芍藥甘草湯對多囊卵巢綜合征大鼠整體代謝及腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用

鄧貴鳳，劉俊瑾，常壯鵬，邵云云，許 丁，侯銳鋼*

0 引言

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是臨床常見的婦科疾病，主要臨床特征為高雄激素血癥、無排卵或稀發(fā)排卵，具體表現(xiàn)為月經(jīng)周期紊亂、高血糖、肥胖甚至不孕。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚未完全明確，臨床上多以對癥治療為主，效果不佳且不良反應(yīng)較多。中醫(yī)學(xué)將PCOS歸結(jié)于“閉經(jīng)”、“不孕”、“崩漏”等范疇，認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要與腎虛脾弱、痰瘀氣塞有關(guān)。芍藥甘草湯(Shaoyao-Gancao Decoction,SGD)是出自《傷寒論》的著名方劑，由芍藥和甘草兩味草藥組成，是治療PCOS的經(jīng)典名方之一，兩者合用既可理氣健脾、滋陰養(yǎng)肝，又可緩急止痛、活血化瘀[1]，與PCOS的病機(jī)甚為吻合。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已初步證實(shí)SGD可有效改善PCOS大鼠的癥狀[2]，但其作用機(jī)制尚不明確，影響了其在臨床上的應(yīng)用與推廣。

近年來，代謝組學(xué)通過反映機(jī)體整體代謝變化被廣泛用于研究藥物干預(yù)或疾病條件下機(jī)體的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制，同時(shí)為中藥的多靶點(diǎn)作用機(jī)制研究提供新的方法。腸道菌群具有維持機(jī)體代謝、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡等多種功能，常被用于糖尿病、肥胖癥、心血管疾病及PCOS等代謝性疾病的研究與治療。研究發(fā)現(xiàn),多種中藥復(fù)方可通過重塑腸道菌群發(fā)揮藥效，如瀉心湯作為治療2型糖尿病的經(jīng)典名方，其主要是通過調(diào)整產(chǎn)飽和脂肪酸及炎癥的菌群，重塑腸道菌群而發(fā)揮作用。PCOS疾病狀態(tài)下腸道微生物的組成會發(fā)生變化[3-6]。同時(shí),有文獻(xiàn)報(bào)道,PCOS患者血漿中二甲胺水平升高，膽堿水平降低，二甲胺作為腸道菌群代謝膽堿的產(chǎn)物[7]，提示PCOS患者的腸道菌群活性增加，進(jìn)一步揭示了腸道菌群參與PCOS發(fā)病機(jī)制的可能性。

本實(shí)驗(yàn)旨在利用代謝組學(xué)和腸道微生物組學(xué)方法,研究SGD對PCOS大鼠內(nèi)源性代謝產(chǎn)物及腸道菌群的影響，進(jìn)一步為臨床治療PCOS提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器 超高效液相色譜儀(日本島津公司)，四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀Q-TOF(美國AB Sciex公司)，Kinetex XB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)，DZF-6050型真空干燥箱(蘇州江東精密儀器公司)，Illumina MiSeq PE300(Illumina MiSeq，USA)，臺式離心機(jī)(Thermo Fisher)，Qubit?3.0熒光計(jì)(Invitrogen)，PCR儀(BIO-RAD，T100TM Thermal Cyeler)。

1.2 藥物與試劑 白芍飲片(安徽精誠本草中藥飲片有限公司)和甘草飲片(國藥樂仁堂河北藥業(yè)有限公司)經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部張京平中藥師鑒定，來曲唑片(國藥準(zhǔn)字H19991001，2.5 mg/片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，炔雌醇環(huán)丙孕酮片(達(dá)英-35，國藥準(zhǔn)字J20140114，每片含醋酸環(huán)丙孕酮2 mg和炔雌醇0.035 mg，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司)；甲醇和乙腈(色譜級，美國Fisher公司)，睪酮標(biāo)準(zhǔn)品(批號#K1716031，純度≥98%，aladdin)，基因組DNA提取試劑盒(M5635-02，美國Omega Bio-Tek公司)，DNA檢測試劑盒(Q10212，美國Life公司)，2×Taq Master Mix(P111-03，南京諾唯贊生物科技有限公司)，DNA純化試劑盒(EC401-03，法國Transgen公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雌性SD大鼠，體重180～220 g，購自中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號SCXK(京)2014-0013。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批通過，批準(zhǔn)編號2015KS001。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 芍藥甘草湯的制備 中藥復(fù)方芍藥甘草湯由白芍和甘草按1∶1比例研碎混勻，加入10倍量的水浸泡1 h后煎煮3次(每次1 h)，趁熱過濾，合并3次濾液并將其濃縮制成生藥質(zhì)量濃度為4.24 g/ml的濃縮液。

