菊花-麥冬治療干眼的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

張文晶，頡瑞萍，張花治，王永濤，于華楠，袁曉彤，張子怡

干眼又稱角膜干燥癥，是常見的眼表疾病.其主要的病理機(jī)制是指淚液的量或質(zhì)以及流體動(dòng)力學(xué)異常造成淚膜穩(wěn)定性降低、眼表損害，導(dǎo)致角膜和結(jié)膜上皮的正常功能遭到破壞[1]。以眼部干澀、疼痛、發(fā)癢、畏光及異物感為主要臨床表現(xiàn)，并伴隨視疲勞、視物模糊等癥狀，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致角結(jié)膜干燥、炎癥、潰瘍一系列病變，嚴(yán)重影響患者的日常生活和工作質(zhì)量。近年來，隨著科技水平的不斷提升，電腦、手機(jī)等智能設(shè)備的普及，長時(shí)間面對電子屏幕、用眼不當(dāng)使干眼的發(fā)病率逐年上升且呈現(xiàn)出年輕化趨勢。流行病學(xué)研究[2]顯示，我國干眼的發(fā)病率為21%～30%，患病率約為6.1%～52.4%。中醫(yī)藥在干眼的治療中基于整體觀念，辨證施治、據(jù)法選方、合理配伍，具有療效確切、安全性高、價(jià)格低廉的特色優(yōu)勢，在臨床上受到了廣大患者的認(rèn)可，但其具體的分子學(xué)機(jī)制尚不明確。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新起的學(xué)科，可通過軟件操作技術(shù)構(gòu)建出“藥物-疾病-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而深入分析藥物治療疾病相關(guān)的基因蛋白、信號(hào)通路，揭示中藥及復(fù)方對機(jī)體整體調(diào)控的本質(zhì)，為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究提供全新視角[3]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討菊花-麥冬藥對治療干眼的分子學(xué)機(jī)制和可能的生物學(xué)效應(yīng)，以期為進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究提供方向，為新藥的開發(fā)構(gòu)建理論基礎(chǔ)，拓寬干眼的中醫(yī)藥防治思路。

1 資料與方法

1.1 菊花-麥冬活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測

本研究以“Score cutoff≥40，P＜0.05”作為篩選參數(shù)，在BATMAN-TCM 中藥生物信息數(shù)據(jù)庫輸入復(fù)方成分中藥英文拼音：ju hua 和mai dong，進(jìn)行菊花、麥冬的入血活性成分及潛在作用靶點(diǎn)檢索。

1.2 獲取OP 疾病靶點(diǎn)

將“Xerophthalmia”作為關(guān)鍵詞輸入至OMIM 和GeneCards 在線數(shù)據(jù)庫中，遴選出干眼相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

1.3 藥對-疾病靶基因交集

整理表格數(shù)據(jù)后，使用Venny2.1.0 在線工具對獲取的菊花-麥冬有效活性成分作用靶點(diǎn)和干眼疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集靶基因構(gòu)建，并繪制出Venny 圖。使用Cytoscape 3.7.2 軟件對獲取的共同靶點(diǎn)進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建“疾病-藥對-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并計(jì)算相應(yīng)的關(guān)系節(jié)點(diǎn)。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用String 軟件構(gòu)建共同靶基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，以interaction score≥0.4 為篩選條件，剔除斷開連接的節(jié)點(diǎn)，得到蛋白的相互作用關(guān)系，使用R 軟件繪制互作網(wǎng)絡(luò)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目條形圖，鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目越多，說明該基因位于蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心，對整個(gè)網(wǎng)絡(luò)起的作用最關(guān)鍵。

1.5 GO 功能富集分析

使用clusterProfiler R 軟件包對共同靶基因進(jìn)行GO 功能富集分析（P value Cutoff＜0.05,Q value Cutoff＜0.05），預(yù)測菊花-麥冬治療干眼核心基因參與調(diào)控的生物學(xué)過程。

1.6 共同靶基因KEGG 功能富集分析

對復(fù)方-疾病的交集靶基因通過clusterProfiler R 軟件（P value Cutoff＜0.05,Q value Cutoff＜0.05），進(jìn)行計(jì)算，獲取與治療干眼相關(guān)的信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 菊花-麥冬活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

在BATMAN-TCM 中藥生物信息數(shù)據(jù)庫上檢索到菊花-麥冬入血活性成分46 個(gè)，預(yù)測靶點(diǎn)291 個(gè)（表1）。

表1 菊花-麥冬有效活性成分

2.2 疾病靶點(diǎn)獲取結(jié)果

在OMIM 和GeneCards 遺傳基因數(shù)據(jù)庫中輸入“Xerophthalmia”進(jìn)行檢索，篩選出干眼相關(guān)的疾病靶點(diǎn)9661 個(gè)。

