乙型肝炎病毒促進(jìn)肝細(xì)胞PD-L1 蛋白表達(dá)機(jī)理

朱海珍，荀圳，鄧日林，田仁云，郭萌萌，陳生穩(wěn)，劉倩，郭艷霞

（1.湖南大學(xué) 生物學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410082；2.湖南大學(xué) 病原生物學(xué)與免疫學(xué)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410082；3.湖南大學(xué) 醫(yī)學(xué)病毒學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410082）

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一種小的嗜肝DNA 病毒，是導(dǎo)致慢性肝病的主要原因，可導(dǎo)致病毒性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌（Hepatic cell carcinoma，HCC）.據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約有2.5 億人長(zhǎng)期感染HBV，并有發(fā)展為肝硬化甚至肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[1].病毒和宿主因素都對(duì)慢性HBV 感染的結(jié)果有影響，與其他病原體一樣，HBV 形成了逃避宿主的免疫防御策略，例如高比率的基因突變率和免疫調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá).

軸抑制蛋白Axin 是Wnt/β-catenin 信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過蛋白酶體降解途徑調(diào)節(jié)β-catenin 蛋白水平，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2-4].然而，Axin 在HBV 感染過程中的作用尚不清楚.

PD-L1 是一種免疫檢查點(diǎn)分子，調(diào)節(jié)Ⅰ型T 輔助細(xì)胞（Th1）免疫反應(yīng)，介導(dǎo)癌癥免疫逃避.它可以在腫瘤細(xì)胞（TC）和腫瘤浸潤(rùn)性的免疫細(xì)胞（IC）上進(jìn)行表達(dá)[5].近幾年，抗PD-L1 治療手段在人類癌癥的免疫治療中占據(jù)了中心地位[6-8].然而，PD-L1 在HBV感染中的作用及其機(jī)理仍有待闡明.

泛素蛋白酶體降解途徑是目前已知的所有真核生物體內(nèi)具有高度選擇性且最為重要的蛋白質(zhì)降解途徑.真核細(xì)胞內(nèi)泛素化修飾后的靶蛋白能被降解或者被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的特定部位.靶蛋白的泛素化修飾需要E3 泛素連接酶的參與，E3 泛素連接酶通過調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白的泛素化過程參與細(xì)胞內(nèi)的多種生理過程[9].經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，HBV 感染可對(duì)細(xì)胞內(nèi)多種生命活動(dòng)產(chǎn)生影響，如影響轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促使Caspase 剪切從而促使細(xì)胞凋亡等.然而，HBV是否能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)一些E3 連接酶的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)泛素蛋白酶體途徑尚不清楚.

本文從轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平以及翻譯后的修飾水平對(duì)Axin 和PD-L1 的關(guān)系進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)Axin 可能通過調(diào)節(jié)PD-L1 的E3 連接酶的表達(dá)，調(diào)控PD-L1 的翻譯后修飾；同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)Axin 能夠逆轉(zhuǎn)HBV 引起的PD-L1 上調(diào)現(xiàn)象.本研究為HBV 免疫逃逸機(jī)理提供參考和依據(jù).

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

Huh7 細(xì)胞為美國(guó)耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉晨教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；BGC-823 購自Boster 公司；HEK293T 購自美國(guó)ATCC；HLCZ01 細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室從臨床病人肝組織中分離培養(yǎng)得到[10].

1.2 試 劑

高糖（DMEM）培養(yǎng)基和DMEM/F-12 培養(yǎng)基（Invitrogen 公司），1×PBS（Hyclone 公司），0.25%胰蛋白酶（Invitrogen 公司），細(xì)胞RNA 收取Trizol 試劑（Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Accurate Biology 公司），SYBR Green 定量試劑盒（Accurate Biology 公司），蛋白酶抑制劑片劑（Merck 公司），細(xì)胞蛋白收取RIPA 裂解液（Thermo 公司），Axin 抗體（CST 公司），PD-L1 抗體（Proteintech 公司），F(xiàn)lag 抗體（Sigma-Aldrich 公司），V5 抗體（Invitrogen 公司），β-actin 抗體（Sigma-Aldrich 公司）.

