個循環(huán)。曲霉基因檢測試劑盒(RTFQ-PCR-熒光探針法)反應程序:95 ℃ 15 min; 94 ℃ 15 s，55 ℃45 s，40個循環(huán)。結(jié)果判讀：Ct值在15～35范圍內(nèi)為陽性標準，Ct 值超出35為陰性標準[6]。為防止實驗中出現(xiàn)假陽性結(jié)果，實驗中設立對照，分別是標準品系列，空白和陰性對照。同時收集患者的實驗室、組織病理、影像學及危險因素等臨床資料。將研究對象分為4個級別：確診、臨床診斷、擬診及排除IFI組，其中以確診、臨床診斷及擬診IFI組作為陽性病例，排除IFI組作為陰性對照病例。

G試驗檢測 IFI高?；颊?0例(同上述定量RTFQ-PCR檢測)的血清標本，采用GKT-1M動態(tài)真菌檢測試劑盒，混勻后3 000 r/min 離心1 min，取富含血小板血漿100 μL，取上清液200 μL，切勿有氣泡，立即插入檢測系統(tǒng)中，2～3 h即可出結(jié)果，檢測結(jié)果由MB-80微生物動態(tài)檢測系統(tǒng)自動計算出待測血清中BG濃度。操作嚴格按照試劑盒說明書進行。參照試劑盒說明書的標準范圍，BG試驗陽性定義為血清中BG濃度≥100.0 pg/mL[7]。

GM試驗檢測 IFI高?；颊?0例(同上述定量RTFQ-PCR檢測)的血清標本，采用曲霉菌抗原酶免試劑盒(96T)檢測，將于100℃水浴離心后的50 μL標本上清液與50 μL結(jié)合液加入含抗半乳甘露聚糖單克隆抗體EB-A2的微孔板，封板后 37℃孵育 90 min;加入顯色液后避光放置30 min；加入終止液后在自動定量酶標儀 450 nm/630 nm 處讀取吸光度值，參照美國FDA建議將閾值I大于0.5定義為陽性[8]。

1.7 統(tǒng)計學處理

應用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，評價RTFQ-PCR定量檢測、G及GM檢測的診斷價值并進行ROC曲線分析。評價3種診斷方法的相關性、一致性及聯(lián)合診斷的敏感性和特異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況

60例患者中男性42例，女性18例，年齡12～72(46.73±6.38)歲。IFI臨床診斷情況：共有38例診斷為院內(nèi)侵襲性真菌感染，其中確診3例，男女比例(2∶1)，臨床診斷27例，男女比例(7∶2)，擬診8例，男女比例(3∶5)，排除22例，男女比例(8∶3)。

2.2 檢測結(jié)果

真菌培養(yǎng)結(jié)果 38例診斷為院內(nèi)IFI的患者(包括確診、臨床診斷和擬診)，真菌培養(yǎng)陽性19例，標本來自于痰液，支氣管、肺泡灌洗液，血液，尿液、腹水、鼻竇抽取液、腸道黏膜及深部組織；每例標本均先行真菌直接涂片，后行真菌培養(yǎng)，2例深部組織同時行病理檢查。其中曲霉9例(4例為支氣管、肺泡灌洗液，其中有2例在痰液中也找到了真菌，3例為痰液，1例來自鼻竇抽取液，1例為支氣管鏡穿刺組織)，占47%；白念珠菌4例(1例為靜脈血，1例為尿液,1例為腹水， 1例為腎臟穿刺活檢組織)，占22%；熱帶念珠菌3例(1例為支氣管、肺泡灌洗液，1例為尿液，1例為腹水)，占16%；光滑念珠菌1例(標本為尿液)，占5%；季也蒙念珠菌1例(標本為腹水)，占5%；混合感染1例(包括念珠菌和曲霉，標本為痰液)，占5%。2例深部組織病理檢查，在組織病理切片中找到了真菌的菌絲和孢子。