2.3 共同靶基因交集結(jié)果

將篩選出的291 個(gè)菊花-麥冬作用靶點(diǎn)與疾病有關(guān)的9661 個(gè)靶標(biāo)整理后使用VennDiagram.R 軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲取共同靶基因173 個(gè)，并構(gòu)建交集靶基因Venny 圖（圖1）。將獲得的173 個(gè)共同靶基因與菊花-麥冬的46 個(gè)有效活性成分使用Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建出“疾病-藥對-化合物-靶標(biāo)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共整理出927 對關(guān)系數(shù)據(jù)和221 個(gè)關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)。圖中紅色六邊代表干眼癥，藍(lán)色四邊形代表中藥藥對，黃色三角形代表化合物，綠色圓形代表靶點(diǎn)，數(shù)據(jù)結(jié)果表明，菊花-麥冬可能主要通過這43 個(gè)化合物作用于共同靶基因而對干眼癥產(chǎn)生相應(yīng)的影響（圖2）。

圖1 “菊花-麥冬”與 干眼癥共同靶基因Venny 圖

圖2 干眼-藥對-化合物-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

使用String 軟件交集靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，得到171 個(gè)靶蛋白的相互作用關(guān)系（圖3）。將所得數(shù)據(jù)輸入R 語言軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目條形圖，結(jié)果表明，CAT、TNF、CREB1、ESR1、COMT、ADK、NT5C2、NT5E、AR、PTGS2、NR3C1、ADCY1、DCK、F2、OAT、ADA、ENPP1、DNMT1、PPIG、TYMS、ATM、LRAT、CYP19A1、DRD2、AMPD3、IMPDH1、OTC、RBP1、ADH1A 的鄰接數(shù)目分別為33、28、27、25、23、22、22、22、21、21、20、19、19、19、19、18、18、17、17、17、16、16、15、15、14、14、14、14、13，由圖4可以看出CAT、TNF、CREB1、ESR1、COMT、ADK、NT5C2、NT5E、AR、PTGS2 的網(wǎng)絡(luò)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目均大于20，位于網(wǎng)絡(luò)最核心。

圖3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)互作網(wǎng)絡(luò)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目條形圖

2.5 GO 功能富集分析結(jié)果

利用clusterProfiler R 包對173 個(gè)共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO 富集分析，涉及功能156 個(gè)，包括輔因子結(jié)合、維生素結(jié)合、氧化還原酶活性，3′，5′-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性、輔酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、羧酸結(jié)合、有機(jī)酸結(jié)合、3′，5′-環(huán)-GMP 磷酸二酯酶活性、醇脫氫酶（NADP+）活性、離子門控通道活性、離子通道活性、醛酮還原酶（NADP）活性、門控通道活動(dòng)、視黃醇脫氫酶活性、底物特異性通道活性、電子轉(zhuǎn)移活性、磷酸二酯水解酶活性等（圖5、6）。

圖5 GO 富集top20 結(jié)果柱狀圖

2.6 KEGG 通路富集分析結(jié)果

使用clusterProfiler R 包對173 個(gè)共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG 功能富集分析，結(jié)果顯示菊花-麥冬治療干眼涉及的信號(hào)通路有64 條，包括嘌呤代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、視黃醇代謝、嘧啶代謝、嗎啡成癮、皮質(zhì)醇合成與分泌、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）、酪氨酸代謝、甲狀腺激素合成、TRP 通道炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)、長壽調(diào)節(jié)途徑、脂肪酸降解、胰高血糖素、雌激素、糖酵解/糖異生、血清素能突觸、cGMP-PKG、氨基酸生物合成、DNA 復(fù)制等信號(hào)通路，（圖7、8）。

圖6 GO 富集結(jié)果top20 氣泡圖

圖7 富集結(jié)果top20 柱狀圖

結(jié)果顯示，菊花-麥冬可能主要通過視黃醇代謝信號(hào)通路、嘌呤代謝信號(hào)通路、精氨酸和脯氨酸代謝信號(hào)通路、嘧啶代謝信號(hào)通路、嗎啡成癮信號(hào)通路、皮質(zhì)醇合成與分泌信號(hào)通路、非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）信號(hào)通路、酪氨酸代謝信號(hào)通路、甲狀腺激素合成信號(hào)通路、TRP 通道炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)信號(hào)通路而發(fā)揮治療干眼癥的作用。

