MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)絲狀真菌臨床分離株鑒定能力的評(píng)估

李穎 黃晶晶 劉文靜 王培昌 徐英春

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053； 2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730；3. 侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

近年來(lái)，曲霉、鐮刀菌、接合菌等絲狀真菌的臨床感染率有升高趨勢(shì)，在某些特定人群中其感染率甚至超過(guò)酵母菌[1-3]。絲狀真菌種類(lèi)繁多，不同種屬菌株對(duì)常用抗真菌藥物的反應(yīng)多有差別，如土曲霉和尖端賽多孢霉對(duì)兩性霉素B天然耐藥；鐮刀菌對(duì)棘白菌素類(lèi)抗真菌藥物不敏感，對(duì)多數(shù)新型唑類(lèi)藥物僅中度敏感；接合菌除對(duì)棘白菌素天然耐藥外，另有部分菌種對(duì)唑類(lèi)藥物耐藥[4-6]。所以，對(duì)絲狀真菌進(jìn)行準(zhǔn)確種屬鑒定可以有針對(duì)性地指導(dǎo)臨床選用抗真菌藥物，減少無(wú)效或錯(cuò)誤用藥。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)作為微生物快速鑒定分析技術(shù)已被成功應(yīng)用于臨床細(xì)菌及酵母菌菌種鑒定；但在絲狀真菌鑒定方面，其應(yīng)用程度及鑒定能力略遜。除絲狀真菌本身細(xì)胞壁厚這一客觀因素外，現(xiàn)有的商業(yè)絲狀真菌質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋菌種數(shù)不足也是重要原因之一[7-8]。相應(yīng)地，國(guó)際上多個(gè)研究機(jī)構(gòu)分別致力于建立本地絲狀真菌質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)，其中規(guī)模較大的有Lau AF等研究人員建立的美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)絲狀真菌數(shù)據(jù)庫(kù)和法國(guó)與比利時(shí)學(xué)者聯(lián)合建立的大型真菌質(zhì)譜鑒定(mass spectrometry identification，MSI)平臺(tái)，通過(guò)自建數(shù)據(jù)庫(kù)可以有效提升MALDI-TOF MS對(duì)絲狀真菌的鑒定效率[9-12]。2019年由國(guó)內(nèi)多位專(zhuān)家共同編撰的《自建MALDI-TOF MS微生物鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)專(zhuān)家共識(shí)》對(duì)自建數(shù)據(jù)庫(kù)的操作流程及注意事項(xiàng)等方面進(jìn)行了明確規(guī)范與建議[13]。本研究參照該共識(shí)建立適當(dāng)規(guī)模的MALDI-TOF MS絲狀真菌鑒定本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，擬提高實(shí)驗(yàn)室對(duì)絲狀真菌分離株的鑒定能力。

1 材料與方法

1.1 菌株

建庫(kù)菌株 整理北京協(xié)和醫(yī)院2014年1月—2016年12月分離自臨床患者送檢標(biāo)本的絲狀真菌，選取具有代表性的菌種，每一種屬菌株數(shù)≥1株。建庫(kù)菌株均采用分子測(cè)序技術(shù)準(zhǔn)確鑒定到種水平，其中曲霉采用鈣調(diào)蛋白(CaM)基因測(cè)序，鐮刀菌采用轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子1α(EF-1α)基因測(cè)序，接合菌等余下菌種采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)測(cè)序[14-15]。

評(píng)估菌株 收集北京協(xié)和醫(yī)院2016年1月—2017年6月分離自臨床患者送檢標(biāo)本的絲狀真菌。評(píng)估菌株在復(fù)蘇傳代后均經(jīng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定初步確定種屬信息。

1.2 試劑材料

Bruker Biotyper AutoflexTMMALDI-TOF MS系統(tǒng)、α-氰基-4-對(duì)羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)基質(zhì)液、BTS標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自德國(guó)Bruker Doltanics公司。甲酸和三氟乙酸溶液均購(gòu)自法國(guó)Sigma-Aldrich公司。乙腈溶液購(gòu)自比利時(shí)ACROS Organics公司。真菌用沙堡弱葡萄糖瓊脂(Sabouraud dextrose agar，SDA)培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，絲狀真菌基因組DNA 提取采用德國(guó)QIAGEN DNA mini試劑盒。