1.4.2 動物分組及給藥 24只大鼠飼養(yǎng)于12 h光照與12 h黑暗交替的環(huán)境，溫度(25± 2)℃，自由飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體重隨機(jī)分為正常組、模型組(PCOS組)、芍藥甘草湯組(SGD組)和陽性對照達(dá)英-35組(Diane-35組)，每組6只。按照課題組已經(jīng)成熟的造模方法[2]，對各組大鼠進(jìn)行處理，造模開始后對各組大鼠進(jìn)行陰道涂片觀察動情周期變化，動情周期紊亂表明造模成功，之后進(jìn)行連續(xù)2周的藥物干預(yù)。本課題組前期采用SGD低、中、高劑量[12.5、25、50 g/(kg·d)]干預(yù)PCOS大鼠后，發(fā)現(xiàn)高劑量組療效最為顯著[2]，故本實(shí)驗(yàn)SGD組給予50 g/(kg·d)灌胃治療，達(dá)英-35組每日給予達(dá)英-35[0.203 5 mg/(kg·d)]灌胃給藥，正常組與PCOS組給予等量生理鹽水。每天稱量1次大鼠體重。

1.4.3 陰道涂片 用浸泡在0.9%氯化鈉注射液中的無菌棉簽在陰道側(cè)壁上1/3處輕刮黏液及細(xì)胞，將其薄而均勻地涂在載玻片上，用甲醇固定3 min，并用姬姆薩染液染色30 min，用蒸餾水緩慢沖洗干凈，晾干后鏡檢。

1.4.4 卵巢形態(tài)學(xué)觀察 取大鼠兩側(cè)卵巢，稱重后左側(cè)卵巢用4%甲醛溶液固定，依次使用乙醇(70%、80%、90%、95%)、二甲苯常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，采用HE染色，光鏡下觀察大鼠卵巢形態(tài)學(xué)變化。

1.4.5 睪酮(T)水平的測定 采用UHPLC-MS/MS技術(shù)對大鼠血漿T水平進(jìn)行檢測。色譜條件：含0.1%甲酸的蒸餾水(A)∶乙腈(B)=50%為流動相進(jìn)行等度洗脫，柱溫40 ℃，流速0.3 ml/min，進(jìn)樣量5 μl。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)正離子模式，氣簾氣40 psi，噴霧氣50 psi，輔助氣50 psi，離子源溫度500 ℃。

1.4.6 內(nèi)源性代謝產(chǎn)物檢測條件 色譜條件:流動性水(A)和甲醇(B)梯度洗脫(0～2 min，5% B；2～8 min，5%～15% B；8～13 min，15% B；13～17 min，15%～30% B；17～22 min，30% B；22～26 min，30%～95% B；26～28 min，95% B；28～28.2 min，95%～5% B；28.2～30 min，5% B)，其他條件同“1.4.5”色譜項(xiàng)下。質(zhì)譜條件:采用ESI+/ESI-模式，其他條件同“1.4.5”質(zhì)譜項(xiàng)下。

1.4.7 生物樣品的收集與處理 ①血漿樣本的收集與處理:取大鼠腹主動脈血，4 000 r/min離心10 min得到血漿樣本，取100 μl血漿，加入300 μl甲醇渦旋離心取上清，將上清真空干燥，加入100 μl初始流動相復(fù)溶，再經(jīng)渦旋離心后取上清待測。②糞便樣品的收集與處理:末次給藥24 h后，收集大鼠新鮮糞便，置于2 ml無菌干燥的凍存管中，液氮速凍后放入-80 ℃冰箱中，隨后將大鼠糞便放入干冰中送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行細(xì)菌V3-V4區(qū)的16S rDNA基因測序。預(yù)處理后的糞便樣本采用基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，采用瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列：341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)，805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)。對得到的PCR引物進(jìn)行DNA純化回收后,采用DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，按照1∶1的等量混合后上機(jī)測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理 腸道菌群按97%的一致性將序列聚類成OTUs，通過LEfSe軟件對腸道菌群進(jìn)行差異分析，篩選P<0.05，LDA>4的菌落進(jìn)行展示和比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件,組間差異采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SGD對PCOS大鼠藥效學(xué)的影響

2.1.1 SGD對PCOS大鼠體重及卵巢重量的影響 與正常組相比，PCOS大鼠體重和卵巢重量顯著增加。經(jīng)SGD干預(yù)2周后,大鼠體重和卵巢重量明顯下降，與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)。

圖1 SGD對PCOS大鼠體重(A)及卵巢重量(B)的影響

2.1.2 SGD對PCOS大鼠動情周期的影響 正常組有4～5 d的規(guī)律動情周期，與正常組相比，PCOS大鼠動情周期出現(xiàn)不同程度的紊亂(多處于動情間期)，經(jīng)SGD干預(yù)后，動情周期重新呈現(xiàn)4～5 d的規(guī)律變化。

