FOXM1688-748 結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白的鑒定

譚擁軍，楊仕平，余靂，黃小芹，陳燕，譚桂湘

（湖南大學(xué) 生物學(xué)院，湖南 長沙 410082）

FOXM1（Forkhead box M1）是轉(zhuǎn)錄因子FOX 家族的成員，該家族成員都有一個保守的翼狀螺旋DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域[1].FOXM1 幾乎在所有腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，是基因表達(dá)和細(xì)胞循環(huán)機(jī)制以及其他重要生理過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[2]，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤血管生成、防止細(xì)胞過早衰老等過程[3-7]，它與癌癥的發(fā)生和發(fā)展存在著至關(guān)重要的關(guān)系，已被確立用于癌癥診斷、治療和預(yù)后[8].FOXM1 蛋白主要包含3 個結(jié)構(gòu)域，分別是保守的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）、N-端抑制結(jié)構(gòu)域（NRD）、C-端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（TAD）[9].FOXM1 激活靶基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制中，通過直接結(jié)合靶基因啟動子后招募其他共激活因子，激活基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)器，從而啟動轉(zhuǎn)錄[10].通常情況下，F(xiàn)OXM1 的N-端抑制結(jié)構(gòu)域與C-端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域相互作用，抑制FOXM1 的轉(zhuǎn)錄活性[11-12].FOXM1 需要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用時，主要依賴細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）和PLK1 激酶，對FOXM1 的TAD 進(jìn)行磷酸化，使TAD 構(gòu)象發(fā)生變化，誘導(dǎo)NRD 釋放TAD.隨后磷酸化的TAD 可募集共激活劑CBP，實(shí)現(xiàn)激活基因轉(zhuǎn)錄[13].

目前，已發(fā)現(xiàn)FOXM1 與許多蛋白發(fā)生相互作用.一些互作蛋白作為FOXM1 的正調(diào)節(jié)因子，通過激活FOXM1 的功能，增強(qiáng)其在癌細(xì)胞中的活性，如NPM、MELK、Pin1 等蛋白[14].另一些互作蛋白可作為FOXM1 的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過抑制FOXM1 的功能來減弱其在癌細(xì)胞中的活性.如在蛋白毒性應(yīng)激下，HSP70 與FOXM1 的相互作用抑制了FOXM1 的DNA 結(jié)合能力[15].此外，F(xiàn)OXM1 與其他蛋白相互作用，發(fā)揮介導(dǎo)這些蛋白激活或增強(qiáng)其致癌通路的功能.如在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，F(xiàn)OXM1 直接結(jié)合β-catenin，增強(qiáng)了β-catenin 的核定位和轉(zhuǎn)錄活性，從而激活WNT 信號通路[16].

近幾十年來，對FOXM1 的轉(zhuǎn)錄激活研究較多集中在其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的氨基酸修飾上，而對直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的研究較少.為了拓展FOXM1 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域?qū)ζ滢D(zhuǎn)錄活性影響的認(rèn)識，本文通過體外純化該結(jié)構(gòu)域的方法，來研究其他可能通過TAD 結(jié)構(gòu)域調(diào)控FOXM1 轉(zhuǎn)錄活性的機(jī)制，這對揭示FOXM1 蛋白的分子功能具有重要的生物學(xué)意義.

1 材料與方法

1.1 材 料

質(zhì)粒pGEX-4T2、FOXM1 CDS 序列由本實(shí)驗(yàn)室保存；乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）；胎牛血清（FBS）購自GIBCO 公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21 Rosetta（DE3）、DNA 聚合酶、PCR 引物、1 kb DNA maker 購自北京擎科生物技術(shù)有限公司；T4 DNA 連接酶購自Ferments 公司；限制性內(nèi)切酶XhoI、BamH1 購自Thermo Fisher 公司；Glutathione Sepharose 4B 珠子、GST 抗體、Rabbit 二抗購自碧云天生物技術(shù)公司；Mouse 二抗購自Bio-Rad 公司；FOXM1 抗體購自CST（cell signaling technology）公司；BAG2 抗體購自上海生工生物工程股份有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 pGEX-4T2-FOXM1688-748載體的構(gòu)建