1.3 Bruker Biotyper自建數(shù)據(jù)庫(kù)

自建數(shù)據(jù)庫(kù)流程按照Bruker Biotyper用戶(hù)手冊(cè)進(jìn)行：①擬建庫(kù)菌株的純培養(yǎng)；將基因測(cè)序鑒定明確的絲狀真菌菌種以3點(diǎn)式接種SDA平皿置于28℃溫箱進(jìn)行傳代培養(yǎng)。②質(zhì)譜分析前處理；參照《自建MALDI-TOF MS微生物鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)專(zhuān)家共識(shí)》建議，分別取培養(yǎng)第2～3天的較幼稚菌落和培養(yǎng)至第5～7天較成熟菌落進(jìn)行建庫(kù)操作，具體流程為采用標(biāo)準(zhǔn)甲酸-乙腈提取法對(duì)適量菌絲進(jìn)行前處理，包括75%酒精滅活菌體，甲酸溶液裂解菌體細(xì)胞壁，乙腈溶液促進(jìn)核糖體蛋白釋出，吸取1 μL上清點(diǎn)樣于Bruker MSP 384靶板，干燥后再滴加1 μL HCCA基質(zhì)液，每一建庫(kù)菌株平行點(diǎn)樣8次，共8個(gè)待分析靶點(diǎn)。③自建數(shù)據(jù)庫(kù)質(zhì)譜圖獲??；按照用戶(hù)手冊(cè)對(duì)Bruker MS儀器進(jìn)行日常校準(zhǔn)。每個(gè)靶點(diǎn)采集3張高質(zhì)量質(zhì)譜圖，每一建庫(kù)菌株共采集24張質(zhì)譜圖。采用Bruker Flex Analysis軟件對(duì)24張質(zhì)譜圖進(jìn)行篩選，除去質(zhì)量較差的譜圖，同時(shí)保證余下高質(zhì)量質(zhì)譜圖>20張；若無(wú)法滿(mǎn)足此條件應(yīng)重復(fù)進(jìn)行建庫(kù)質(zhì)譜圖獲取。④建立數(shù)據(jù)庫(kù)；將>20張高質(zhì)量質(zhì)譜圖在Bruker Biotyper軟件中整合成一張代表性參考質(zhì)譜圖，對(duì)該參考質(zhì)譜圖進(jìn)行菌種信息命名并保存。

1.4 Bruker Biotyper自建數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定能力的評(píng)估

采用臨床絲狀真菌分離株對(duì)該MALDI-TOF MS自建庫(kù)的鑒定能力進(jìn)行評(píng)估，操作流程同標(biāo)準(zhǔn)提取法MALDI-TOF MS鑒定。數(shù)據(jù)庫(kù)分別選用Bruker商業(yè)絲狀真菌數(shù)據(jù)庫(kù)(Bruker Filamentous fungi Library 1.0)、本地自建數(shù)據(jù)庫(kù)(In-house database)和二者聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)(Combined database)，根據(jù)鑒定率差異來(lái)評(píng)估最優(yōu)數(shù)據(jù)庫(kù)模式。MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為：鑒定分值≥2.000，種水平鑒定正確；鑒定分值1.700～1.999，僅屬水平鑒定正確；鑒定分值<1.700則為無(wú)法鑒定。對(duì)于曲霉評(píng)估菌株，MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致即認(rèn)為鑒定準(zhǔn)確，對(duì)于鑒定結(jié)果不一致(包括一種方法鑒定至屬水平而另一種方法鑒定至種水平或兩種方法均鑒定至屬水平)的菌株則進(jìn)一步采用CaM基因測(cè)序鑒定；對(duì)于非曲霉絲狀真菌，無(wú)論MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致與否均采用ITS或EF-1α基因測(cè)序明確菌株種屬信息。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件；本研究數(shù)據(jù)類(lèi)型為多項(xiàng)有序分類(lèi)變量，多樣本比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，兩樣本間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[16]。

2 結(jié) 果

2.1 MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)概況

建庫(kù)菌株41株，其中曲霉22株，12種；鐮刀菌3株，2種；接合菌7株，5種；其他菌株9株分屬于6個(gè)不同種(見(jiàn)表1)。對(duì)每一建庫(kù)菌株分別取SDA培養(yǎng)2～3 d(幼稚)和5～7 d(成熟)菌落進(jìn)行自建庫(kù)處理，共得到參考質(zhì)譜圖82張。

表1 Bruker MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)菌株列表Tab.1 Lists of strains with mass spectra profiles in the MALDI-TOF MS in-house database