2.1.3 SGD對PCOS大鼠卵巢形態(tài)學(xué)改變的影響 鏡下觀察到正常組有多個(gè)黃體及不同發(fā)育階段的卵泡，卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，顆粒細(xì)胞排列整齊。與正常組相比，PCOS大鼠卵巢囊性擴(kuò)張卵泡增多，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，黃體及卵母細(xì)胞明顯減少。SGD干預(yù)后,黃體及各級卵泡數(shù)增多，顆粒細(xì)胞層數(shù)增多(如圖2)。

圖2 SGD對PCOS大鼠卵巢形態(tài)學(xué)改變的影響(HE，100×)

2.1.4 SGD對PCOS大鼠睪酮(T)水平的影響 與正常組相比，PCOS大鼠血漿中T水平顯著升高。SGD干預(yù)后T水平明顯下降，與正常組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(如圖3)。

圖3 SGD對PCOS大鼠T水平的影響

2.2 SGD對PCOS大鼠血漿差異代謝產(chǎn)物的影響 采用UHPLC-MS/MS方法對大鼠血漿內(nèi)源性代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，通過正交偏最小二乘方-判別分析(OPLS-DA)(VIP>1)與t檢驗(yàn)(P<0.05)篩選出差異代謝產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，PCOS大鼠血漿中存在37種差異代謝產(chǎn)物(見表1)，SGD干預(yù)后，其中10種代謝產(chǎn)物變化發(fā)生逆轉(zhuǎn)，其中亮氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、脯氨酸、尿酸、腺苷含量顯著升高，乙酰肉堿、月桂酸、棕櫚酸和亞油酸含量明顯降低。對所有差異代謝物進(jìn)行熱圖聚類分析(見圖4A)，發(fā)現(xiàn)SGD對PCOS疾病狀態(tài)下引起的差異代謝產(chǎn)物均有一定水平的回調(diào)。經(jīng)MetaboAnalyst通路富集分析，SGD干預(yù)主要涉及亞油酸代謝與丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝通路(見圖4B)。

表1 正常組與PCOS組血漿中的37個(gè)差異代謝產(chǎn)物

圖4 分析SGD對PCOS大鼠血漿差異代謝的影響

2.3 SGD對PCOS大鼠腸道菌群多樣性和豐度的影響

2.3.1 菌群多樣性分析 在97%的相似水平下進(jìn)行OTU分析，計(jì)算不同組大鼠腸道菌群的α多樣性指數(shù)，見表2，ACE是估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，Shannon和Simpson指數(shù)用來評估樣品中微生物的多樣性，Shannon指數(shù)越大，群落多樣性越高；Simpson指數(shù)越大，群落多樣性越低。PCOS組腸道菌群多樣性較正常組和SGD組多樣性顯著降低。

表2 各組樣品菌群多樣性指數(shù)(n=6)

2.3.2 LEfSe菌群差異分析 如圖5所示：A圖為線性判別(LDA)分析，將不同組中有顯著差異(P<0.05，LDA>4)的物種以柱狀圖的形式展示，柱狀圖的長度代表了差異物種的影響程度。B圖將差異以進(jìn)化分支圖的形式展示，從內(nèi)至外輻射的圓圈代表從門到屬的分類級別。由圖可知，乳酸桿菌科和Odoribacter屬為PCOS組的優(yōu)勢菌群，值得注意的是，在其他類似的代謝性疾病中也有同樣的發(fā)現(xiàn)[8-9]，提示PCOS大鼠腸道菌群紊亂，而這些菌群在SGD組和正常組中表達(dá)較低。

圖5 通過線性判別分析(A)和進(jìn)化分支圖(B)對各組差異菌群進(jìn)行分析

2.3.3 各組間菌群組成分析 見圖6、表3。

圖6 SGD分別在門(A)和屬(B)水平下對PCOS菌群豐度的調(diào)節(jié)

表3 SGD對PCOS大鼠主要差異菌群相對豐度的影響

結(jié)果顯示，相比于正常組，PCOS組在門水平上，厚壁菌門的相對豐度升高，擬桿菌門的相對豐度降低，厚壁菌門與擬桿菌門的比值(Firmicutes/Bacteroidetes，F(xiàn)/B)顯著升高。SGD干預(yù)后，厚壁菌門的相對豐度下降，擬桿菌門的相對豐度增加，F(xiàn)/B顯著降低。在屬水平上，與正常組相比，PCOS大鼠乳酸桿菌的相對豐度升高。SGD給藥后，乳酸桿菌的相對豐度降低。

