Torin1、Nutlin-3a促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源早期心肌細(xì)胞成熟的初步研究

陳穎 楊禮 宮藝其 譚瑤 王會(huì)景 劉明璐 盧婷婷 羅潤(rùn)嬌 王偉 付煒

心血管疾病是全球范圍造成死亡的主要原因。2019年超過(guò)1 850萬(wàn)人死于心血管疾病，占死亡人數(shù)的32.8%；2020年全球心衰患者估計(jì)為6 330萬(wàn)人，5年生存率與癌癥相似[1]。治療困難、缺乏有效的疾病模型等問(wèn)題，限制了心血管疾病研究領(lǐng)域的進(jìn)展。2006年，Yamanaka通過(guò)在成體細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Oct4、Sox2、Nanog、KLF4等4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Human induced pluripotent stem cell，hiPSC)[2]。iPSCs避免了破壞胚胎獲取胚胎干細(xì)胞存在的倫理問(wèn)題，成為心肌細(xì)胞的理想來(lái)源。利用iPSCs可以進(jìn)行心臟疾病模型、藥物篩選、細(xì)胞治療等一系列研究，極大推動(dòng)了心臟疾病領(lǐng)域的研究。然而，hiPSC誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞(Human induced pluripotent stem cell-cardiomyocyte，hiPS-CM)依然存在一些問(wèn)題，比如成熟度低，更接近胎兒期細(xì)胞[3]。大量研究通過(guò)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞共培養(yǎng)、機(jī)電刺激、添加生物活性分子等方法，試圖促進(jìn)心肌細(xì)胞成熟[4]，但是這些方法或過(guò)于復(fù)雜，或效果有限。因此，需要進(jìn)一步研究以獲得簡(jiǎn)單有效的促進(jìn)iPSCs來(lái)源心肌細(xì)胞成熟的方法。

雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)是細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝狀態(tài)的主要調(diào)節(jié)劑，可以響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子和許多細(xì)胞外信號(hào)[5]。mTOR在心臟中起著重要作用，mTOR信號(hào)的異常激活可導(dǎo)致病理性心臟肥大[6]。mTOR的抑制在心臟意外損傷時(shí)可起到一定的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR抑制劑雷帕霉素應(yīng)用于心肌梗死中減少了細(xì)胞凋亡[7]。mTOR已被證明與其他類型細(xì)胞的成熟相關(guān)，包括紅細(xì)胞、胰腺細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞[8-9]。然而，mTOR是否以及如何影響心肌細(xì)胞的成熟尚不清楚。胚胎發(fā)育過(guò)程中心臟的生長(zhǎng)主要通過(guò)心肌細(xì)胞的增殖，然而心肌細(xì)胞在出生后不久就退出細(xì)胞周期，心臟生長(zhǎng)主要是通過(guò)細(xì)胞體積的增大而不是細(xì)胞增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)的[10]。研究表明，在小鼠早期發(fā)育過(guò)程中，胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)增殖需要mTOR，而出生后小鼠心臟中的mTOR表達(dá)水平非常低[11]。

已有研究證實(shí)，Torin1可以抑制mTOR通路并且上調(diào)p53，Nutlin-3a抑制Mdm2/p53相互作用和誘導(dǎo)p53上調(diào)，并抑制mTOR通路。我們嘗試通過(guò)上調(diào)p53蛋白的表達(dá)，伴隨mTOR通路的抑制，可能誘導(dǎo)細(xì)胞退出細(xì)胞周期，促進(jìn)cTnT等心肌相關(guān)成熟標(biāo)志物的表達(dá)，以期增加iPS細(xì)胞分化來(lái)源早期心肌細(xì)胞的成熟度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