2.2 MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定能力評(píng)估

評(píng)估用絲狀真菌臨床分離株236株，其中曲霉200株，非曲霉絲狀真菌36株。按照Bruker推薦的鑒定結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，Bruker商業(yè)絲狀真菌數(shù)據(jù)庫(kù)(簡(jiǎn)稱(chēng)Bruker Library)僅可將29.2% (69/236) 評(píng)估菌株鑒定至種水平，47.9% (113/236) 菌株鑒定至屬水平，22.9% (54/236) 菌株因鑒定分值<1.700而無(wú)法鑒定。采用本研究自建數(shù)據(jù)庫(kù)，67.5% (159/236) 受試菌株因其鑒定分值≥2.000可實(shí)現(xiàn)種水平鑒定，另有19.9% (47/236) 菌株可實(shí)現(xiàn)屬水平鑒定。將Bruker Library與本研究自建數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合后，76.3% (180/236) 受試菌株可實(shí)現(xiàn)種水平鑒定，19.1% (45/236) 菌株可實(shí)現(xiàn)屬水平鑒定，僅4.6% (11/236) 菌株無(wú)法鑒定(見(jiàn)表2)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3種數(shù)據(jù)庫(kù)模式間對(duì)評(píng)估菌株的鑒定能力存在顯著性差異(χ2=116.447，P<0.001)；除Bruker Library鑒定能力顯著低于自建數(shù)據(jù)庫(kù)和聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)外，聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定能力要優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用自建數(shù)據(jù)庫(kù)(Z=-2.478，P=0.013)。本研究中，Bruker Library在受試菌株種水平鑒定結(jié)果存在1個(gè)錯(cuò)誤鑒定情況(1株塔賓曲霉被錯(cuò)誤鑒定為黑曲霉，鑒定分值2.041)；應(yīng)用自建數(shù)據(jù)庫(kù)，在提高了受試菌株種水平鑒定率的同時(shí)并未導(dǎo)致種水平錯(cuò)誤鑒定情況發(fā)生；將Bruker Library和自建數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合應(yīng)用后，種水平鑒定率為三者間最高且仍保持良好的種水平鑒定準(zhǔn)確率。

表2 MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)絲狀真菌臨床分離株鑒定能力的評(píng)估Tab.2 Evaluation of the MALDI-TOF MS in-house database in identification of clinical filamentous fungi isolates n(%)

2.3 絲狀真菌形態(tài)學(xué)鑒定與MALDI-TOF MS鑒定能力比較

以聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)為Bruker MALDI-TOF MS鑒定用數(shù)據(jù)庫(kù)，將評(píng)估菌株MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，形態(tài)學(xué)方法將81.4% (192/236) 菌株鑒定到種水平，其中有4.2% (8/192) 菌株在種水平鑒定錯(cuò)誤，故形態(tài)學(xué)方法對(duì)受試絲狀真菌的種水平鑒定準(zhǔn)確率為95.8% (184/192)。MALDI-TOF MS聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)受試絲狀真菌的種水平鑒定率為76.3% (180/236)，略低于形態(tài)學(xué)方法，但不存在種水平鑒定錯(cuò)誤的情況，即種水平鑒定準(zhǔn)確率為100%。進(jìn)一步分析，對(duì)于臨床常見(jiàn)曲霉分離株，MALDI-TOF MS較形態(tài)學(xué)方法并未展現(xiàn)出鑒定優(yōu)勢(shì)[80.7% (175/181)vs.96.7% (146/181)]；對(duì)于少見(jiàn)曲霉種和非曲霉絲狀真菌，MALDI-TOF MS的鑒定能力顯著優(yōu)于形態(tài)學(xué)方法，鑒定準(zhǔn)確率更高[16.4% (9/55)vs.61.8% (34/55)，Z=-3.110，P=0.002]。(見(jiàn)表3)。

表3 形態(tài)學(xué)方法與MALDI-TOF MS聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)絲狀真菌鑒定能力的比較Tab.3 Comparison of the performance of morphological method and MALDI-TOF MS with the combined database in identification of filamentous fungi isolates n(%)

3 討 論

數(shù)據(jù)庫(kù)的完備與更新是保障MALDI-TOF MS實(shí)現(xiàn)病原微生物準(zhǔn)確鑒定的重要前提。對(duì)于絲狀真菌，明確菌株種屬信息有助于區(qū)分潛在致病菌及污染菌。本研究將41株具有臨床代表性的絲狀真菌進(jìn)行MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)，顯著提升實(shí)驗(yàn)室對(duì)絲狀真菌分離株的鑒定能力。