3 討論

來曲唑灌胃誘導(dǎo)PCOS大鼠模型是一種成熟的造模方法。本研究結(jié)果表明，與正常組相比，經(jīng)來曲唑造模給藥3周后，大鼠體重、卵巢重量及T水平顯著升高，動情周期呈現(xiàn)不同程度的紊亂，與臨床PCOS患者表現(xiàn)一致[10]。卵巢形態(tài)學(xué)顯示，PCOS大鼠卵巢囊性擴(kuò)張卵泡增多，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，黃體及卵母細(xì)胞減少，表明PCOS大鼠造模成功。而SGD干預(yù)后，大鼠體重、卵巢重量、血漿T水平明顯降低，動情周期重新恢復(fù)規(guī)律，卵巢形態(tài)恢復(fù)正常，提示SGD對PCOS具有顯著的干預(yù)作用。然而目前對SGD干預(yù)PCOS的作用機(jī)制研究仍處于初級階段，其作用靶點(diǎn)仍不清楚，且SGD作為中藥復(fù)方，成分復(fù)雜，單一指標(biāo)闡明其作用機(jī)制存在局限性和主觀性。代謝組學(xué)思路具有整體性與客觀性的優(yōu)勢，可從整體的角度出發(fā)尋找干預(yù)因素所導(dǎo)致的差異信號，通過認(rèn)識體液“代謝物指紋圖譜”的變化，闡明藥物的作用機(jī)制，非常適合化學(xué)成分尚不明確的中藥復(fù)方作用機(jī)制的研究。

本研究采用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)與PCOS模型相關(guān)的37種差異代謝物，而SGD可以回調(diào)其中的10種代謝產(chǎn)物，其中亮氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、脯氨酸、尿酸、腺苷含量顯著升高，乙酰肉堿、月桂酸、棕櫚酸和亞油酸含量明顯降低，主要涉及亞油酸代謝與丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝2條通路。有報(bào)道，不飽和脂肪酸亞油酸的攝入會引發(fā)炎癥，升高白介素-6、腫瘤壞死因子-α等促炎因子的表達(dá)[11-12]；而丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝能夠改善機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能[13]，其中該通路中谷氨酰胺的攝入能夠通過降低炎癥因子水平抑制炎癥反應(yīng)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性低度炎癥在PCOS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，SGD能夠通過抑制炎癥治療PCOS[2,15]。因此，通過對PCOS大鼠血漿差異代謝物的分析，SGD可能通過降低亞油酸代謝通路中亞油酸水平，同時(shí)升高丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝通路中谷氨酰胺水平調(diào)節(jié)炎癥，從而改善PCOS大鼠炎癥癥狀。

近年來，隨著腸道菌群在代謝性疾病中的作用被逐漸挖掘，臨床上，重塑腸道菌群已成為一種新的治療策略。研究證實(shí)，在PCOS患者中腸道菌群多樣性降低，且腸道菌群可影響性激素的生成[3-4]，這些研究為本項(xiàng)目提供了可借鑒的研究思路。但SGD是否通過調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮作用尚不明確，因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究了腸道菌群在SGD療效中的作用。人體腸道菌群在門水平上主要由厚壁菌門與擬桿菌門組成，F(xiàn)/B常被認(rèn)為是評價(jià)健康狀態(tài)的重要指標(biāo)，F(xiàn)/B值與脂質(zhì)代謝、肥胖、胰島素抵抗等臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，在多種代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[16-19]。PCOS患者多伴有肥胖和胰島素抵抗癥狀，本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS大鼠腸道F/B值異常增高，而SGD可降低該比值，故推測SGD可能通過降低F/B值改善PCOS大鼠肥胖和胰島素抵抗癥狀。此外，在屬水平上，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PCOS大鼠腸道乳酸桿菌和Odoribacter菌水平較高，而SGD干預(yù)后顯著降低。其中Odoribacter菌是產(chǎn)乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸的主要菌群[20-21]，短鏈脂肪酸與受體FFA2、FFA3結(jié)合后，可顯著抑制胰島素的分泌[22]，引起高血糖；而乳酸桿菌在肥胖患者腸道中高表達(dá)[23]?？梢?，腸道菌群在SGD干預(yù)PCOS中發(fā)揮重要作用，SGD在臨床上對PCOS的治療作用可能與調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂有關(guān)，其主要通過降低腸道中異常增高的F/B值、乳酸桿菌和Odoribacter菌水平改善PCOS相關(guān)癥狀。

綜上所述，PCOS大鼠體內(nèi)存在37種內(nèi)源性差異代謝產(chǎn)物，腸道菌群紊亂，SGD能夠有效改善PCOS的疾病癥狀，調(diào)節(jié)PCOS大鼠血漿中10種內(nèi)源性差異代謝物，主要涉及亞油酸代謝與丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝2條通路。推測SGD可能是通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性代謝物及改善PCOS腸道菌群紊亂發(fā)揮治療PCOS的作用。