在NCBI 中檢索FOXM1 的CDS 區(qū)序列，截取其第688 位到748 位氨基酸對應(yīng)的核苷酸序列并結(jié)合載體pGEX-4T2 的MCS 位點(diǎn)確定FOXM1688-748的引物.其上游引物為GCGGATCCATGTCCCCG GAGCCACAGGTT，下游引物為GCCTCGAGCTA CTGTAGCTCAGGAAT，劃線部分為限制性內(nèi)切酶BamH1、XhoI 的酶切位點(diǎn).以FOXM1 的CDS 序列為模板，擴(kuò)增出FOXM1688-748片段.擴(kuò)增條件為98 ℃，2 min；98 ℃，10 s；60 ℃，15 s；72 ℃，15 s；35 個循環(huán).將PCR 產(chǎn)物克隆入pGEX-4T2 空載體中，經(jīng)BamH1、XhoI 雙酶切鑒定后送擎科生物有限公司測序.

1.2.2 重組蛋白GST-FOXM1688-748的表達(dá)和純化

將pGEX-4T2-FOXM1688-748、pGEX-4T2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞BL21 中，挑選陽性單克隆，加入含有氨芐的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD 值為0.6～0.8 的產(chǎn)物，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG，28.5 ℃誘導(dǎo)過夜，4 000 r/min，離心20 min，收集菌體，加入終質(zhì)量濃度為200～400 mg/mL 溶菌酶冰上裂解30 min.超聲破碎，離心收集上清，加入GST 珠子，4 ℃孵育2 h.離心棄上清，用PBS 將珠子洗5 遍，GST Elution Buffer 洗脫純化的蛋白，收集蛋白并用考馬斯亮藍(lán)染色檢測其純化效果.

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-231 細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS和1%雙抗（100 mg/L 青霉素和鏈霉素）的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、相對濕度為90%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)MDA-MB-231 細(xì)胞密度達(dá)到90%后用于Pulldown 實(shí)驗(yàn).

1.2.4 GST-pulldown

收集MDA-MB-231 細(xì)胞，加入500 μL 的IP 裂解液，以體積比1 ∶100 的比例加入蛋白酶抑制劑，冰上裂解1 h，12 000 r/min，離心5 min，收集上清.加入30 μL GST 珠子，4 ℃預(yù)孵育1 h.1 000 r/min 離心2 min，收集上清，一分為二，分別加入50 μg 原核純化的GST、GST-FOXM1688-748蛋白、30 μL GST 珠子，4 ℃孵育2 h.1 000 r/min，離心2 min 收集GST 珠子，用預(yù)冷的PBS 漂洗4 次，加入30 μL 1xLoading Buffer，98 ℃變性15 min 后進(jìn)行SDS-PAGE 和考馬斯亮藍(lán)檢測.

1.2.5 質(zhì)譜分析

將Pulldown 拖下來的蛋白通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分離后，切下來送上海胡珀生物有限公司打質(zhì)譜.將實(shí)驗(yàn)組與對照組蛋白去重后，選擇質(zhì)譜分?jǐn)?shù)大于2 的蛋白用UniProtKB 在線網(wǎng)站（https：//www.uniprot.org/）分析分子功能，將結(jié)果進(jìn)行整理和歸類，得到不同功能的蛋白.為了驗(yàn)證質(zhì)譜結(jié)果的可靠性，挑選潛在的互作蛋白BAG2 進(jìn)行互作驗(yàn)證，方法同1.2.3 節(jié)中的方法.

2 結(jié)果與分析

2.1 pGEX-4T2-FOXM1688-748 載體的構(gòu)建

以FOXM1 CDS 序列為模板，擴(kuò)增出FOXM1688-748目的條帶，其大小為200 bp 左右（圖1（a））.將該片段克隆入經(jīng)酶切后的pGEX-4T2 載體中，進(jìn)行菌落PCR 和雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示其在100～300 bp 有明顯的條帶（圖1（b）（c）），pGEX-4T2-FOXM1688-748載體示意圖如圖1（d）所示.將構(gòu)建好的載體進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示與本文設(shè)計(jì)結(jié)果相同（圖1（e））.由此可知，本文成功構(gòu)建了pGEX-4T2-FOXM1688-748原核表達(dá)載體.