Bruker MALDI-TOF MS商業(yè)絲狀真菌數(shù)據(jù)庫(kù)中包含127種絲狀真菌參考質(zhì)譜圖，但其菌種涵蓋范圍與臨床絲狀真菌分離譜存在一定偏差。用于本研究MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)的41株25種絲狀真菌中有9株5種在Bruker商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)中缺乏參考質(zhì)譜圖。另一方面，Bruker商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)采用絲狀真菌液體培養(yǎng)法生長(zhǎng)的菌絲進(jìn)行建庫(kù)，對(duì)待鑒定菌株建議進(jìn)行20 h液體培養(yǎng)，或在絲狀真菌固體培養(yǎng)菌落較幼稚時(shí)進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定；菌落成熟后其質(zhì)譜圖較幼稚菌落時(shí)存在差異性特征峰，導(dǎo)致此時(shí)Bruker商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定效果稍遜[17-18]，這與國(guó)內(nèi)大多數(shù)微生物實(shí)驗(yàn)室絲狀真菌培養(yǎng)鑒定流程不相符。本研究參照《自建MALDI-TOF MS微生物鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)專(zhuān)家共識(shí)》，對(duì)固體培養(yǎng)法絲狀真菌幼稚菌落和成熟菌落分別進(jìn)行MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)處理，得到的參考質(zhì)譜圖可以基本滿(mǎn)足常規(guī)工作中絲狀真菌鑒定需求。采用236株絲狀真菌臨床分離株對(duì)該自建數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行性能評(píng)估，自建數(shù)據(jù)庫(kù)以及自建庫(kù)聯(lián)合Bruker商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定能力均優(yōu)于Bruker商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)，其中以聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定能力最為出色，種水平鑒定率76.3%(180/236)，另有19.1%(45/236)菌株可實(shí)現(xiàn)屬水平鑒定，僅4.6%(11/236)菌株無(wú)法鑒定。對(duì)于聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)下45株僅實(shí)現(xiàn)屬水平鑒定的菌株，經(jīng)與基因測(cè)序鑒定結(jié)果比對(duì)，有44株MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果在種、屬水平均正確但鑒定分值介于1.700～1.999之間，如何將這一部分菌株的MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果提升至種水平鑒定范疇值得后續(xù)進(jìn)一步探討。Sleiman等[19]研究表明，下調(diào)種水平鑒定截?cái)嘀抵痢?.800可顯著提高Bruker商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)絲狀真菌的鑒定能力，但對(duì)自建數(shù)據(jù)庫(kù)以及聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定能力影響較??；更新數(shù)據(jù)庫(kù)參考質(zhì)譜圖較下調(diào)種水平鑒定截?cái)嘀蹈苡行岣進(jìn)ALDI-TOF MS對(duì)絲狀真菌的鑒定能力。

形態(tài)學(xué)方法因其操作簡(jiǎn)便、低成本等特點(diǎn)在絲狀真菌菌種鑒定方面仍占有重要地位，特別是對(duì)于臨床常見(jiàn)的具有特征性結(jié)構(gòu)的絲狀真菌，如煙曲霉、構(gòu)巢曲霉等，形態(tài)學(xué)方法多能實(shí)現(xiàn)種水平鑒定。但是對(duì)于少見(jiàn)或缺乏特征性結(jié)構(gòu)的絲狀真菌，亦或因患者接受抗真菌藥物治療致使分離菌株形態(tài)發(fā)生變異，此時(shí)形態(tài)學(xué)方法易出現(xiàn)無(wú)法鑒定或錯(cuò)誤鑒定的情況，需要借助基因測(cè)序技術(shù)或MALDI-TOF MS鑒定菌株信息。本研究中，55株曲霉少見(jiàn)種和非曲霉絲狀真菌經(jīng)形態(tài)學(xué)方法有30.9%(17/55)菌株鑒定至種水平，但種水平鑒定錯(cuò)誤率較高(47.1%，8/17)。采用MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)，61.8%(34/55)菌株可實(shí)現(xiàn)種水平鑒定且無(wú)錯(cuò)誤鑒定情況，種水平鑒定率及準(zhǔn)確率均顯著高于形態(tài)學(xué)方法。此外，MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)在絲狀真菌菌種鑒定的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)和檢測(cè)成本上也具有一定優(yōu)勢(shì)，特別是建立包含菌株不同生長(zhǎng)階段的參考質(zhì)譜圖，可以對(duì)不同時(shí)段的臨床分離菌株進(jìn)行鑒定；自建數(shù)據(jù)庫(kù)的檢測(cè)能力雖不及基因測(cè)序技術(shù)，但檢測(cè)成本及可操作性要優(yōu)于基因測(cè)序技術(shù)，適合在臨床常規(guī)工作中開(kāi)展。

綜上，MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)有助于提高實(shí)驗(yàn)室絲狀真菌鑒定能力，特別是對(duì)于形態(tài)學(xué)方法鑒定困難的少見(jiàn)絲狀真菌。對(duì)自建數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行不斷完善和菌種擴(kuò)充是保證該技術(shù)滿(mǎn)足臨床菌種鑒定需求的重要助力。