TESR-E8培養(yǎng)基(Stemcell，加拿大)，EDTA(Thermo，美國(guó))，Y-27632(Stemcell，加拿大)，基質(zhì)膠(Corning，美國(guó))，ACCUTASE消化酶(Stemcell，美國(guó))，RPMI1640(Thermo，美國(guó))，B27-INSULIN(Thermo，美國(guó))，CHIR99021(Stemcell，加拿大)，心肌細(xì)胞消化液(賽貝，中國(guó))，流式細(xì)胞固定破膜液(Invitrogen，美國(guó))，cTnI抗體(Proteintech，美國(guó))，cTnT抗體(Proteintech，美國(guó))，p53抗體(Proteintech，美國(guó))，ki67抗體(Abcam，英國(guó))，α-actin抗體(Sigma，美國(guó))，TRIZOL(Thermo，美國(guó))，SYBR PCR試劑盒(Qiagen，德國(guó))，RT REAGENT KIT試劑盒(TaKaRa，日本)，胰酶(Thermo，美國(guó))，雙抗(Hyclone，美國(guó))，F(xiàn)BS(Bioind，以色列)，DMSO(Sigma，美國(guó))，驢抗兔/鼠IgG二抗(Abcam，英國(guó))，DAPI(翊圣，中國(guó))，PCR引物訂購(gòu)于上海生工生物科技有限公司，4× Tris-HCl濃縮膠配膠緩沖液pH 6.8 0.5 mol/L、4× Tris-HCl濃縮膠配膠緩沖液pH 8.8 1.5 mol/L(生工，中國(guó))，Amersham Hybond P 0.45 PVDF(GE Healthcare，美國(guó))，non-fat powder milk(BBI Life Science，美國(guó))，Tris-Glycine-SDS緩沖液(生工，中國(guó))，10×印跡轉(zhuǎn)膜緩沖液(生工，中國(guó))，Tween-20、TEMED、APS、10% SDS(Sangon Biotech，美國(guó))，PMSF、RIPA裂解液(強(qiáng))、30% Acr-Bis(29∶1)，5× SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(碧云天，中國(guó))，Immobilon Western HRP底物(Merk，德國(guó))，Pageruler prestained protein ladder(Life Technologies，美國(guó))。

流式細(xì)胞分析儀(FACSCantoTMFlow Cytometer，BD，美國(guó))，激光掃描共聚焦顯微鏡(TSC SP8，Leica，德國(guó))，倒置熒光顯微鏡(DMI3000B，Leica，德國(guó))，NanoDrop 2000(Thermo，美國(guó))，qPCR儀(CFX-Connect，BIO-RAD，美國(guó))，化學(xué)發(fā)光成像儀(Amersham Imager 600，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

hiPSC細(xì)胞系由上海兒童醫(yī)學(xué)中心李彥欣教授課題組建系、鑒定，為臍帶血細(xì)胞來(lái)源，捐獻(xiàn)者簽署了相關(guān)知情同意書(shū)。

在Matrigel鋪板的6孔板中，使用TeSR-E8培養(yǎng)基進(jìn)行hiPSCs的維持和擴(kuò)增。

采用GiWi方案分化得到心肌細(xì)胞，具體流程為：分化前2 d，將iPS細(xì)胞以100萬(wàn)/孔的密度接種于12孔板上，分化第0天加入12 μmol/L CHIR99021(用B27-Insulin配制)，2 mL/孔，36 h后吸棄，加入B27-Insulin培養(yǎng)基，2 mL/孔，分化第3天棄培養(yǎng)基，加入5 μM IWP2(用B27-Insulin配制)，2 mL/孔，分化第5天吸棄，加入B27-Insulin培養(yǎng)基，分化第7天吸棄，加入B27+Insulin培養(yǎng)基，此后每2天換一次液。分化第9天細(xì)胞開(kāi)始搏動(dòng)。

將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化到第11天，即細(xì)胞開(kāi)始跳動(dòng)后2 d，作為起點(diǎn)，將實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組：DMSO組(陰性對(duì)照組)；10 μmol/L Nutlin-3a處理24 h(Nutlin-3a組)；200 nmol/L Torin1處理7 d(Torin1組)，每2天換一次新鮮的培養(yǎng)基。