圖1 pGEX-4T2-FOXM1688-748 質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定Fig.1 Construction and identification of pGEX-4T2-FOXM1688-748 plasmid

2.2 重組蛋白GST-FOXM1688-748 的表達(dá)與純化

將克隆成功的pGEX-4T2-FOXM1688-748質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 Rosetta，挑選陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，用GST 珠子純化，考馬斯亮藍(lán)染色展示純化結(jié)果如圖2 所示.由圖2 可知，GST 和GSTFOXM1688-748蛋白的純化效果較好，并且可以得到較高濃度的GST、GST-FOXM1688-748蛋白，為后續(xù)的Pulldown 實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)材料.

圖2 重組蛋白GST 和GST-FOXM1688-748 考馬斯亮藍(lán)染色Fig.2 Coomassie blue staining of GST and GST-FOXM1688-748 proteins

2.3 FOXM1688-748 與FOXM1 全長蛋白相互作用

為了驗(yàn)證FOXM1688-748與FOXM1 全長蛋白的作用關(guān)系，通過GST-pulldown 的方法來驗(yàn)證它們的相互作用.用預(yù)清除的MDA-MB-231 細(xì)胞裂解液分別與GST、GST-FOXM1688-748重組蛋白孵育，用FOXM1、GST 抗體進(jìn)行免疫印記檢測.重組蛋白GSTFOXM1688-748可以拖下其全長蛋白FOXM1，而GST蛋白在同一位置未檢測到FOXM1 條帶，表明FOXM1688-748可以與其全長相互作用（圖3），證實(shí)了純化的重組蛋白FOXM1688-748具有良好的生物活性.

圖3 Pulldown 結(jié)果及Western blot 分析Fig.3 Pulldown result and Western blot analysis

2.4 FOXM1688-748 互作蛋白的鑒定

為了研究FOXM1688-748可能的生物學(xué)作用，將GST-pulldown 拖下來的蛋白送公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，取質(zhì)譜分?jǐn)?shù)大于2 的蛋白進(jìn)行分析，得到112 個蛋白，其中有2 個蛋白已被證明與FOXM1 的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域互作，分別是CDK1 和FOXM1.對質(zhì)譜中的蛋白進(jìn)行分類和整理，發(fā)現(xiàn)這些蛋白分子功能較多集中于蛋白質(zhì)的加工和分泌、細(xì)胞周期和分裂、翻譯過程（圖4）.在蛋白質(zhì)的加工和分泌方面，捕獲到的蛋白有HSP90AB1、HSPB1、BAG2、USP9Y、DERL1、UBB、FAM129A 等，其中HSP90AB1、HSPB1、BAG2與蛋白質(zhì)的折疊有關(guān)，USP9Y、DERL1、UBB 與蛋白質(zhì)的泛素化有關(guān)，F(xiàn)AM129A 參與翻譯后蛋白質(zhì)的磷酸化.在細(xì)胞周期和分裂方面，捕獲到的蛋白有CDK1、FOXM1、MCM7、RPN2、MISP、NCAPG 等，這些蛋白在細(xì)胞分裂過程中發(fā)揮了重要的作用.在翻譯方面，捕獲到的蛋白有GCN1、RACK1、LARS、DDX39A、HNRNPA0 等，GCN1、RACK1、LARS 參與蛋白質(zhì)的合成過程，而DDX39A、HNRNPA0 分別參與mRNA 的前期剪接和細(xì)胞因子mRNA 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控.