3 討論

圖8 KEGG 富集top20 點(diǎn)圖

根據(jù)古典醫(yī)籍記載，干眼屬于中醫(yī)學(xué)“白澀癥”“燥證”“枯癥”等范疇[4]。《審視瑤函·內(nèi)外二障》[5]曰：“眼乃五臟六腑之精華，上注于目”，可見視覺功能的正常發(fā)揮依賴于臟腑精氣的濡潤滋養(yǎng)。若氣血虧虛、津液損耗、陰精虧損不能上榮于目，則見眼部干澀、燒灼、疼痛或視物模糊，如《素問玄機(jī)原病式·六氣主病》[6]所言：“諸澀枯涸，干勁揭皴，皆屬于燥”，故養(yǎng)陰潤燥是中醫(yī)治療干眼的基本原則[7]。菊花-麥冬是臨床最常使用藥對，菊花性寒入肝經(jīng)以疏風(fēng)散熱、明目清肝；麥冬味甘性微寒能滋陰潤肺，益胃生津，二者配伍以養(yǎng)陰潤目為本，兼清虛火，以收標(biāo)本同治之效。智亞偉等人[8]對國內(nèi)治療干眼27 個(gè)經(jīng)驗(yàn)方進(jìn)行了分析，涉及中藥78 味，使用頻率最多的藥物依次是菊花、枸杞子、生地、麥冬。文瑾等人[9]基于數(shù)據(jù)挖掘?qū)?5 首方劑、164 味中藥進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)頻次較高的藥物有甘草、枸杞子、熟地黃、麥冬、菊花。白雪等[10]人運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對近10 年文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫中收錄的149 首方子進(jìn)行了用藥規(guī)律的分析，發(fā)現(xiàn)使用頻數(shù)較高的藥物排序依次是菊花、麥冬、枸杞子。數(shù)據(jù)挖掘的研究結(jié)果表明具有滋陰潤燥、養(yǎng)血明目作用的中藥是治療干眼的首選，菊花和麥冬也是最常選用的藥對，但是中藥活性成分多樣，作用機(jī)制復(fù)雜，傳統(tǒng)單一的研究方法不能充分闡釋中藥及復(fù)方治療干眼癥的分子學(xué)途徑。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對菊花-麥冬治療干眼的作用機(jī)制進(jìn)行了分子學(xué)角度的闡釋。在BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫中篩選到“菊花-麥冬”的入血活性成分有46 個(gè)，包括麥冬素A、菊花三醇、石竹烯、水蘇堿、鳥苷、乙酸龍腦等。其中水蘇堿在降低血管阻力、改善血液流速方面的作用已經(jīng)明確，劉保松等人[11]研究證實(shí)水蘇堿能夠減輕小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，其作用機(jī)制與改善腦部微循環(huán)、抑制細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。吳曉松等人[12]研究發(fā)現(xiàn)，乙酸龍腦酯從一定程度上可以提高小鼠的疼痛耐受能力，具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用。菊花-麥冬治療干眼涉及的核心基因包括有CAT、TNF、CREB1、ESR1、COMT、ADK、NT5C2、NT5E、AR、PTGS2，以上基因靶點(diǎn)可能通過對機(jī)體部分酶、離子通道、底物特異性通道、電子轉(zhuǎn)移等活性的影響，以及調(diào)節(jié)因子、維生素、輔酶、類固醇、羧酸、有機(jī)酸等的結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。KEGG 結(jié)果表明“菊花-麥冬”藥對治療干眼涉及的信號(hào)通路有64 條，主要包括視黃醇代謝信號(hào)通路、嘌呤代謝信號(hào)通路、精氨酸和脯氨酸代謝信號(hào)通路、嘧啶代謝信號(hào)通路、嗎啡成癮信號(hào)通路、皮質(zhì)醇合成與分泌信號(hào)通路、非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）信號(hào)通路、酪氨酸代謝信號(hào)通路、甲狀腺激素合成信號(hào)通路、TRP 通道炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)信號(hào)通路。目前在干眼相關(guān)信號(hào)通路方面的研究較少，主要是是圍繞MAPK信號(hào)通路、TLR4 通路、TLR2/NF-κB 炎癥通路展開。楊青霞等人[13]研究發(fā)現(xiàn)，抗抑郁藥氟西汀導(dǎo)致干眼的病理機(jī)制與激活TLR2/NF-κB 信號(hào)通路，導(dǎo)致炎性因子呈高表達(dá)水平有關(guān)。MAPK 信號(hào)通路在干眼的發(fā)生過程中有著重要作用，肖位保[14]對二者之間的關(guān)系進(jìn)行了總結(jié)，MAPK 信號(hào)通路主要通過對機(jī)體炎性水平的調(diào)控而影響干眼的發(fā)病，因此阻斷MAPK 信號(hào)通路可以改善患者臨床癥狀。

綜上所述，菊花-麥冬藥對治療干眼具有多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)、多途徑的調(diào)控作用，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對其具體的分子學(xué)機(jī)制進(jìn)行了揭示，科學(xué)闡釋了中醫(yī)學(xué)整體觀念與辨證論治的診療特點(diǎn)。但是KEGG 富集分析顯示的眾多信號(hào)通路目前還未研究，這也是今后進(jìn)一步科研的方向與突破口。