燈盞細(xì)辛對人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制

李鑫，陳娜，林文娟，袁媛

脈絡(luò)膜黑色素瘤（choroidal melanoma，CM）多見于40～60 歲人群，屬于成人最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤。該病病因未明，可能與內(nèi)分泌、環(huán)境、病毒感染、遺傳因素有關(guān)[1-2]。CM 屬于惡性腫瘤，發(fā)展迅速，具有較高的轉(zhuǎn)移率，主要采取眼球摘除方法治療但對于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的CM 患者，尚無有效治療方法[3-4]。因此，尋找一種療效好、副作用小、安全性高的治療藥物迫在眉睫。燈盞細(xì)辛具有抑制氧化反應(yīng)、降血脂、殺菌消毒、抗腫瘤等藥理作用[5-6]。以往關(guān)于燈盞細(xì)辛對眼組織保護(hù)作用的研究大都集中在動物體內(nèi)模型[7-8]，因此，本研究擬在細(xì)胞水平進(jìn)一步研究燈盞細(xì)辛對CM 細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人眼侵襲性CM 細(xì)胞系OCM-1（美國ATCC 公司，批號：DSM 4855），98%燈盞細(xì)辛注射液（武漢博士德生物工程有限公司，批號：20150112），二甲基亞砜、胎牛血清、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基培養(yǎng)液(dulbecco’s modification of eagle’s medium dulbecco，DMEM）、CCK-8 細(xì)胞增殖檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：KGA317），4%多聚甲醛（北京百奧萊博科技有限公司，批號：BTN131248），0.1%胰酶（北京索萊寶生物公司，批號：P7340），Hoechst 33258 染色試劑盒（南京建成生物研究所，批號：G003-1-2），Annexin-V 和PI 試劑盒（北京索萊寶生物公司，批號：CA1020），雙辛酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白測定試劑盒、聚氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（上海碧云天公司，批號：P0010S；FFP24），Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）及B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（上海碧云天公司，批號：AF0057；P7257），酶標(biāo)儀（北京中西華大科技有限公司，型號：M399038），流式細(xì)胞儀（美國BD公司，型號：DLK0002563），電泳儀（北京恒奧德儀器儀表有限公司，型號：HAD-JY600C），熒光顯微鏡（上海無陌光學(xué)儀器有限公司，型號：WMF-3530LED）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL）中培養(yǎng)OCM-1 細(xì)胞，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，每3 d 傳代1 次，更換新鮮培養(yǎng)液，取對數(shù)期生長的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，用胰酶消化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組 接種于96 孔板中，共分4 組，每組5 個(gè)復(fù)孔。（1）對照組（NC 組）：正常培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。（2）燈盞細(xì)辛組：以燈盞細(xì)辛濃度不同分為3 個(gè)亞組。燈盞細(xì)辛低濃度組（LC 組），即在培養(yǎng)基中加入1 μmol/L 的燈盞細(xì)辛溶液；燈盞細(xì)辛中濃度組（MC 組），即在培養(yǎng)基中加入10 μmol/L 的燈盞細(xì)辛溶液；燈盞細(xì)辛高濃度組（HC 組），即在培養(yǎng)基中加入100 μmol/L 的燈盞細(xì)辛溶液。每組均培養(yǎng)48 h。

1.3 CCK-8 法檢測OCM-1 細(xì)胞增殖率

OCM-1 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，按照上述方法隨機(jī)分4 組，100 μL/孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在37℃恒溫箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm 光密度（optical density，OD）值。

1.4 Hoechst 33258 染色法檢測凋亡

細(xì)胞接種于12 孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)/mL，4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，去固定液并用PBS 沖洗2 次，PBS 洗滌時(shí)手動晃動數(shù)次。加入Hoechst 33258 染色液后室溫避光反應(yīng)10 min，PBS 洗滌2 次后，再超凈臺中避光風(fēng)干，倒置熒光顯微鏡下觀查并拍照。

1.5 應(yīng)用Annexin V/PI 染色劑進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)檢測凋亡

OCM-1 細(xì)胞接種于6 孔板中，0.1%胰酶（不含乙二胺四乙酸）消化各組細(xì)胞后制備細(xì)胞懸液。1000 r/min 離心后，收集細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至含有300μL 緩沖液的離心管中，分別加入5μLAnnexin-V 和10μLPI溶液，室溫下避光反應(yīng)30min 后上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot 法檢測OCM-1 細(xì)胞內(nèi)Bax 及Bcl-2 的蛋白表達(dá)

提取蛋白質(zhì)后行聚丙烯酰胺凝膠電泳，設(shè)置一抗稀釋濃度為1:1000，二抗稀釋濃度為1:2000，電化學(xué)發(fā)光法顯影，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果以樣本目的蛋白的OD 比內(nèi)參條帶的OD，計(jì)算相對表達(dá)率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OCM-1 細(xì)胞的增殖率比較

4 組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.453，P=0.014）。與NC 組比較，各組均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tLC=8.806，tMC=9.293，tHC=12.832，均P=0.000）。與LC組比較，MC 組降低不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.783，P=0.112）；HC 組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.639，P=0.000）。HC 組比MC 組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.214，P=0.000）（表1）。

表1 4 組OCM-1 細(xì)胞的增殖率、凋亡率、Bax 和Bcl-2 比較（，n=5）

表1 4 組OCM-1 細(xì)胞的增殖率、凋亡率、Bax 和Bcl-2 比較（，n=5）

注：NC 組 對照組；LC 組 燈盞細(xì)辛低濃度組；MC 組 燈盞細(xì)辛中濃度組；HC 組 燈盞細(xì)辛高濃度組；* 與NC 組比較，P＜0.05；# 與LC 組比較，P＜0.05；△與MC 組比較，P＜0.05