3T3細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，30萬(wàn)/孔，用高糖DMEM(包含10%FBS)維持細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)以胰酶消化傳代。將3T3細(xì)胞分為3個(gè)組：DMSO組(陰性對(duì)照組)；10 μmol/L Nutlin-3a處理24 h(Nutlin-3a組)；200 nmol/L Torin1處理3 d(Torin1組)。以30萬(wàn)/孔接種于6孔板上，24 h后分別加入DMSO、Nutlin-3a、Torin1，3 d后進(jìn)行細(xì)胞學(xué)的相關(guān)鑒定。

1.2.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以合適的密度接種于共聚焦小皿上，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton-100破膜通透5 min，5%BSA室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗3次，二抗室溫避光孵育2 h，DAPI染色5 min后PBS漂洗3次，避光保存激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)

吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞，每孔加入1 mL細(xì)胞裂解液trizol，室溫作用5 min，收集細(xì)胞，吹打混勻。用氯仿、苯酚等有機(jī)溶液提取RNA，用PrimeScript RT reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，具體操作參照試劑使用說(shuō)明。使用SYBR Green PCR試劑和相關(guān)引物，在bio-rad CFX96實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀上完成RNA定量實(shí)驗(yàn)，以TBP(tata結(jié)合蛋白基因)作為管家基因，PCR引物序列如表1所示，依據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算RNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 免疫蛋白印跡(Western blot)

用裂解緩沖液(RIPA、蛋白酶抑制劑混合物)裂解細(xì)胞，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白含量。將樣品與loading混合，95 ℃變性10 min，將樣品總蛋白量稀釋至相同濃度，以同體積加入配制好的10%凝膠樣品孔中，80 V電泳3 h，隨后以200 mA、90 min轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。然后用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗室溫下孵育1 h。采用ECL Western blotting檢測(cè)試劑盒以化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白信號(hào)，譜帶密度使用AI600軟件進(jìn)行量化。

1.2.5 流式細(xì)胞分析技術(shù)

將106個(gè)3T3細(xì)胞在70%預(yù)冷乙醇中-20 ℃固定過(guò)夜，用Hoechst 33342和pyronin Y室溫孵育30 min，用于區(qū)分G0、G1、S-G2-M期細(xì)胞，數(shù)據(jù)通過(guò)流式細(xì)胞分析儀器獲取，并使用FlowJo進(jìn)行分析。

1.2.6 膜片鉗電生理技術(shù)

將細(xì)胞消化成單細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按2.5×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞種植在預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的共聚焦小皿上，繼續(xù)培養(yǎng)48 h至細(xì)胞完全貼壁。利用消化液消化細(xì)胞收縮變圓，隨后通過(guò)灌流裝置灌流10 min動(dòng)作電位電極外液。選取單個(gè)完整心肌細(xì)胞作為記錄細(xì)胞。當(dāng)記錄電極尖端與細(xì)胞膜表面形成高阻封接后，吸破細(xì)胞膜，補(bǔ)償細(xì)胞膜電容，使用電流鉗模式記錄心肌細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生的動(dòng)作電位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Torin1、Nutlin-3a對(duì)3T3細(xì)胞增殖的影響

為了驗(yàn)證Torin1、Nutlin-3a對(duì)細(xì)胞增殖的影響，我們首先在3T3細(xì)胞系里進(jìn)行了驗(yàn)證。3 d后光鏡下觀察顯示：Torin1組和Nutlin-3a組細(xì)胞數(shù)量比DMSO組明顯減少(圖1A-C)。免疫熒光染色結(jié)果顯示：增殖標(biāo)志物Ki67陽(yáng)性細(xì)胞的比例在DMSO組(32.8%±15.4%)高于Nutlin-3a組(8.2%±3.6%)和Torin1組(8.8%±3.9%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖1D-G)。流式細(xì)胞分析顯示：Torin1組(31.8%±15.7%)和Nutlin-3a組(41.3%±11.4%)比DMSO組(9.0%±9.5%)，有更多的細(xì)胞進(jìn)入G0期(P<0.05)，說(shuō)明Nutlin-3a和Torin1對(duì)細(xì)胞周期有一定的調(diào)控作用(圖1H)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，Nutlin-3a和Torin1可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期而抑制細(xì)胞增殖。