60 mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿（Biologix 公司），十二孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Biologix 公司），10 cm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿（Biologix 公司），1.5 mL 的離心管（Axygen 公司），200 μL PCR 八聯(lián)管（Axygen 公司），0.22 μm 和0.45 μm 的PVDF 膜（Merck Millipore 公司）.

1.3 儀器設(shè)備

4 ℃冰箱（中科美菱公司），-20 ℃冰箱（Haier 公司），-80 ℃超低溫冰箱（Thermo 公司），CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司），生物安全柜（Airtech 公司），凝膠核酸成像（上海天能公司），蛋白核酸曝光成像儀器（Bio-rad 公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Beckman 公司），光學(xué)顯微鏡（Olympus 公司），細(xì)胞液氮凍存罐（Thermo 公司），分析天平（上海天平儀器廠），Nanodrop2000（Thermo 公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（湖南達(dá)爾儀器有限公司），普通PCR 儀（Eppendorf 公司），制冷高速離心機(jī)（Eppendorf 公司）.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 HBV 感染方法

用于實(shí)驗(yàn)感染細(xì)胞的HBV 來自HepG2.2.15 細(xì)胞上清（D 型）.在培養(yǎng)HepG2.2.15 細(xì)胞時(shí)，在培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為500 μg/mL 的新霉素（G418）來維持HBV 基因組的復(fù)制水平.當(dāng)HepG2.2.15 細(xì)胞開始產(chǎn)生病毒時(shí)，用不加G418 的培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2.2.15 細(xì)胞，一邊擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞一邊收集細(xì)胞上清，收集的細(xì)胞上清用0.45 μm 微孔過濾器過濾，使病毒得以富集，最后測(cè)定病毒滴度.HBV 按照MOI為20 接種于HLCZ01 細(xì)胞，病毒與細(xì)胞孵育過夜后，去除培養(yǎng)上清，用磷酸鹽緩沖鹽水（Phosphate Buffered Saline，PBS）洗滌3 次，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn).

1.4.2 過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

為了構(gòu)建Axin、PD-L1、SPOP、Cbl 和HBX 的過表達(dá)質(zhì)粒，首先利用Primer Primer5 設(shè)計(jì)PCR 引物，然后從Huh7 細(xì)胞中提取總RNA，利用其逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板來擴(kuò)增Axin、PD-L1、SPOP、Cbl 基因；同時(shí)從HBV 感染的HLCZ01 細(xì)胞內(nèi)提取細(xì)胞總RNA 來擴(kuò)增HBX 基因.通過膠回收純化PCR 產(chǎn)物，最后利用TA 克隆方法將擴(kuò)增得到的DNA 片段連入p3×Flag-CMV 和pCDNA3.1a 載體中，從而得到重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV-Axin、p3×Flag-CMV-PD-L1、p3×Flag-CMV-HBx、pCDNA3.1a-PD-L1、pCDNA3.1a-SPOP、pCDNA3.1a-Cbl，通過測(cè)序鑒定目的基因序列是否完全正確.PCR 引物序列如表1 所示.

表1 質(zhì)?？寺∫颰ab.1 Primers used for plasmid construction

1.4.3 Western blot 實(shí)驗(yàn)

用含有蛋白酶抑制劑的RIPA Buffer 裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30 min，13 200 r/min 離心15 min 后收集蛋白.根據(jù)試劑說明書的使用方法，用BCA（Bicinchoninic Acid）試劑法測(cè)定蛋白濃度.取20 μg蛋白樣品與2×Load Buffer 等體積混合，在100 ℃金屬浴中煮沸5 min 之后上樣，采用80 V 恒壓跑膠，待蛋白Mark 分層后調(diào)至120 V 恒壓跑膠，根據(jù)Mark顯示的位置，待目的蛋白到達(dá)合適位置后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜.100 V 恒壓轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)膜成功后，以5%的脫脂牛奶封閉1 h，之后加入對(duì)應(yīng)一抗4 ℃過夜孵育，二抗選用anti-mouse 或anti-rabbit 抗體室溫孵育2～4 h.將PVDF 膜置于化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)儀上，加入預(yù)先配制好的顯影液曝光1～5 min，并保存蛋白印跡圖片.