G試驗、GM試驗、RTFQ-PCR檢測及聯(lián)合檢測檢出陽性率 結(jié)果顯示，G試驗IFI確診組、臨床診斷組、擬診組及排除組檢出陽性率分別為100%、70.37%、75.00%和54.55%；GM試驗IFI確診組、臨床診斷組、擬診組及排除組檢出陽性率分別為66.67%、70.37%、62.50%和45.45%；RTFQ-PCR檢測IFI確診組、臨床診斷組、擬診組及排除組檢出陽性率分別為100%、81.48%、87.50%和22.73%。結(jié)果見表1。

表1 G試驗、GM試驗及RTFQ-PCR檢測及聯(lián)合檢測檢出陽性率比較Tab.1 Comparison of positive rates of G test, GM test and RTFQ-PCR detection and combined detection

G試驗、GM試驗、RTFQ-PCR檢測及聯(lián)合檢測診斷IFI價值分析 以IFI確診、臨床診斷及疑診組合計38例為IFI真陽性，以排除組22例為真陰性，RTFQ-PCR+G+GM聯(lián)合檢測陽性以3種檢測結(jié)果均為陽性進行計數(shù)，經(jīng)過SPSS17.0統(tǒng)計分析顯示，G試驗、GM試驗、RTFQ-PCR檢測、RTFQ-PCR+G+GM聯(lián)合檢測敏感度、特異性、陽性預測、陰性預測值、符合度結(jié)果見表2。采用SPSS17.0進行 ROC曲線分析(見圖1)，結(jié)果顯示，G試驗、GM試驗及RTFQ-PCR檢測在診斷IFI中均具有較高的臨床價值(P均<0.05)(見表3)。

表2 G試驗、GM試驗、RTFQ-PCR檢測及聯(lián)合檢測診斷IFI價值分析Tab.2 G test, GM test, RTFQ-PCR test and combined detection of IFI

圖1 ROC曲線分析Fig.1 ROC curve analysis

表3 G試驗、GM試驗、RTFQ-PCR檢測診斷IFI臨床價值ROC曲線分析Tab.3 G test, GM test, RTFQ-PCR detection and diagnosis of IFI analysis

3 討 論

侵襲性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)是指真菌侵犯皮下組織、黏膜和內(nèi)臟所引起的真菌感染性疾病[9]。近年來，隨著廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑在臨床上的廣泛應用，器官移植及各種創(chuàng)傷性檢查和治療手段及導管技術(shù)的活躍開展，自身免疫性疾病、艾滋病、惡性腫瘤和糖尿病等基礎疾患及人口老齡化等因素，使免疫受損人群不斷增加，IFI發(fā)病率逐年上升[10]。據(jù)最新報道念珠菌感染已上升至院內(nèi)血源感染的第四位，死亡率第一位；曲霉已為第二位常見侵襲性真菌病，死亡率達60%～90%[11]，如此龐大的數(shù)字足以引起醫(yī)患重視。所以IFI的早期診斷對于臨床具有極其重要的臨床價值和意義。