A-C: 3t3細(xì)胞光鏡圖(標(biāo)尺=400 μm)；D-F：各組3t3細(xì)胞ki67、DAPI、F-actin、Merge免疫熒光(標(biāo)尺=100 μm)；G: ki67陽(yáng)性3t3細(xì)胞統(tǒng)計(jì)分析；H: 3t3細(xì)胞周期流式分析；*：P<0.05；***：P<0.001。A-C: Light microscopic view of 3t3 cells (bar=400 μm); D-F: Immunofluorescence of Ki67, DAPI, F-actin, Merge (bar=100 μm) in 3t3 cells of each group; G: Statistical analysis of Ki67 positive 3t3 cells; H: Cell cycle analyzed by flow cytometry; *: P<0.05; ***: P<0.001.圖1 Torin1、Nutlin-3a對(duì)3T3細(xì)胞增殖的影響Fig. 1 Effect of Torin1、Nutlin-3a on proliferation of 3T3 cells

2.2 hiPS細(xì)胞鑒定及hiPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化

hiPS細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)，邊緣整齊，細(xì)胞小，呈圓形，排列緊密，核質(zhì)比高。免疫熒光染色結(jié)果顯示：hiPS細(xì)胞高表達(dá)干性標(biāo)志物Nanog、Oct4、Sox2、Tra-1-60(圖2)。在hiPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，由橢圓形變?yōu)槎噙呅蔚男募〖?xì)胞，第9天可以觀察到跳動(dòng)的心肌細(xì)胞(圖3B-E)。免疫熒光結(jié)果顯示：分化的心肌細(xì)胞高表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物cTnT、α-actinin,肌節(jié)明顯且排列較規(guī)整(圖3F)。流式細(xì)胞分析技術(shù)顯示：分化的心肌細(xì)胞高表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物cTnT，效率超過(guò)70%(圖3G)。

A：Nanog、DAPI、Merge免疫熒光；B：Oct4、DAPI、Merge免疫熒光；C：Sox2、DAPI、Merge免疫熒光；D：TRA-1-60、DAPI、Merge免疫熒光。A: Immunofluorescence of Nanog, DAPI and Merge; B: Immunofluorescence of Oct4, DAPI and Merge; C: Immunofluorescence of Sox2, DAPI and Merge; D: Immunofluorescence of TRA-1-60, DAPI and Merge.圖2 hiPS細(xì)胞特異性標(biāo)志物鑒定(標(biāo)尺=400 μm)Fig. 2 Pluripotency identification of hiPSC (bar=400 μm)

A：hiPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞過(guò)程模式圖；B：hiPS細(xì)胞形態(tài)；C-E：hiPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程形態(tài)變化圖(標(biāo)尺=400 μm)；F：分化第35天cTnT、α-actin、DAPI、Merge免疫熒光(標(biāo)尺=10 μm)；G：分化第15天cTnT表達(dá)流式分析。A: The process of inducing differentiation of hiPS cells into cardiomyocytes; B: Morphological observation of hiPS; C-E: Morphological changes of hiPS cells during differentiation (bar=400 μm); F: Immunofluorescence of cTnT, α-actin, DAPI and Merge on the 35th day of differentiation (bar=10 μm); G: Flow analysis of cTnT on the 15th day of differentiation.圖3 hiPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過(guò)程及心肌細(xì)胞鑒定Fig. 3 Differentiation of hiPS cells into cardiomyocytes and identification of cardiomyocytes