1.4.4 Real-time PCR 實(shí)驗(yàn)

使用Trizol 試劑裂解細(xì)胞，采用氯仿抽提的方法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用相對(duì)應(yīng)的定量引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析，探究目的基因在RNA 水平的表達(dá)情況，所用方法參照試劑盒說明書操作.Real-time PCR 反應(yīng)所用引物序列如表2 所示.

表2 Real-time PCR 反應(yīng)所用引物序列Tab.2 Primer sequences used in real-time PCR reactions

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均錄入Excel 文檔中保存，對(duì)照組數(shù)據(jù)和處理組數(shù)據(jù)之間顯著性差異分析采用學(xué)生雙尾t 值分析方法.用*P＜0.05、**P＜0.01 和***P＜0.001 來表示顯著性差異程度，其中P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.數(shù)據(jù)以means±SD 形式在圖表中顯示.

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1 HBV 感染抑制Axin 的表達(dá)和促進(jìn)PD-L1 的表達(dá)

Axin 在WNT 信號(hào)通路中起重要的調(diào)控作用[11]，為了檢測(cè)Axin 在HBV 調(diào)節(jié)抗病毒免疫過程中的作用，本文檢測(cè)了HLCZ01 細(xì)胞和HBV 感染的HLCZ01 細(xì)胞內(nèi)Axin 和PD-L1 的表達(dá)，以探討Axin在HBV 感染過程中的潛在作用.利用實(shí)時(shí)熒光定量（Real-time PCR）方法，以MOI 為20 的HBV 感染HLCZ01 細(xì)胞45 d，提取細(xì)胞總RNA 和細(xì)胞總蛋白.利用Real-time PCR 方法，以未被HBV 感染的HLCZ01 細(xì)胞為對(duì)照，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin 和PD-L1 的mRNA 水平，發(fā)現(xiàn)HBV 感染后不影響Axin 和PDL1 的轉(zhuǎn)錄水平（圖1（a））.利用Western Blot 方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin 和PD-L1 的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)HBV 感染后抑制Axin 蛋白的表達(dá)但促進(jìn)PD-L1 蛋白的表達(dá)（圖1（b））.為進(jìn)一步驗(yàn)證這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)HBV 的1.3 倍復(fù)制子的質(zhì)粒，24 h以后提取細(xì)胞總RNA 和細(xì)胞總蛋白.利用Realtime PCR 方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin 和PD-L1 的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)HBV 的1.3 倍復(fù)制子抑制Axin 的轉(zhuǎn)錄但不影響PD-L1 的轉(zhuǎn)錄（圖1（c））.借助Western Blot方法，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了HBV 的1.3 倍復(fù)制子質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞內(nèi)的Axin 蛋白水平明顯下調(diào)，而PD-L1 的蛋白水平明顯上調(diào)（圖1（d））.在Huh7 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-HBx，48 h 后收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin 和PD-L1 的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了HBx 質(zhì)粒的Huh7 細(xì)胞內(nèi)Axin 的蛋白水平下降，而PD-L1的蛋白水平升高（圖1（e））.基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)HBV 導(dǎo)致Axin 和PD-L1 蛋白水平發(fā)生變化可能是通過HBx 實(shí)現(xiàn)的.此外，以MOI 為20 的HBV 感染HLCZ01 細(xì)胞45 d，然后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMVvector 或p3×Flag-CMV-Axin（1 μg 或2 μg），48 h 后收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin 過表達(dá)情況和PD-L1 蛋白水平，研究發(fā)現(xiàn)在HBV 感染的HLCZ01 細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)Axin 質(zhì)粒，能夠逆轉(zhuǎn)HBV 感染引起的PD-L1 蛋白水平降低現(xiàn)象（圖1（f））.由圖1 可知，在HBV 感染肝細(xì)胞內(nèi)，Axin蛋白水平與PDL1 蛋白水平呈負(fù)相關(guān)性.