近年來，IFI的血清學檢測取得了較大發(fā)展，目前己用于臨床快速早期診斷。血清學檢測包括真菌(1，3)-β- D葡聚糖(BG)檢測和半乳甘露聚糖(GM)檢測[12]。(1，3)-β-D葡聚糖是真菌細胞壁的組成成分，可用于診斷多種真菌感染，包括念珠菌，曲霉菌和鐮刀菌屬，但接合菌和隱球菌除外。當真菌進入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細胞的吞噬、消化等處理后，(1，3)-β-D葡聚糖可從胞壁中釋放出來，從而使血液及其他體液中(1，3)-β-D葡聚糖含量增高[13]。而且各項研究[14]顯示，(1，3)-β-D葡聚糖水平可隨病情而動態(tài)變化，對判斷病情和療效有一定意義。在黃耀光等[15]的相關研究中， G試驗在侵襲性肺部真菌感染(invasive pulmonary fungal infection，IPFI)患者診斷中， 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF) G試驗陽性率為77.31%，血漿G試驗陽性率為76.47%，均具有較高的靈敏度。張小華等[16]在對ICU中139例IPFI患者研究中指出，BALF G試驗診斷敏感性為80.00%，二者與本研究G試驗診斷IFI 81.58%的敏感度基本一致，此外張小華等在研究中還表示，BALF G試驗在IPFI診斷中具有20.00%的漏診率和9.09%的誤診率。而在本研究中G試驗診斷特異性較差，且假陽性率高達40.91%，與有關報道基本一致。本研究中GM試驗診斷IFI敏感度為76.32%，與陸書華等[17]研究基本一致，且較G試驗靈敏度稍差，但其特異性有所上升，且假陽性率有所降低，假陽性率為31.82%。由于二者在IFI診斷中敏感度均不是十分理想，故多個研究支持在實際的臨床操作中采用二者聯(lián)合檢測，相關報道[18]表示，二者聯(lián)合檢測其敏感度和特異性有效提高。筆者對此類文獻進行分析發(fā)現(xiàn)，二者聯(lián)合檢測多以二者結(jié)果其一或同時表現(xiàn)為陽性即為陽性標準，在此情況下可知其較高的假陽性率仍不可避免。

隨著分子生物學技術(shù)的不斷進步，IFI早期快速診斷有了新的思路和方向，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)及表型鑒定相比，分子診斷技術(shù)大大縮短了診斷所需時間，同時提高了敏感性和特異性，且操作簡便、易于重復[19]。RTFQ-PCR是近年來發(fā)展較為迅速，且廣泛應用于醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品安全等方面研究的分子生物學技術(shù)，在醫(yī)療診斷中具有以下優(yōu)點：①高度自動化，全封閉狀態(tài)下對擴增產(chǎn)物進行檢測，高效解決實驗中污染問題，避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果；②更強的特異性；③對初始基因精確定量，高度的敏感度；④與傳統(tǒng)的病理診斷和培養(yǎng)相比，RTFQ-PCR耗時短，發(fā)出實驗室檢查報告僅需2 h[20]。在實際的臨床診療中時效性具有重要的意義和作用，RTFQ-PCR完全滿足臨床診療需求，并且通過本研究發(fā)現(xiàn)，RTFQ-PCR檢測IFI在確診組、臨床診斷組、擬診組及排除組明顯提高了IFI臨床診斷敏感性和特異性。此外，本研究在聯(lián)合檢測中以RTFQ-PCR+G+GM三種檢測結(jié)果均為陽性進行計數(shù)，研究結(jié)果顯示，RTFQ-PCR+G+GM聯(lián)合檢測敏感度為55.26%，特異性95.45%，陽性預測值95.45%，陰性預測值55.26%，符合度為70.00%。由于聯(lián)合檢測陽性標準影響，聯(lián)合檢測在IFI中的診斷敏感性較低，在臨床實際操作過程中可能存在漏診情況，但RTFQ-PCR+G+GM聯(lián)合檢測完全改善了假陽性率高這一普遍問題，本研究中RTFQ-PCR+G+GM聯(lián)合檢測有效提高了IFI診斷的準確性。經(jīng)ROC曲線分析，G試驗、GM試驗、RTFQ-PCR檢測在IFI診斷中均具有較高的臨床應用價值，RTFQ-PCR檢測(AUC=0.790)優(yōu)于G試驗(AUC=0.718)和GM試驗(AUC=0.735)。

綜上所述，G試驗、GM試驗、RTFQ-PCR檢測在IFI診斷中均具有較高的臨床應用價值，但G試驗、GM試驗在IFI診斷中假陽性率較高，故在單種方式檢測中推薦RTFQ-PCR檢測，而RTFQ-PCR+G+GM聯(lián)合檢測則能夠明顯提高IFI臨床診斷準確性。