2.3 Torin1、Nutlin-3a對(duì)hiPS-CM成熟相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為了評(píng)估Torin1和Nutlin-3a對(duì)iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的早期心肌細(xì)胞成熟的影響，我們?cè)谠缙谛募〖?xì)胞中分別添加Torin1和Nutlin-3a，通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)心肌特異性蛋白cTnT、cTnI以及p53總蛋白含量進(jìn)行鑒定(圖4A)。結(jié)果顯示：以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，DMSO組、Nutlin-3a組、Torin1組cTnT條帶灰度值分別為34 161± 6 679、52 402±10 376、51 274±10 325(圖4B)，DMSO組、Nutlin-3a組、Torin1組cTnI條帶灰度值分別為149 862±60 900、397 738±147 167、470 233±222 324(圖4C)。Nutlin-3a組和Torin1組cTnT、cTnI蛋白表達(dá)量相比DMSO組有增加的趨勢(shì)，p53蛋白在DMSO組和Nutlin-3a組表達(dá)最高，在Torin1組表達(dá)有下降的趨勢(shì)，與預(yù)期不符(圖4D)。Western blot結(jié)果初步表明，Torin1和Nutlin-3a作用于iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的早期心肌細(xì)胞，在蛋白水平上可能促進(jìn)心肌細(xì)胞成熟。

A：WB結(jié)果；B：cTnT蛋白條帶灰度值統(tǒng)計(jì)圖；C：cTnI蛋白條帶灰度值統(tǒng)計(jì)圖；D：p53蛋白條帶灰度值統(tǒng)計(jì)圖。A: The result of Western blot; B: Histogram of the gray value of cTnT protein bands; C: Histogram of the gray value of cTnI protein bands; D: Histogram of the gray value of p53 protein bands.圖4 hiPS-CM成熟相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of maturation related protein of hiPS-CM

2.4 Torin1、Nutlin-3a對(duì)hiPS-CM成熟相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Torin1和Nutlin-3a對(duì)iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的早期心肌細(xì)胞成熟的影響，我們對(duì)心肌成熟相關(guān)分子的RNA表達(dá)情況進(jìn)行了分析。qRT-PCR結(jié)果顯示：以TBP為內(nèi)參，心肌特異性標(biāo)志物TNNI3在Torin1組表達(dá)最多(P<0.000 1)。增殖標(biāo)志物CCNB1在Torin1組表達(dá)相比DMSO組有降低的趨勢(shì)。鈣離子通道標(biāo)志物CACNA1c在Torin1組和Nutlin-3a組表達(dá)相比DMSO組有增高的趨勢(shì)。鉀離子通道標(biāo)志物KCNJ2的表達(dá)在3組間未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，鈉離子通道標(biāo)志物SCN5A在Nutlin-3a組表達(dá)有增高的趨勢(shì)。糖代謝標(biāo)志物SLC2A1在Torin1組和Nutlin-3a組的表達(dá)相比DMSO組有降低的趨勢(shì)。脂代謝標(biāo)志物SLC27A6在Nutlin-3a組有表達(dá)增加的趨勢(shì)。脂代謝標(biāo)志物PPARGC1a在Torin1組表達(dá)最高，與DMSO組(P<0.001)以及Nutlin-3a組(P<0.05)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步表明Torin1處理過(guò)后的心肌細(xì)胞增殖可能減少，并且可能更多地以脂代謝為能量代謝方式，心肌特異性標(biāo)志物表達(dá)量增高提示心肌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)可能更加成熟(圖5)。

圖5 hiPS-CM成熟相關(guān)mRNA的表達(dá)(*：P<0.05；***：P<0.001；****：P<0.000 1)Fig. 5 Expression of maturation related mRNA of hiPS-CM (*: P<0.05; ***: P<0.001; ****: P<0.000 1)