圖1 HBV 感染抑制Axin 的表達(dá)和促進(jìn)PD-L1 的表達(dá)Fig.1 HBV infection inhibits Axin expression and promotes PD-L1 expression

2.2 Axin 通過泛素化蛋白酶體途徑降解PD-L1蛋白

為了進(jìn)一步明確Axin 與PD-L1 之間的關(guān)系，在Huh7 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin，48 h 后收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin 和PD-L1 蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Axin 可降低細(xì)胞內(nèi)PD-L1 蛋白水平（圖2（a））.在Huh7 和HEK293T 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin，48 h 后收取細(xì)胞總RNA，利用Real-time PCR 方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin 和PD-L1 的mRNA 水平，發(fā)現(xiàn)在Huh7 和293T 細(xì)胞中過表達(dá)Axin 對(duì)PD-L1 的轉(zhuǎn)錄水平并無明顯影響（圖2（b））.利用從湖南省腫瘤醫(yī)院收集48例肝癌病人癌旁組織樣本，提取組織總RNA，利用Real-time PCR 方法，檢測(cè)組織內(nèi)Axin 和PD-L1 的mRNA 水平，并通過SPSS 軟件分析Axin 與PD-L1之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它們的mRNA 并無相關(guān)性（圖2（c））.在Huh7 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMVvector 或p3×Flag-CMV-Axin，48 h 后加入放線菌酮素（100 μg/mL CHX 終濃度），15 min 和30 min 后分別收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin 過表達(dá)情況和PD-L1 蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Axin 對(duì)PD-L1 的翻譯水平?jīng)]有影響（圖2（d））.最后，對(duì)其翻譯后修飾水平進(jìn)行探究.在Huh7 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin，48 h 后分別加溶酶體降解途徑抑制劑（NH4Cl）[12]和蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132），處理6 h 后收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin過表達(dá)情況和PD-L1 的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Axin 可能通過影響PD-L1 的蛋白酶體降解發(fā)揮作用（圖2（e））.另外，在HEK293T 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMVvector 或p3×Flag-CMV-Axin 和pCDNA3.1a-PDL1，48 h 后加蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132），處理6 h 后收取細(xì)胞總蛋白，以V5 抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PD-L1 的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)Axin能促進(jìn)PD-L1 的泛素化（圖2（f）（g））.在Huh7 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin（1 μg 或者2 μg）48 h 后，在收取蛋白前6 h，加入蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132）培養(yǎng)細(xì)胞，收取的細(xì)胞總蛋白以PD-L1 抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PD-L1 的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)Axin 對(duì)PD-L1 的泛素化呈劑量依賴性.基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為Axin 可能通過蛋白酶體途徑降解PD-L1 蛋白.

圖2 Axin 通過泛素化蛋白酶體途徑降解PD-L1 蛋白Fig.2 Axin degrades PD-L1 protein through ubiquitin proteasome pathway