2.2 OCM-1 細(xì)胞的凋亡比較

Hoechst 33258 染色劑可以進(jìn)入凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下，表現(xiàn)為致密顆粒狀強(qiáng)熒光集聚（亮藍(lán)色高熒光），以HC 組最為明顯（圖1）。

圖1 OCM-1 細(xì)胞凋亡圖（×200）。1A 對照組，可見均勻一致的暗黑色背景；1B 燈盞細(xì)辛低濃度組，可見高熒光類圓形細(xì)胞核，為凋亡細(xì)胞；1C 燈盞細(xì)辛中濃度組，可見高熒光類圓形細(xì)胞核數(shù)量增加；1D 燈盞細(xì)辛高濃度組，可見彌漫分布的凋亡細(xì)胞

流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，4 組間凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.440，P=0.003）。與NC 組比較，各組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tLC=7.760，tMC=9.776，tHC=14.650，均P=0.000）。與LC 組比較，MC 組升高不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.535，P=0.607），HC 組升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.140，P=0.000）。HC 組比MC 組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.020，P=0.000）（表1）。

2.3 Bax 及Bcl-2 蛋白的表達(dá)比較

4 組間Bax 相對表達(dá)量比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.114，P=0.012）。與NC 組比較，各組均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tLC組=10.750、tMC組=20.813、tHC組=81.881，均P=0.000）。與LC 組比較，MC 組降低，HC組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tMC=17.48，tHC=19.433，均P=0.000）。HC 組比MC 組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.680，P=0.006）（表1、圖2）。

4 組間Bcl-2 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.694，P=0.010）。與NC 組比較，各組均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tLC=4.648，P=0.002；tMC=6.197，tHC=14.334，均P=0.000）。與LC 組比較，MC 組和HC組均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tMC=3.043，P=0.016，tHC=9.767，P=0.000）。HC 組比MC 組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.267，P=0.000）（表1、圖2）。

圖2 OCM-1 細(xì)胞內(nèi)Bax 及Bcl-2 蛋白表達(dá)變化圖

3 討論

CM 始發(fā)于脈絡(luò)膜大血管層，可以發(fā)生于脈絡(luò)膜的任何部位，但常見于眼的后極部。如果瘤體生長于周邊部眼底，患者可無明顯癥狀；如瘤體生長于后極部，則表現(xiàn)為屈光度數(shù)增加、視物變形、視力下降、視野缺損，瘤體增大并繼發(fā)視網(wǎng)膜脫離時(shí)視力嚴(yán)重下降[9-10]。CM 發(fā)病機(jī)制并不明確，治療方案存在很大爭議，手術(shù)輔以放療和化學(xué)藥物治療是主要方法[11]。

對于腫瘤疾病，采用新的藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來治療腫瘤疾病已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[12]。燈盞細(xì)辛為菊科植物短葶飛蓬全草的主要活性成分，具有天然、低毒、高效、價(jià)格低廉的特征[5-6]。李奕萍[13]通過觀察銀杏葉提取物聯(lián)合燈盞細(xì)辛對青光眼小梁切除術(shù)后患者療效，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合應(yīng)用可以有效提高青光眼患者術(shù)后視力水平，改善視野并降低眼內(nèi)壓。本研究考察了燈盞細(xì)辛對OCM-1 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用及其作用機(jī)制。CCK-8 結(jié)果顯示，燈盞細(xì)辛抑制了OCM-1細(xì)胞的生長，且有濃度依賴性。判斷細(xì)胞凋亡最直觀方法為細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。Hoechst 33258 核染色法直接顯示了燈盞細(xì)辛能夠誘導(dǎo)OCM-1 細(xì)胞凋亡。此外，Annexin V/PI 檢測結(jié)果從另一個(gè)角度認(rèn)證了燈盞細(xì)辛對OCM-1 細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

細(xì)胞凋亡具有復(fù)雜的分子生物學(xué)特征，涉及一系列基因的表達(dá)、調(diào)控及激活，從而使機(jī)體更好的適應(yīng)生存環(huán)境。細(xì)胞凋亡過程中清除了異常細(xì)胞，保證了生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，為促進(jìn)系統(tǒng)發(fā)育發(fā)揮作用[14]。多種因素（衰老、藥物、氧化損傷、射線）能夠誘發(fā)凋亡反應(yīng)，當(dāng)機(jī)體正常的凋亡過程受到破壞或凋亡過程紊亂時(shí)，引發(fā)多種疾病，例如自身免疫性疾病及腫瘤[15]。本實(shí)驗(yàn)除了通過觀察燈盞細(xì)辛對OCM-1細(xì)胞增殖率、凋亡率的影響，還進(jìn)一步從機(jī)制學(xué)方面探討了燈盞細(xì)辛的作用機(jī)理。Bcl-2 家族是線粒體凋亡途徑中的重要調(diào)節(jié)因素，其中，Bcl-2 屬于抗凋亡基因，Bax 屬于促凋亡基因，通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，燈盞細(xì)辛誘導(dǎo)了OCM-1 細(xì)胞Bax 蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2 蛋白表達(dá)下調(diào)。

綜上所述，燈盞細(xì)辛通過改變線粒體凋亡途徑中凋亡相關(guān)信號分子Bax 及Bcl-2 的表達(dá)，濃度依賴性的抑制了OCM-1 細(xì)胞的生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，有望成為臨床上治療CM 的有效藥物。