2.5 Torin1、Nutlin-3a對(duì)hiPS-CM形態(tài)的影響

為了進(jìn)一步探究Torin1、Nutlin-3a對(duì)iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的早期心肌細(xì)胞形態(tài)的影響，我們對(duì)Torin1、Nutlin-3a處理后1周的hiPS-CM進(jìn)行了細(xì)胞免疫熒光染色，結(jié)果顯示：各組細(xì)胞表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物cTnT，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)趨近長(zhǎng)棒型，其中Torin1組心肌細(xì)胞肌節(jié)更加豐富，排列更加規(guī)整，更加接近成熟心肌細(xì)胞形態(tài)。該結(jié)果表明，Torin1和Nutlin-3a作用于iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的早期心肌細(xì)胞，可能促進(jìn)hiPS-CM形態(tài)的成熟(圖6)。

圖6 hiPS-CM形態(tài)鑒定：hiPS-CM cTnT、DAPI、Merge免疫熒光(標(biāo)尺=25 μm)Fig.6 Morphological identification of hiPS-CM: Immunofluorescence of cTnT, DAPI, Merge (bar=25 μm)

2.6 Torin1、Nutlin-3a對(duì)hiPS-CM動(dòng)作電位形態(tài)的影響

我們對(duì)Torin1、Nutlin-3a處理后1周的hiPS-CM進(jìn)行了動(dòng)作電位測(cè)定，結(jié)果顯示：Torin1組(23+12.7)和Nutlin-3a組(22.2+2.2)動(dòng)作電位頻率相比DMSO組(28.7+8.1)有降低的趨勢(shì)(圖7B)。3組間的振幅大小無(wú)明顯差異(圖7C)。Torin1組0期最大去極化速率相比DMSO組有增大的趨勢(shì)(圖7 D)。Torin1組和Nutlin-3a組動(dòng)作電位平臺(tái)期、APD30、APD70、APD90、閾電位絕對(duì)值相比DMSO組有增大的趨勢(shì)(圖7E-I)，表明Torin1和Nutlin-3a作用于iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的早期心肌細(xì)胞，可能促進(jìn)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位成熟。

A：動(dòng)作電位模式圖；B：動(dòng)作電位頻率；C：動(dòng)作電位振幅；D：0期最大去極化速率；E：動(dòng)作電位平臺(tái)期；F：域電位；G：30%復(fù)極化動(dòng)作電位時(shí)程；H：70%復(fù)極化動(dòng)作電位時(shí)程；I：90%復(fù)極化動(dòng)作電位時(shí)程；AP：動(dòng)作電位；dV：電壓；dt：時(shí)間；APD：動(dòng)作電位時(shí)程。A: Action potential pattern diagram; B: Action potential frequency; C: Action potential amplitude; D: Maximum depolarization rate at phase 0; E: Action potential plateau; F: Domain potential; G: 30% repolarized action potential duration; H: Time history of 70% repolarized action potential; I: 90% repolarized action potential time history; AP: Action Potential; dV: Voltage; dt: Time; APD: Action Potential Duration.圖7 膜片鉗電生理動(dòng)作電位分析Fig. 7 Analysis of electrophysiological action potential of patch clamp

3 討論

hiPSC來(lái)源的心肌細(xì)胞成熟度不足，不能很好地模擬在體的心肌細(xì)胞，成為心血管相關(guān)研究發(fā)展的一個(gè)重要障礙。目前，促進(jìn)干細(xì)胞來(lái)源的早期心肌細(xì)胞成熟的方法包括延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞共培養(yǎng)、機(jī)電刺激、添加生物活性分子等[12-13]，但是這些方法效果有限或者操作復(fù)雜，因此需要進(jìn)一步研究，以獲得簡(jiǎn)單有效的促進(jìn)iPSCs來(lái)源心肌細(xì)胞成熟的方法。我們通過(guò)Torin1、Nutlin-3a，調(diào)控細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞停止增殖，在一定程度上促進(jìn)了iPS分化來(lái)源的早期心肌細(xì)胞的成熟。