2.3 Axin 通過影響E3 連接酶SPOP 的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控PD-L1 的蛋白酶體降解

蛋白與蛋白質(zhì)之間的相互作用可能是通過直接或間接方式進(jìn)行的.為明確Axin 對(duì)PD-L1 蛋白的調(diào)控方式，首先，在HEK293T 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染帶Flag 標(biāo)簽的Axin 和帶V5 標(biāo)簽的PD-L1，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)Axin 與PD-L1 不存在直接相互作用（圖3（a））.間接調(diào)節(jié)PD-L1 的泛素化作用可能通過兩種方式，一種是調(diào)節(jié)其去泛素化酶的表達(dá)，另外一種是調(diào)節(jié)其泛素化酶的表達(dá).NF-kb 信號(hào)通路活化后，可增強(qiáng)PD-L1 去泛素化酶的表達(dá)[13].將質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin 轉(zhuǎn)染至Huh7 細(xì)胞，48 h 后分別收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法，發(fā)現(xiàn)Axin對(duì)NF-kb 信號(hào)通路的活化無作用（圖3（b））.有文獻(xiàn)報(bào)道E3 連接酶Cbl 和SPOP 可泛素化降解PDL1[14-18].將質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin 轉(zhuǎn)染至Huh7 細(xì)胞，48 h 后收取細(xì)胞總RNA，利用Real-time PCR 方法，檢測(cè)Axin 對(duì)PD-L1的E3 連接酶Cbl 和SPOP 的mRNA 水平的影響，發(fā)現(xiàn)Axin 對(duì)這兩種E3 連接酶的mRNA 水平并無影響（圖3（c））.另外，將質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin（1 μg 或者2 μg）和pCDNA3.1a-Cbl或者pCDNA3.1a-SPOP 轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞，48 h后收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測(cè)Axin 對(duì)Cbl 和SPOP 蛋白水平的影響，發(fā)現(xiàn)Axin 可增強(qiáng)SPOP 的蛋白表達(dá)（圖3（d））.有文獻(xiàn)報(bào)道PDL1 主要通過K48 位和K63 位進(jìn)行泛素化降解[19-21]，將質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMVAxin 和pCDNA3.1a-PD-L1 和野生型、K48 或者K63的HA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞，以V5 抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其對(duì)PD-L1 蛋白泛素化的影響，發(fā)現(xiàn)Axin 促進(jìn)K48 依賴的PD-L1 泛素化降解（圖3（e））.

綜上所述，本文認(rèn)為HBV 可能通過其HBx 下調(diào)Axin 蛋白水平，降低PD-L1 的E3 連接酶SPOP 蛋白水平，進(jìn)而抑制K48 依賴的PD-L1 泛素化降解，導(dǎo)致HBV 感染肝細(xì)胞內(nèi)PD-L1 蛋白含量增加（圖3（f））.

圖3 Axin 通過影響E3 連接酶SPOP 的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控PD-L1 的蛋白酶體降解Fig.3 Axin regulates proteasome degradation of PD-L1 by affecting the expression of E3 ligase SPOP

3 討論

在HBV 誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌中，癌組織中的Axin蛋白水平明顯低于其鄰近組織，但HBV 下調(diào)Axin蛋白表達(dá)的機(jī)制尚不明確.本文對(duì)HBV 抑制Axin蛋白表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)HBx 可能參與了HBV 對(duì)Axin 蛋白水平的下調(diào)作用.文獻(xiàn)[22-24]研究表明，在乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌組織中，CD8+T 細(xì)胞功能異常且耗竭，其特征是PD-1 高表達(dá)，干擾素-γ 和腫瘤壞死因子分泌減少，但HBV 感染誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)PD-L1 表達(dá)的機(jī)制仍不清楚.本文研究發(fā)現(xiàn)在HBV 感染的肝細(xì)胞內(nèi)，Axin 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)而PD-L1 蛋白表達(dá)顯著增加.通過相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，Axin 不能調(diào)節(jié)WNT 信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)進(jìn)而影響PD-L1 的轉(zhuǎn)錄水平.另外，一個(gè)蛋白影響另外一個(gè)蛋白的表達(dá)，也有可能是調(diào)節(jié)它翻譯后的降解水平來實(shí)現(xiàn)的.通過添加相關(guān)抑制劑，發(fā)現(xiàn)Axin 通過影響PD-L1 的蛋白酶體降解途徑，降低病毒感染細(xì)胞內(nèi)PD-L1 水平.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Axin 可能通過影響PD-L1 的E3 連接酶SPOP 的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其促進(jìn)PD-L1 泛素化降解作用，但Axin 影響SPOP 表達(dá)的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究.另外，本研究只選擇了與PD-L1 相關(guān)的兩種E3 連接酶進(jìn)行了研究，Axin 是否對(duì)作用于PDL1 的其他E3 連接酶有影響還有待進(jìn)一步探討.