圖4 互作蛋白的功能分析Fig.4 Functional analysis of interacting proteins

2.5 FOXM1688-748 與BAG2 的互作驗(yàn)證

為了驗(yàn)證質(zhì)譜結(jié)果的可靠性，從質(zhì)譜中挑選潛在的互作蛋白BAG2 進(jìn)行互作驗(yàn)證.在Pulldown 實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，原核表達(dá)的FOXM1688-748可與MDA-MB-231 細(xì)胞中內(nèi)源的BAG2 相互作用（圖5）.上述結(jié)果證實(shí)了質(zhì)譜結(jié)果的可靠性，并為研究FOXM1 C 端互作蛋白的功能及分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

圖5 FOXM1688-748 與BAG2 互作Fig.5 FOXM1688-748 interacts with BAG2

3 討論

Pulldown 是一種廣泛用于體外檢測兩種或多種蛋白質(zhì)之間的物理相互作用的方法，以確認(rèn)預(yù)測的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用或捕獲新的互作蛋白[17].在這項(xiàng)研究中，本文成功純化了FOXM1 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域FOXM1688-748，并利用Pulldown 實(shí)驗(yàn)證實(shí)它能夠與FOXM1 全長蛋白互作，這是由于FOXM1的NRD 可以與其TAD 相互作用[11].由于內(nèi)源FOXM1的TAD 需要在細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的磷酸化后才能被NRD 釋放，為了直接獲得與FOXM1 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白，利用GST-pulldown 方法，在不受NRD 影響的情況下，通過質(zhì)譜鑒定得到一系列與其相互作用的蛋白.FOXM1 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有至關(guān)重要的作用，這離不開各種互作蛋白對FOXM1 的翻譯后調(diào)控.在質(zhì)譜結(jié)果中，我們捕獲到一些已知的FOXM1 互作蛋白，如CDK1.在細(xì)胞分裂的S 期或M 期，CyclinB1/CDK1 復(fù)合物結(jié)合FOXM1 的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，誘導(dǎo)CDK1 磷酸化FOXM1，磷酸化后的FOXM1 招募共激活因子CBP，從而激活FOXM1 的轉(zhuǎn)錄活性[10].根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果中蛋白質(zhì)的功能，預(yù)示RPN2、MISP、MCM7、FAM129A 蛋白可能參與調(diào)節(jié)FOXM1 的轉(zhuǎn)錄活性.

除了對FOXM1 翻譯后的修飾實(shí)現(xiàn)的調(diào)控外，一些互作蛋白還可以參與維持FOXM1 蛋白的穩(wěn)定性，它們通過對FOXM1 的去泛素化作用來增強(qiáng)FOXM1的穩(wěn)定性，如USP21.在基底樣乳腺癌細(xì)胞中，USP21與FOXM1 互作，使FOXM1 去泛素化免受蛋白酶體的降解[18].質(zhì)譜結(jié)果中也存在一些泛素化分子，如USP9Y、CUL4A，預(yù)示這些蛋白參與FOXM1 蛋白的泛素化或去泛素化，從而調(diào)節(jié)其蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性.此外，一些與蛋白質(zhì)折疊有關(guān)的分子伴侶也出現(xiàn)在質(zhì)譜結(jié)果中，如HSPB1、USP9Y、BAG2.Pulldown 實(shí)驗(yàn)也證實(shí)BAG2 與FOXM1 的互作，預(yù)示這些蛋白可能通過對FOXM1 蛋白的折疊來維持其穩(wěn)定性.

FOXM1 作為經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子，其主要的功能是結(jié)合到下游靶基因的啟動子上，招募一些轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，實(shí)現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活[19].質(zhì)譜中也出現(xiàn)了一些與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白，如RuvBL1.RuvBL1 是NuA4組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的成分，主要通過對核小體組蛋白H4 和H2A 的乙?；瘏⑴c靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，這種修飾既可以改變核小體與DNA 的相互作用，又可以促進(jìn)修飾的組蛋白與其他可正向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的相互作用[20].預(yù)示RuvBL1 可能被招募到轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中，參與FOXM1 對下游靶基因的激活.

綜上所述，利用FOXM1688-748重組蛋白為原料，通過Pulldown 結(jié)合質(zhì)譜的方法獲得了FOXM1 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的潛在互作蛋白，并對這些潛在互作蛋白的分子功能進(jìn)行分析歸類.這為后續(xù)研究FOXM1轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的互作蛋白提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對探究FOXM1 分子的生物學(xué)功能具有重要的意義.