已有研究證明，心肌細(xì)胞在出生后不久便退出細(xì)胞周期，停止增殖。成熟的心肌細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，與心肌細(xì)胞代謝方式轉(zhuǎn)變、動(dòng)作電位時(shí)程的延長(zhǎng)、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的完善相符合[14]。研究表明，Torin1和Nutlin-3a可能抑制mTOR通路，促使細(xì)胞退出細(xì)胞周期，停止增殖。我們觀察到在Torin1和Nutlin-3a作用下，靜止期的3T3細(xì)胞數(shù)量增加并抑制了增殖標(biāo)記物ki67的表達(dá)。

肌節(jié)是心肌細(xì)胞收縮的基本單位。監(jiān)測(cè)肌節(jié)相關(guān)蛋白(如cTnT、cTnI等)的表達(dá)水平可以對(duì)iPS-CM的成熟進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。與成人心臟組織相比，iPS-CM 的肌節(jié)相關(guān)基因以及蛋白表達(dá)較低[15]。在hiPSC誘導(dǎo)的早期心肌細(xì)胞中，可以觀察到Torin1和Nutlin-3a在一定程度上促進(jìn)了心肌細(xì)胞肌節(jié)相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)。

在細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)方面，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞形態(tài)更趨近長(zhǎng)棒型，長(zhǎng)寬比增大，肌節(jié)豐富且排列規(guī)整。心肌細(xì)胞的形態(tài)對(duì)心肌功能的發(fā)揮具有重要影響。在體內(nèi)，心肌細(xì)胞是棒狀的，但在體外培養(yǎng)時(shí)，未成熟的心肌細(xì)胞呈扁平狀并向各個(gè)方向伸展。在心肌細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，肌節(jié)結(jié)構(gòu)也變得更有條理[16]。

心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的產(chǎn)生需要各種離子通道之間的協(xié)調(diào)活動(dòng)。未成熟心肌細(xì)胞中鈉通道和鈣通道蛋白水平較低，分別會(huì)導(dǎo)致較慢的0期去極化速度以及缺乏或較短的平臺(tái)期[17-18]。實(shí)驗(yàn)組在動(dòng)作電位的形態(tài)上，表現(xiàn)為頻率減慢、0期去極化最大速率增大、動(dòng)作電位平臺(tái)期、動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)的趨勢(shì)，類似成熟心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的特征。q-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組鈉離子和鈣離子通道相關(guān)蛋白的表達(dá)相比對(duì)照組有增高的趨勢(shì)，與電生理結(jié)果相一致。

研究表明，p53與細(xì)胞周期的調(diào)控密切相關(guān)，伴隨mTOR抑制的p53上調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)[19]，不伴mTOR抑制的p53上調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞衰老[20]。此外，大量p53的激活可以直接抑制mTOR通路，促使細(xì)胞進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，僅僅利用Nutlin-3a直接激活p53，也能起到一定的促成熟效果。但是，Torin1組和Nutlin-3a組p53蛋白的表達(dá)沒(méi)有呈現(xiàn)出預(yù)期的上升趨勢(shì)?？赡苁怯捎趐53蛋白本身表達(dá)量低且易降解，且真正起作用的是活化的p53蛋白。因此，總p53蛋白表達(dá)量只能作為參考指標(biāo)，更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)應(yīng)該依靠活性p53蛋白的表達(dá)量檢測(cè)。

綜上所述，利用Torin1和Nutlin-3a處理iPS分化來(lái)源的早期心肌細(xì)胞可能誘導(dǎo)細(xì)胞靜止并改善細(xì)胞成熟的相關(guān)指標(biāo)。初步表明mTOR信號(hào)通路可能是心肌細(xì)胞成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，后續(xù)還需要進(jìn)一步通過(guò)心肌細(xì)胞代謝、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)等進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞的成熟程度。